发明创造名称：使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法
外观设计名称：
决定号：185241
决定日：2019-07-29
委内编号：1F244479
优先权日：2010-09-10
申请（专利）号：201180043353.4
申请日：2011-09-09
复审请求人：美迪恩斯生命科技株式会社
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王莉
合议组组长：彭郁葱
参审员：张丽颖
国际分类号：C12N15/09,C12M1/00,C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的技术启示，则该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201180043353.4，名称为“使用光的核酸的扩增抑制方法和高灵敏度的选择性核酸扩增方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为美迪恩斯生命科技株式会社，申请日为2011年09月09日，优先权日为2010年09月10日，公开日为2013年05月01日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年10月30日以权利要求1-14不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为2013年03月08日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-22页、说明书附图第1-4页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-3页以及2017年05月04日提交的权利要求第1-14项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
上述包含光连接性核酸类的发夹探针通过包括下述步骤在制备用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物进行核酸扩增反应，选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
2. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
上述包含光连接性核酸类的发夹探针通过包括下述步骤在制备用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：在选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区的核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)；
步骤(d)：分析上述扩增产物。
3. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述核酸扩增法为PCR法。
4. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述核酸扩增法为实时PCR法。
5. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列。
6. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述发夹探针的链长为7～30。
7. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述光照射通过350～380nm范围的波长来进行。
8. 权利要求1或2所述的应用，其中，上述光照射通过赋予了350～380nm范围的波长的光照射功能的核酸扩增装置来进行。
9. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
该核酸扩增装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，
该核酸扩增装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物进行核酸扩增反应，选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区。
10. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
该核酸扩增装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，
该核酸扩增装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：在选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区的核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)。
11. 权利要求9或10所述的应用，其中，上述核酸扩增法为PCR法。
12. 权利要求9或10所述的应用，其中，上述核酸扩增法为实时PCR法。
13. 权利要求9或10所述的应用，其中，上述发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列。
14. 权利要求9或10所述的应用，其中，上述发夹探针的链长为7～30。”
