发明创造名称：在无谷氨酰胺的细胞培养基中的蛋白质生产
外观设计名称：
决定号：185166
决定日：2019-07-26
委内编号：1F249964
优先权日：2009-08-11
申请（专利）号：201410332310.3
申请日：2010-08-06
复审请求人：弗·哈夫曼-拉罗切有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：魏聪
合议组组长：吴文英
参审员：李金光
国际分类号：C12P21/00；C12P21/08；C12N5/20；C12R1/91
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，但现有技术中给出了将上述区别技术特征应用到该最接近现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且该区别技术特征的引入也未产生预料不到的技术效果，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410332310.3，名称为“在无谷氨酰胺的细胞培养基中的蛋白质生产”的发明专利申请。申请人为弗·哈夫曼-拉罗切有限公司。本申请的申请日为2010年08月06日，优先权日为2009年08月11日，公开日为2014年09月24日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月09日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1与对比文件1（陈昭烈等，用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养产尿激酶原CHO工程细胞，生物技术通报，第2期，第25-27页，公开时间：2001年02月28日）的区别在于天冬酰胺的浓度为7.5mM至10mM，解决的技术问题是进一步提高蛋白产量。在对比文件1中用天冬酰胺替换培养基中的重要组成成分谷氨酰胺的情况下，本领域技术人员有动机对天冬酰胺的浓度进行调整，通过常规实验手段和有限试验确定合适的浓度。因此，权利要求1不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。基于类似理由，权利要求2-25也不符合专利法第22条第3款的规定。
驳回决定所依据的文本为2016年12月14日提交的权利要求第1-25项以及本案分案申请递交日（2014年07月11日）提交的说明书第1-377段（第1-42页）、说明书附图1-13（第1-14页）和说明书摘要。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 在表达多肽的哺乳动物宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在含有天冬酰胺的无谷氨酰胺生产培养基中培养处于培养物的生产期的所述哺乳动物宿主细胞，其中以7.5mM至10mM范围内的浓度加入所述天冬酰胺。
2. 权利要求1的方法，其中以2mM至10mM的浓度加入天冬氨酸。
3. 权利要求1或2的方法，其中以10mM的浓度加入所述天冬酰胺。
4. 权利要求1或2的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
5. 权利要求4的方法，其中所述哺乳动物宿主细胞是dhfr-CHO细胞。
6. 权利要求1或2的方法，其中所述生产培养基是无血清的。
7. 权利要求1或2的方法，其中所述生产培养基包含选自下述的一种或多种成分
1)能量来源；
2)必需氨基酸；
3)维生素；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素。
8. 权利要求7的方法，其中所述生产培养基另外包含选自下述的一种或多种成分：
1)激素和其他生长因子；
2)盐和缓冲液；和
3)核苷。
9. 权利要求1或2的方法，其中所述生产期是分批或补料分批培养期。
10. 权利要求1或2的方法，其还包括分离所述多肽的步骤。
11. 权利要求10的方法，其还包括在分离后测定选自：细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质滴度中的参数的一种或多种。
12. 权利要求11的方法，其中相对在相同组成的含谷氨酰胺的生产培养基中生产的同一多肽，细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质滴度中的至少一种提高。
13. 权利要求1或2的方法，其中所述多肽是哺乳动物糖蛋白。
14. 权利要求1或2的方法，其中所述多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。
15. 权利要求14的方法，其中所述抗体片段选自Fab,Fab′,F(ab′)2,scFv,(scFv)2,dAb,互补决定区(CDR)片段，线性抗体，单链抗体分子，微型抗体(minibody)，双抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。
16. 权利要求14的方法，其中所述抗体或抗体片段是嵌合的、人源化的或人的。
17. 权利要求14的方法，其中所述抗体或抗体片段是治疗抗体或其生物学功能片段。
18. 权利要求17的方法，其中所述治疗抗体选自抗HER2抗体，抗CD20抗体；抗IL-8抗体；抗VEGF抗体；抗CD40抗体,抗CD11a抗体；抗CD18抗体；抗IgE抗体；抗Apo-2受体抗体；抗组织因子(TF)抗体；抗人α4β7整联蛋白抗体；抗EGFR抗体；抗CD3抗体；抗CD25抗体；抗CD4抗体；抗CD52抗体；抗Fc受体抗体；抗癌胚抗原(CEA)抗体；针对乳腺上皮细胞的抗体；结合结肠癌细胞的抗体；抗CD38抗体；抗CD33抗体；抗CD22抗体；抗EpCAM抗体；抗GpIIb/IIIa抗体；抗RSV抗体；抗CMV抗体；抗HIV抗体；抗肝炎抗体；抗CA125抗体；抗αvβ3抗体；抗人肾细胞癌抗体；抗人17-1A抗体；抗人结直肠肿瘤抗体；针对GD3神经节苷脂的抗人黑色素瘤抗体R24；抗人鳞状细胞癌；和抗人白细胞抗原(HLA)抗体,和抗HLA DR抗体。
