发明创造名称：一种高活性人趋化因子的制备方法及用途
外观设计名称：
决定号：185196
决定日：2019-07-28
委内编号：1F239946
优先权日：
申请（专利）号：201510896224.X
申请日：2015-12-07
复审请求人：中国石油大学（华东）
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：葛永奇
合议组组长：兰琪
参审员：曹克浩
国际分类号：
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在采用经优化的制备方法制备已知产品时，如果这种优化本身导致所制得的产品产生了预料不到的技术效果，则采用如此优化的方式来制备已知产品的新制备方法具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510896224.X，名称为“一种高活性人趋化因子的制备方法及用途”的发明专利申请。申请人为中国石油大学（华东）。本申请的申请日为2015年12月07日，公开日为2016年06月22日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月28日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：1、权利要求1-4相对于对比文件1（CN101624421A，公开日为2010年1月13日）与对比文件2(GENBANK登录号：1EOT_A，参见序列，公开日为2012年10月10日)的结合不具备创造性，权利要求5-7相对于对比文件1、2和对比文件3（CN101622352A，公开日为2010年1月6日）的结合不具备创造性。驳回决定的主要理由是认为对目标蛋白的基因进行密码子优化、选择适当的表达宿主、加入的酶切位点及标签的序列和位置顺序均为本领域技术人员的常规选择，本领域技术人员容易想到对对比文件1所公开的制备方法进行优化并将其用于对比文件2所公开的Eotaxin蛋白的表达生产，因此，本申请相对于对比文件1和2的结合是显而易见的。
驳回决定所针对的独立权利要求1如下：
“1. 一种高活性人趋化因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-1蛋白；
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGT CCG GCA TCT GTT CCG ACC ACG TGC TGT TTT AAC CTG GCA AAT CGT AAA ATT CCG CTG CAG CGC CTG GAA AGC TAT CGT CGC ATC ACC TCT GGC AAA TGC CCG CAA AAA GCG GTG ATT TTC AAA ACG AAA CTG GCG AAA GAT ATC TGT GCC GAC CCG AAA AAA AAA TGG GTG CAA GAC TCA ATG AAA TAC CTG GAC CAA AAA TCC CCG ACG CCG AAA CCG TAA；
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site Hind Ⅲ site
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3。”
申请人中国石油大学（华东）（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月12日向国家知识产权局提出了复审请求，同时修改了权利要求书。
复审请求人认为：修改后的权利要求涉及高活性人趋化因子的制备方法，而对比文件1的方法用于生产AH1 VP2基因病毒样颗粒重组蛋白，而且，与对比文件1相比，本申请的方法在密码子优化、限制性酶切位点的序列及位置、蛋白生产纯化方面均存在不同，所得Eotaxin-1蛋白为水溶性的，包涵体较少，活性比现有技术的Eotaxin-1蛋白高10倍。因此，本申请的方法能够低成本、高产量地获得高纯度、高活性Eotaxin-1蛋白，相对于对比文件1公开的现有技术具备创造性。
新修改的权利要求书如下：
“1. 一种高活性人趋化因子的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-1的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，在菌体OD600＝1.0～1.3时加入IPTG诱导蛋白表达，诱导时间为8h、诱导温度为25℃生产Eotaxin-1蛋白，所述表达载体为质粒pET28a，所述大肠杆菌表达体系为BL21(DE3)；
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GGT CCG GCA TCT GTT CCG ACC ACG TGC TGT TTT AAC CTG GCA AAT CGT AAA ATT CCG CTG CAG CGC CTG GAA AGC TAT CGT CGC ATC ACC TCT GGC AAA TGC CCG CAA AAA GCG GTG ATT TTC AAA ACG AAA CTG GCG AAA GAT ATC TGT GCC GAC CCG AAA AAA AAA TGG GTG CAA GAC TCA ATG AAA TAC CTG GAC CAA AAA TCC CCG ACG CCG AAA CCG TAA；
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site Hind Ⅲ site
5-AGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-1-TAAAAGCTTACT-3；