驳回决定指出：权利要求1请求保护的技术方案和对比文件3（WO2005/072133A2，公开日为2005年08月11日）公开的内容相比，其区别在于：①权利要求1限定将包含光连接性核酸类的发夹探针用于制备检测用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂突变型核酸检测试剂盒，并对所述试剂盒进行了进一步限定；②权利要求1限定的发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置；③权利要求1限定制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的恶性肿瘤的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒。对于区别①，由于对比文件3公开了采用所述核酸探针用于检测目标核酸，因此，将所述探针用于制备成为试剂盒是本领域技术人员容易想到的，并且，对比文件3进一步公开了检测的目标核苷酸可以是SNP位点，而核苷酸中的SNP位点可以看做是在野生型的核酸中微量混杂的突变型的核酸，对比文件3中公开了在使用PCR检测的过程中使用引物，因此，将引物作为试剂盒的成分是本领域技术人员容易想到的；对于区别②，由于DNA双链是互补的，因此，检测时选择针对正义链和/或反义链探针属于本领域的公知常识，而将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置属于实际操作中的常规选择，因为基于光连接的原理可知，当光连接性核酸类位于光连接的位置时，将会影响到探针分子与靶分子的结合的程度，因此，在对比文件3公开了光连接核酸探针的情况下，本领域技术人员在实际操作中容易想到将光连接性核酸导入探针不进行光连接的位置。对于区别③，根据该检测方法选择不同的样本如肿瘤样本是本领域技术人员容易想到的。因此权利要求1不具备创造性。基于相同理由，权利要求2-3也不具备创造性。从属权利要求3-8的附加技术特征或被对比文件3公开或是本领域经常采用的或是本领域技术人员容易实现的，因此，也不具备创造性。权利要求9请求保护包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，与权利要求1的区别在于：两者检测核酸的装置不同。然而由于对比文件3中已经公开了采用UV照射使得探针与靶标分子交联，而UV的波长范围在100-400纳米，其中长波紫外线的波长范围在315-400纳米，采用权利要求9述及的波长范围仅是一种常规的选择，并且将光照功能设置在核酸扩增装置中是本领域技术人员容易实现的，也有利于反应的进行。因此权利要求9不具备创造性。基于相同理由，权利要求10-14也不具备创造性。
申请人美迪恩斯生命科技株式会社（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年02月08日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共3页14项），相对于驳回决定针对的文本，其修改在于，将原权利要求1、2、9、10中的光连接性核酸类进一步限定为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。复审请求人认为：1）发明人发现：通过使用光连接性发夹探针，在形成完全的杂交体时特异性地进行光连接，从而可以阻止靶分子在核酸扩增反应中作为模板的作用。由此，可以兼具野生型核酸的高聚集(抑制)效果和突变型核酸的选择性(特异性)核酸扩增。步骤(a)中使用针对有义链和反义链的发夹探针，将特定的光应答性核酸即3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷导入到彼此的发夹探针之间不发生光连接的位置进行制备。步骤(b)中的光连接通过设置普通的互补链彼此之间结合和解离的温度循环，并在互补链彼此之间可以结合的温度下反复进行光照射，可以蓄积与发夹探针交联(连接)的互补链的野生型核酸分子，增强野生型核酸的核酸扩增抑制效果；2）对比文件3虽然公开了使用光连接反应进行特异性的连接原理，但由于UV交联的效率低，因此优选使用经过改良的交联剂。即，在对比文件3中，关于为了使用UV交联的效率增高的交联剂等，则没有记载也没有暗示；3）对比文件3公开了用于检测来自肿瘤患者的血清的可检测DNA，且用于诊断肿瘤，而关于检测样品核酸中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，则没有记载也没有暗示。
复审请求时新修改的权利要求1、2、9、10如下：
“1. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
上述包含光连接性核酸类的发夹探针通过包括下述步骤在制备用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物进行核酸扩增反应，选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区；
步骤(d)：分析上述扩增产物，
上述光连接性核酸类为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。
2. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
上述包含光连接性核酸类的发夹探针通过包括下述步骤在制备用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：在选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区的核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)；
步骤(d)：分析上述扩增产物，
上述光连接性核酸类为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。”
“9. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
该核酸扩增装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，
该核酸扩增装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物进行核酸扩增反应，选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区，
上述光连接性核酸类为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。
10. 包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