19. 权利要求17的方法，其中所述治疗抗体是结合HER受体,VEGF,IgE,CD20,CD11a,CD40,BR3或DR5的抗体。
20. 权利要求19的方法，其中所述结合DR5的治疗抗体选自Apomab 1.1,2.1,3.1,4.1,5.1,5.2,5.3,6.1,6.2,6.3,7.1,7.2,7.3,8.1, 8.3,9.1,1.2,2.2,3.2,4.2,5.2,6.2,7.2,8.2,9.2,1.3,2.2,3.3,4.3,5.3,6.3,7.3,8.3,9.3,和25.3。
21. 权利要求19的方法，其中所述治疗抗体是抗-BR3抗体。
22. 权利要求14的方法，其中所述免疫黏附素是BR3-Fc免疫粘附素。
23. 权利要求1或2的方法，其中所述多肽是治疗多肽。
24. 权利要求23的方法，其中所述治疗多肽选自生长激素,包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体激素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC,因子IX,组织因子,和von Willebrands因子；抗凝血因子如蛋白质C；心房利钠(atrial natriuretic)因子；肺表面活性物质；纤溶酶原激活物,如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(受活化调节，由正常T细胞表达和分泌的因子)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白,如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA),如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白质A或D；类风湿因子；神经营养因子如骨源神经营养因子(BDNF),神经营养因子-3,-4,-5,或-6(NT-3,NT-4,NT-5,或NT-6),或神经生长因子如NGF-β；血小板源生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β,包括TGF-β1,TGF-β2,TGF-β3,TGF-β4,或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I),胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD3,CD4,CD8,CD19,CD20,CD34,和CD40；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α,-β,和-γ；集落刺激因子(CSF),例如,M-CSF,GM-CSF,和G-CSF；白介素(IL),例如,IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加 速因子；病毒抗原如,例如,AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白如CD11a,CD11b,CD11c,CD18,ICAM,VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原如HER2,HER3或HER4受体；和所述多肽的片段。
25. 用于在生产期生产多肽的立即可用的包含天冬酰胺的无谷氨酰胺细胞培养基，其中所述天冬酰胺的浓度范围在7.5mM至15mM。”
申请人弗·哈夫曼-拉罗切有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年04月23日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文修改替换页（共4页24项）。复审请求人将驳回决定针对权利要求4和14的附加技术特征限定到权利要求1中，同时删除驳回决定针对的权利要求4和14，并增加了权利要求24。复审请求人认为：（1）对比文件1中用2mM的天冬酰胺代替2mM的谷氨酰胺时，仍然保留大约71.25-100％的氨产生，本领域技术人员不会想到将仍然会导致如此高浓度氨产生的天冬酰胺的使用浓度再提高3-5倍；对比文件1中公开了天冬酰胺培养基的饱和细胞密度比含谷氨酰胺的培养基的饱和细胞密度低大约10%，为了保证一定的饱和细胞密度，本领域技术人员也不会想到大幅增加天冬酰胺的使用浓度；（2）本申请附图11证明，在已包含10mM天冬酰胺的情况下，增加谷氨酰胺并不会很大程度上影响细胞活力，甚至可能增加细胞活力，这属于预料不到的技术效果。由此认为权利要求1-24具备创造性。
复审请求时修改的权利要求1和24如下：
“1. 在表达多肽的哺乳动物宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在含有天冬酰胺的无谷氨酰胺生产培养基中培养处于培养物的生产期的所述哺乳动物宿主细胞，其中以7.5mM至10mM范围内的浓度加入所述天冬酰胺，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中所述多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。”
“24. 权利要求23的细胞培养基，其中细胞培养基还包含天冬氨酸，且其中所述天冬氨酸的浓度为2mM至10mM。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，权利要求1中新增的技术特征“所述细胞是CHO细胞”已被对比文件1公开，“生产的多肽是抗体、抗体片段和免疫粘附素”是本领域中使用CHO细胞重组生产多肽的常见应用；对比文件1提供了Asn代替Gln的动机，且1-20mM属于常规范围内的选择；本申请所述的降低氨、增强细胞活力、提高重组蛋白产量的效果均可合理预期，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月01日向复审请求人发出复审通知书，指出：