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Eotaxin-1基因源自 嗜酸性粒细胞(eosinophils)。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月16日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门的前置审查意见认为：修改后的权利要求中增加的质粒、表达体系、诱导表达及表达条件等都是本领域技术人员根据实验条件能够选择并确定的，Eotaxin-1蛋白的水溶性及较少的包涵体等效果是优化密码子和选择的宿主细胞本身所产生的，是本领域技术人员能够预料到的。而Eotaxin-1蛋白比现有技术中已有的蛋白活性高10倍的效果，本申请没有记载两者是否在相同实验条件下进行。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页，经审查，所述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，本复审决定所依据的审查文本为复审请求人于申请日2015年12月07日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书第1-132段、说明书附图1-10、核苷酸和氨基酸序列表，以及2017年12月12日提交的权利要求1-2项。
2、关于创造性
专利法第22条第3款 创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在采用经优化的制备方法制备已知产品时，如果这种优化本身导致所制得的产品产生了预料不到的技术效果，则采用如此优化的方式来制备已知产品的新制备方法具备创造性。
修改后的权利要求1要求保护一种高活性人趋化因子的制备方法，相对于驳回决定所针对的权利要求书，将说明书中记载的有关表达质粒和表达体系以及诱导表达和表达条件的内容加入权利要求1，将权利要求2的附加技术特征加入权利要求1（具体参见案由部分）。
对比文件1（参见权利要求1-8、具体实施方式2.6节）公开了一种克隆传染性法氏囊病病毒变异株AH1 VP2基因的方法，通过该方法包括根据VP2基因序列和供体质粒pFastBacHTA设计扩增引物，将克隆质粒pUC-VP2(AH1)和含有6个组氨酸的供体质粒分别用EcoRⅠ、HindⅢ双酶切，将VP2基因定向克隆入供体质粒，转化大肠杆菌DH10Bac，最终得到的基因含有6个His和TEV蛋白酶识别位点，经收集细胞、破碎、离心、过滤、HisTrap HP层析、SDS-PAGE等一系列步骤纯化蛋白质。权利要求1与对比文件1的区别特征在于：（1）表达的蛋白质不同，权利要求1的是Eotaxin-1，对比文件1的是VP2，并且权利要求1对该蛋白质的基因进行了密码子优化；（2）对比文件1没有公开具体的酶切位点及序列；（3）本申请目标蛋白的表达在IPTG诱导下进行，并限定了诱导表达时的菌体OD值、诱导时间、诱导温度，限定了具体表达载体为pET28a质粒，表达体系为BL21（DE3），对比文件1没有公开诱导表达相关内容，所用表达载体和表达体系也不相同。
对于细胞趋化因子Eotaxin-1的活性，本申请实施例2采用表面等离子共振技术（SPR），分别在表面活性剂FC-14、DDM和Trx-100增溶下研究本申请所得Eotaxin-1与G蛋白偶联受体CCR3的相互作用。结果表明,不同表面活性剂条件下，本申请的Eotaxin-1与CCR3的结合活性有所不同，其中DDM增溶条件下本申请的Eotaxin-1与CCR3的结合能力最强，而在Trx-100增溶条件下Eotaxin-1与CCR3的结合最快解离也快，即表面活性剂会极大影响CCR3的生物学活性，从而影响CCR3与其配体的相互作用。同时，在DDM作为表面活性剂增溶的同等条件下，与商业化的Eotaxin-1相比，本申请的Eotaxin-1与受体CCR3的结合亲和力高10倍（本申请的Eotaxin-1与CCR3的KD值是7.0×10-8M，商业化Eotaxin-1与CCR3的KD值是7.0×10-7M）。可以看出，本申请实施例2中上述各组比较试验数据的得出，均采用了相同的测试技术即SPR，分别在相同的表面活性剂增溶条件下实施，所采用的G蛋白偶联受体均为CCR3。因此，基于实施例所验证的该技术效果，本申请相对于对比文件1解决的技术问题是提供一种制备高活性细胞趋化因子Eotaxin-1的方法。
针对该技术问题，虽然对比文件1公开了一种获得目标蛋白的方法，该方法包括根据目标基因和供体质粒设计扩增引物，通过双酶切将含有6个His和TEV蛋白酶识别位点的目标基因定向克隆入供体质粒，转化大肠杆菌宿主细胞，表达并纯化最终得到目标蛋白质，但是，首先，对比文件1所要制备的目标蛋白是传染性法氏囊病病毒变异株AH1 VP2蛋白，而非本申请的细胞趋化因子Eotaxin-1，其次，尽管制备目标蛋白质的方法在整体上较为类似，但本申请通过对密码子进行优化、选取特定的蛋白质诱导表达条件等一系列操作，获得了同等条件下生物活性显著高于商业化Eotaxin-1的细胞趋化因子（在DDM作为表面活性剂增溶的条件下与CCR3的结合亲和力高10倍）的技术效果。本领域普通技术人员通常认为对目标蛋白的密码子进行优化、控制诱导表达条件一般仅会适度提高目标蛋白的产量，即使对生物活性有所改善，这种改善的幅度也是有限的，因此，本申请的方法所取得的提高细胞趋化因子Eotaxin-1生物活性的技术效果超出了普通技术人员的一般预期。对比文件2则仅仅公开了本申请细胞趋化因子Eotaxin-1的序列，没有教导在对比文件1所公开的制备VP2蛋白的方法的基础上对其密码子和诱导表达条件进行优化并用于Eotaxin-1的表达生产，更不能基于对比文件2预期经过如此优化的制备方法所制得的Eotaxin-1在生物活性上具有大幅度的提升。
因此，新修改的权利要求1的技术方案相对于对比文件1和对比文件2的结合具备突出的实质性特点和显著的进步，符合专利法第22条第3款有关创造性的规定，克服了驳回决定所指出的缺陷。在权利要求1具备创造性的基础上，其从属权利要求2也具备创造性。
对比文件3在驳回决定中用于评述权利要求5-7的创造性，本复审决定所针对的权利要求书中已经删除了驳回决定所针对的权利要求5-7，因此，本复审决定不再对对比文件3进行评述。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年07月28日对本申请作出的驳回决定，由国家知识产权局原审查部门在本复审决定所依据的审查文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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