该核酸扩增装置具有350～380nm范围的波长的光照射功能，用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，
该核酸扩增装置包括下述步骤：
步骤(a)：使发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的核酸分子特异性地形成杂交体，所述发夹探针包含具有与靶位点互补的序列的光连接性核酸类；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：在选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区的核酸扩增反应中进行上述步骤(a)、(b)，
上述光连接性核酸类为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1请求保护的技术方案和对比文件3公开的内容相比，其区别主要在于：1）两者使用的探针和检测的对象不同，权利要求1使用双链发夹探针检测突变型核酸，而对比文件3公开的是单探针检测核酸含量微小差异的方法；2）权利要求1限定了将探针和引物制备成试剂盒，并进一步限定检测的突变为恶性肿瘤的突变、光连接性核酸类导入探针的位置与光连接性核酸类的化学结构、光照射的时机。然而，针对区别特征1），对比文件3给出了其方法经过改进与靶核酸完全互补可以用于检测的目标核酸序列中的细微差异，如SNP位点，且灵敏度高的启示，本领域技术人员有动机将对比文件3的方法经过适当的改进用于检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸。而本领域公知，DNA分子包含有义链和反义链，发夹探针的特异性较强，因而设计针对野生型（未突变的）核酸有义链和反义链的双链发夹探针，使之与野生型核酸的两条链结合，从而抑制野生型核酸的扩增，扩增突变型核酸是本领域技术人员容易想到和使用的。针对区别特征2），将探针和引物制备成为试剂盒是本领域的常规技术手段。对于检测的对象，对比文件3进一步公开了所述方法可以用来检测来源于癌症患者血清中的可检测的肿瘤DNA，并用于癌症的诊断。此外，检测手段可以适用于相关的检测对象，恶性肿瘤突变与其他突变并没有本质区别，均是用于检测核酸中的变体，不同样本是可以通用的。因而，在对比文件3已经公开了可以应用于SNP位点的检测的情况下，将其用于检测恶性肿瘤的突变也是容易想到和使用的。如前所述，对比文件3公开了包含光连接性的核酸类探针，而3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷是现有技术已知的光连接性核酸类，而将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置制备光应答探针也是现有技术已知的，且基于光连接的原理可知，当光连接性核酸类位于光连接的位置时，将会影响到探针分子与靶分子的结合的程度，因此，在对比文件3公开了光连接核酸探针的情况下，本领域技术人员在实际操作中容易想到选择3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷作为光连接性核酸，并将其导入探针不进行光连接的位置，在互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行光照射。在对比文件3已经公开了通过光交联抑制效果，选择性（特异性）扩增靶核酸的原理的基础上，本领域技术人员可以根据需要调节形成杂交体、光连接和选择性扩增等步骤的时机，且效果也是可预期的。因此权利要求1不具备创造性。基于相似的理由，权利要求9也不具备创造性。权利要求2与权利要求1的区别仅在于步骤（c）选择性扩增与进行步骤(a)形成杂交体、(b)进行光连接的时机不同；权利要求10与权利要求9的区别也仅在于步骤（c）选择性扩增与进行步骤(a)形成杂交体、(b)进行光连接的时机不同。然而，参考对权利要求1的评述，在对比文件3已经公开了通过光交联抑制效果，选择性（特异性）扩增靶核酸的原理的基础上，本领域技术人员可以根据需要调节上述步骤的时机，且效果也是可预期的，因而权利要求2、10也不具备创造性。权利要求3、4、11、12的附加技术特征已经被对比文件3公开，权利要求5、13的附加技术特征是本领域技术人员容易想到和做到的，权利要求6-8、14的附加技术特征是本领域设计探针和使用UV光交联时的常规选择，因此，也不具备创造性。
复审请求人于2019年04月12日提交了意见陈述书，未提交修改文本。复审请求人认为：在本申请中，1）两种类型的探针均为野生型的探针，而且2）不使探针彼此进行交联，因此至少在这两方面与对比文件3不同。对比文件3的被交联的分子少、即无法以高的效率抑制野生型的扩增的状态，无法检测在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，对比文件3的方法不适用于如本申请的检测在野生型核酸组中微量包含的突变型核酸的体系，因此关注了对比文件3的本领域技术人员不会想到本申请。对比文件3中的突变检测的检测灵敏度为5％，而本申请中可以实现的检测灵敏度为0.1％，存在着50倍的差异，如果不付出创造性的劳动，是不可能实现的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在2018年02月08日提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共3页14项）。经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定所针对的审查文本为:2013年03月08日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-22页、说明书附图第1-4页、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-3页以及2018年02月08日提交的权利要求第1-14项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的技术启示，则该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