权利要求1与对比文件1相比，区别技术特征在于：权利要求1限定了培养基中所加入的天冬酰胺的浓度为7.5mM至10mM；所表达的多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。由此可以确定，该权利要求实际解决的技术问题是提供了一种具体的多肽生产方法。在对比文件1已经公开了用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的原理和适用条件的前提下，为了增强培养效果、提高蛋白产量，本领域技术人员有动机对培养基中天冬酰胺的浓度进行调整；由于本领域公知培养基中谷氨酰胺的常用浓度为1-20mM，且如前所述对比文件1明确公开了天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同，因此亦有动机在上述浓度范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定。如前所述对比文件1已经给出了采用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的普遍性教导，该教导并非针对表达特定蛋白质的培养基，同时抗体、抗体片段和免疫粘附素均属于本领域利用哺乳动物宿主细胞可以表达的常见蛋白质，本申请也未验证其与其它蛋白质的表达相比具有任何预料不到的技术效果，因此以上表达蛋白质种类属于常规的选择。可见，在对比文件1的基础上结合公知常识，并通过有限的试验以获得该权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，且该技术方案并未产生任何预料不到的技术效果，因此该权利要求不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定。基于类似理由，权利要求2-24也不符合专利法第22条第3款的规定。
针对复审理由，合议组认为：（1）本领域公知，采用谷氨酰胺培养基进行细胞培养时，氨对细胞生长有明显抑制作用，其来源包括两方面，一是来源于培养基中谷氨酰胺的自发分解，二是细胞代谢谷氨酰胺所产生。对比文件1明确公开天冬酰胺和谷氨酰胺进入细胞的转运系统相同，其公开的相关数据与具体培养条件和培养基更换情况直接相关，且整体趋势也与理论预期一致，由此本领域技术人员容易想到用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养动物细胞将有效降低氨浓度。对比文件1的表1中的表达量数据恰恰证明了前述培养基组分的改变有助于提升表达表达重组多肽的能力，从而给出了改进的动机。同时，对比文件1明确教导无论是天冬酰胺，还是谷氨酰胺都是体外培养细胞生长代谢的主要营养物质，因此本领域技术人员容易想到要在“提供细胞生长的营养”与“减少抑制细胞生长代谢的氨积聚”之间达到平衡；如前所述，本领域公知培养基中谷氨酰胺的常用浓度为1-20mM，在对比文件1明确公开了天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同的情况下，因此亦有动机在上述浓度范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定，得到本申请的技术方案。（2）本申请并未要求保护同时包含天冬酰胺和谷氨酰胺的培养基及其培养方法的技术方案，所有权利要求中均明确限定采用无谷氨酰胺生产培养基；如前所述，在使用天冬酰胺或谷氨酰胺体外培养细胞时，需要在“提供细胞生长的营养”与“减少抑制细胞生长代谢的氨积聚”之间达到平衡，在对比文件1给出了用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养动物细胞的明确教导的前提下，本领域技术人员有动机在常规范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定，其细胞培养效果好、氨积聚浓度低的特点也是完全可以预期的，可见本申请并未证明请求保护的技术方案取得了任何预料不到的技术效果。综上，复审请求人强调的理由都不具备说服力。
复审请求人于2019年07月04日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人强调，对比文件1中公开了Asn代替Gln导致产生氨的降低不明显（参见图4），当培养基全量更换时，用Asn代替Gln，细胞培养上清液中“氨浓度无明显差别”（参见其第26页倒数第2段），可见本领域技术人员没有动机将Asn的使用浓度提高3-5倍，从而得到本申请的技术方案，由此证明权利要求1具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在2018年04月23日提交了权利要求书全文替换页（共4页24项），经审查，上述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所针对的文本为：复审请求人于2018年04月23日提交的权利要求第1-24项以及本案分案申请递交日（2014年07月11日）提交的说明书第1-377段（第1-42页）、说明书附图1-13（第1-14页）和说明书摘要。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，但现有技术中给出了将上述区别技术特征应用到该最接近现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且该区别技术特征的引入也未产生预料不到的技术效果，则该权利要求不具备创造性。
2.1关于权利要求1
本申请权利要求1要求保护一种在表达多肽的哺乳动物宿主细胞中生产所述多肽的方法，其包括在含有天冬酰胺的无谷氨酰胺生产培养基中培养处于培养物的生产期的所述哺乳动物宿主细胞，其中以7.5mM至10mM范围内的浓度加入所述天冬酰胺，其中所述哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其中所述多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。