本案中，权利要求1要求保护“包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用，
其中，上述突变为恶性肿瘤的突变，
上述试剂盒包含发夹探针和引物，所述发夹探针包含具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列的光连接性核酸类，所述引物扩增包含靶位点的检测区，
上述发夹探针是针对有义链和反义链的发夹探针，且将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置，
上述包含光连接性核酸类的发夹探针通过包括下述步骤在制备用于检测是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的突变型核酸检测试剂盒中的应用：
步骤(a)：使包含光连接性核酸类的发夹探针与核酸样品共存，使发夹探针与具有靶位点的野生型核酸分子特异性地形成杂交体，所述光连接性核酸类具有与具有野生型核酸序列的靶位点互补的序列；
步骤(b)：对已形成杂交体的发夹探针和靶核酸分子进行光照射，使之进行光连接，其中，上述光照射在通常的互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行1次以上；
步骤(c)：将上述步骤(a)、(b)的反应产物进行核酸扩增反应，选择性地扩增包含突变型核酸的靶位点的检测区；
步骤(d)：分析上述扩增产物，
上述光连接性核酸类为3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷。”
对比文件3（WO2005/072133A2，公开日为2005年08月11日）公开了一种使用包含交联剂的探针检测核酸量的方法，并具体公开了：对于该方法，添加相似量（摩尔）的探针作为目标或参考序列（对应于权利要求1中的步骤（a）），然后使用交联剂“隐藏”检测的结合核酸序列（对应于权利要求1中的步骤（b）），仅留下过量的未结合的核酸序列以提供可检测的信号（对应于权利要求1中的步骤（c）和（d））（参见对比文件3第11页第27-31行、图4）；在一些实施方案中，将探针交联至其他探针或序列是有利的，可以使用任何一系列交联方法将探针与其他探针或序列交联，尽管效率较低，UV可以交联核苷（对应于权利要求1中的包含光连接性核酸类的探针，隐含公开进行光照射1次以上）（参见对比文件3第22页第31行-第23页第1行），在探针与样品序列或探针彼此杂交后，可以使用上述任何方法或本领域已知的技术交联杂交体，交联杂交体不是通过例如PCR检测的有效模板，因此，使用扩增靶和/或参考探针或序列的引物的PCR将仅在存在非交联模板序列的情况下产生扩增产物（对应于权利要求1中的包含靶位点检测区的引物扩增），如下文关于检测方法所讨论的，应设计扩增引物，使得它们与探针交联的区域杂交或使扩增序列含有交联区域，从而抑制PCR链延伸，在任一种情况下，交联探针的存在都会干扰PCR扩增，因此PCR的读数将对应于未通过这些方法交联的序列（参见对比文件3说明书第23页第8-18行）。可见，对比文件3实际公开了包含光连接性的核酸类探针可检测核酸中微量差异的方法，其中检测的步骤中涉及所述探针与核酸样品共存，形成杂交体，通过UV与靶核酸交联，使用引物通过PCR检测未结合（目的）核酸序列以提供可检测的信号，并公开了其原理。由此，权利要求1请求保护的技术方案和对比文件3公开的内容相比，其区别主要在于：1）两者使用的探针和检测的对象不同，权利要求1使用双链发夹探针检测突变型核酸，而对比文件3公开的是单探针检测核酸含量微小差异的方法；2）权利要求1限定了将探针和引物制备成试剂盒，并进一步限定检测的突变为恶性肿瘤的突变、光连接性核酸类导入探针的位置与光连接性核酸类的化学结构、光照射的时机。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是：提供另一种高特异性和灵敏度检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的方法。然而，针对区别特征1），对比文件3公开了该方法具有优于确定核酸序列的相对浓度的现有技术方法的灵敏度，可能检测小至5％或更小的差异，当希望确定样品中靶核酸序列的量时，该灵敏度使得该方法可广泛应用（参见对比文件3第20页第25行至第21页第12行），并进一步公开了在某些应用中，特别是当检测核酸序列中的细微差异时，例如在检测单核苷酸多态性（SNP）时，优选靶结合序列与靶核酸完全互补（参见对比文件3第28页第18-23行），可见对比文件3给出了该方法经过改进与靶核酸完全互补可以用于检测目标核酸序列中的细微差异，如SNP位点，且灵敏度高的启示，本领域技术人员有动机将对比文件3的方法经过适当的改进用于检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸。而本领域公知，DNA分子包含有义链和反义链，发夹探针的特异性较强，因而设计针对野生型（未突变的）核酸有义链和反义链的双链发夹探针，使之与野生型核酸的两条链结合，从而抑制野生型核酸的扩增，扩增突变型核酸是本领域技术人员容易想到和使用的。针对区别特征2），将探针和引物制备成为试剂盒是本领域的常规技术手段。对于检测的对象，对比文件3进一步公开了所述方法可以用来检测来源于癌症患者血清中的可检测的肿瘤DNA，并用于癌症的诊断（参见对比文件3第26页14-21行）。此外，检测手段可以适用于相关的检测对象，恶性肿瘤突变与其他突变并没有本质区别，均是用于检测核酸中的变体，不同样本是可以通用的。因而，在对比文件3已经公开了可以应用于SNP位点的检测的情况下，将其用于检测恶性肿瘤的突变也是容易想到和使用的。如前所述，对比文件3公开了包含光连接性的核酸类探针，而3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷是现有技术已知的光连接性核酸类，而将光连接性核酸类导入到彼此的发夹探针之间不进行光连接的位置制备光应答探针也是现有技术已知的，且基于光连接的原理可知，当光连接性核酸类位于光连接的位置时，将会影响到探针分子与靶分子的结合的程度，因此，在对比文件3公开了光连接核酸探针的情况下，本领域技术人员在实际操作中容易想到选择3-氰基乙烯基咔唑-1’-β-脱氧核苷作为光连接性核酸，并将其导入探针不进行光连接的位置，在互补链彼此之间结合和解离的温度循环中在互补链彼此之间可以结合的温度下进行光照射。在对比文件3已经公开了通过光交联抑制效果，选择性（特异性）扩增靶核酸的原理（参见对比文件3说明书第23页第8-18行）的基础上，本领域技术人员可以根据需要调节形成杂交体、光连接和选择性扩增等步骤的时机，且效果也是可预期的。可见，在对比文件3的基础上结合本领域的常规技术而得到权利要求1请求保护的技术方案，这对本领域技术人员来讲是显而易见的，其效果也是可预期的，因此该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
基于相似的理由，权利要求9要求保护包含光连接性核酸类的发夹探针在制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置中的应用，参见对权利要求1的评述，在对比文件3已经公开了可以采用UV照射使得探针与核酸分子交联，从而抑制该核酸分子扩增（参见对比文件3第22页第31行-第23页第1行、第23页第8-18行），且明确给出了该方法可以用于检测的目标核酸序列中的细微差异，如SNP位点的启示的情况下，设计具有350～380nm范围的波长的光照射功能，以及包含光连接性核酸类的发夹探针制备用于检测核酸样品中是否存在野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸的核酸扩增装置，是本领域技术人员容易想到和做到的，其效果也是可预期的，因此该权利要求9所要求保护的技术方案也不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2与权利要求1的区别仅在于步骤（c）选择性扩增与进行步骤(a)形成杂交体、(b)进行光连接的时机不同；权利要求10与权利要求9的区别也仅在于步骤（c）选择性扩增与进行步骤(a)形成杂交体、(b)进行光连接的时机不同。然而，参考对权利要求1的评述，在对比文件3已经公开了通过光交联抑制效果，选择性（特异性）扩增靶核酸的原理（参见对比文件3说明书第23页第8-18行）的基础上，本领域技术人员可以根据需要调节上述步骤的时机，且效果也是可预期的，因而权利要求2、10也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3、4、11、12进一步限定核酸扩增法为PCR法和实时PCR法，该附加技术特征已经被对比文件3公开（参见对比文件3第23页第8-18行、第39页第16-21行），因此，在其各自引用的权利要不具备创造性的情况下，权利要求3、4、11、12也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求5、13限定发夹探针具有与靶核酸分子的有义链和/或反义链互补的序列，如前所述，由于DNA分子包含正义链和反义链，因此将检测方法针对有义链或反义链设计探针分子是本领域技术人员容易想到和做到的。因此，在其各自引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求5、13也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求6-8、14分别对探针的长度、光照射的波长和装置进行了限定，然而，这是本领域设计探针和使用UV光交联时的常规选择，因此，在其各自引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求6-8、14也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3.对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为，1）如前所述，对比文件3已经公开了使用光连接性反应进行特异性的连接的原理，即在探针与样品序列或探针彼此杂交后，可以使用如UV交联核苷或本领域已知的技术交联杂交体，交联杂交体不是通过例如PCR检测的有效模板，因此，使用扩增靶和/或参考探针或序列的引物的PCR将仅在存在非交联模板序列的情况下产生扩增产物，如应设计扩增引物，使得它们与探针交联的区域杂交或使扩增序列含有交联区域，从而抑制PCR链延伸，在任一种情况下，交联探针的存在都会干扰PCR扩增，因此PCR的读数将对应于未通过这些方法交联的序列（参见对比文件3第22页第31行-第23页第1行、第23页第8-18行），而核酸样品中的核酸通常为双链DNA，对比文件3的探针也不是完全互补的（参见对比文件3图4等），且本领域技术人员知晓高度互补会影响与序列的杂交，因而同时使用针对两条链制备的彼此不完全互补的探针是本领域技术人员容易想到并使用的，其效果也是可预期的。而本申请使用的光应答性核酸也是现有技术已知的，由此获得的效果也是可预期的。2）对比文件3中强调的并不是UV交联的效率低，而是UV可以对核苷酸进行交联，表明可以采用UV交联；对比文件3公开了检测的目标核苷酸可以是SNP位点（参见对比文件3第28页第18-23行），而核苷酸中的SNP是基因组水平上单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，且对比文件3还公开了其方法具有优于确定核酸序列的相对浓度的现有技术方法的灵敏度，可能检测小至5％或更小的差异，当希望确定样品中靶核酸序列的量时，该灵敏度使得其方法可广泛应用（参见对比文件3第20页第25行至第21页第12行）。因而，本领域技术人员在对比文件3的启示下，有动机将所述方法用于检测野生型核酸组中微量混杂的突变型核酸，其能够获得更高的灵敏度也是本领域技术人员可预期的。检测灵敏度与多种因素有关，如检测对象，引物的选择以及反应条件等等，因而检测灵敏度的不同并不能表明本申请请求保护的技术方案取得了预料不到的技术效果。因此，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年10月30日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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