对比文件1公开了一种用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养产尿激酶原CHO工程细胞的方法（参见其第25页摘要和第1段、第26页第1段和表1、第27页最后1段），其中以DMEM/F12为基础培养基，采用2mmol/L天冬酰胺替代培养基中的谷氨酰胺，配制培养基培养CHO工程细胞，所述CHO细胞为dhfr- CHO细胞，在培养过程中，自细胞接种的第2天起更换培养基，培养时可达到饱和细胞密度；同时公开了谷氨酰胺作为细胞体外培养的重要营养成分，也是对细胞生长有明显抑制作用的氨的主要来源，天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同，天冬酰胺的自发分解速度明显低于谷氨酰胺，根据尿激酶原的表达实验证明用天冬酰胺替代培养基中的谷氨酰胺，既能满足体外培养细胞生长和代谢的需要，又有利于减缓培养基中氨的积聚，能够克服氨的过度积累对细胞代谢的不利影响。本领域技术人员根据对比文件1记载的“培养细胞达到了饱和细胞密度，且进行了培养基更换”的信息，可以确定对比文件1的细胞培养过程经历了生长结束、保持代谢积累蛋白质产物的过程，即包含了“处于培养物的生产期”的培养阶段。
将权利要求1与对比文件1公开的上述技术方案相比，区别技术特征在于：权利要求1限定了培养基中所加入的天冬酰胺的浓度为7.5mM至10mM；所表达的多肽选自抗体、抗体片段和免疫粘附素。根据说明书的记载，采用前述培养基组成的培养方法相对于采用含谷氨酰胺培养基的培养方法而言，可以获得滴度、细胞单位生产率、细胞活力整体上较高的抗体及免疫粘附素产物，同时培养基中氨含量又整体上较低（参见本申请说明书第366-375段以及图1-13B）。由此可以确定，该权利要求实际解决的技术问题是提供了一种具体的多肽生产方法。
就以上区别技术特征而言，首先，在对比文件1已经公开了用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的原理和适用条件的前提下，为了增强培养效果、提高蛋白产量，本领域技术人员有动机对培养基中天冬酰胺的浓度进行调整；由于本领域公知培养基中谷氨酰胺的常用浓度为1-20mM，且如前所述对比文件1明确公开了天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同，因此亦有动机在上述浓度范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定。其次，如前所述对比文件1已经给出了可以采用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的普遍性教导，该教导并非针对表达特定蛋白质的培养基，同时抗体、抗体片段和免疫粘附素均属于本领域利用哺乳动物宿主细胞可以表达的常见蛋白质，本申请也未验证其与其它蛋白质的表达相比具有任何预料不到的技术效果，因此以上表达蛋白质种类属于常规的选择。
由此可见，在对比文件1的基础上结合公知常识，并通过有限的试验以获得该权利要求1所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员来说是显而易见的，且该技术方案并未产生任何预料不到的技术效果，因此该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定。
2.2关于权利要求2-22
从属权利要求2-4直接或者间接引用了权利要求1，分别进一步限定了天冬酰胺（天冬氨酸）的浓度以及宿主细胞的具体类型。天冬氨酸是常用的培养基氨基酸成分，本领域技术人员可以根据需要选择加入氨基酸成分，合适的天冬氨酸浓度可通过常规实验手段和有限试验确定。基于与权利要求1类似的理由，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求5-7直接或者间接引用了权利要求1-2，进一步限定了培养基的成分。本领域公知，血清成分复杂，可能含有有毒物质或抑制因子，为克服血清带来的潜在污染并利于后期蛋白质纯化，常用无血清培养基培养动物细胞；同时，能量来源、必需氨基酸、维生素、游离脂肪酸、微量元素、激素和其他生长因子、盐和缓冲液、核苷等亦属于动物细胞培养基的常规组分，因此在其引用的权利要求不具有创造性的情况下，上述从属权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求8-10直接或者间接引用了权利要求1-2，进一步限定了所述生产期的具体类型以及表达后续步骤。本领域公知，分批或补料分批培养都是细胞培养的通常模式，通常选择在这种模式培养时期进行外源蛋白质的生产；所述后续步骤亦属于本领域的常规操作。因此在其引用的权利要求不具有创造性的情况下，上述从属权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求11引用了权利要求10，进一步限定了“细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质滴度中的至少一种提高”。如前所述，对比文件1已经明确教导，用天冬酰胺替代培养基中的谷氨酰胺既能满足体外培养细胞生长和代谢的需要，又有利于减缓培养基中氨的积聚，由此本领域技术人员可以认识到减缓细胞中氨积聚利于细胞的生长与表达，可能导致细胞活力、培养物寿命、单位生产率和最终重组蛋白质的滴度有所改善。因此在其引用的权利要求不具有创造性的情况下，上述从属权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求12-22直接或者间接引用了权利要求1-2，进一步限定了所述多肽的种类。如前所述对比文件1已经给出了采用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的普遍性教导，该教导并非针对表达特定蛋白质的培养基，同时上述多肽均属于本领域利用哺乳动物宿主细胞可以表达的常见蛋白质，本申请也未验证其与其它蛋白质的表达相比具有任何预料不到的技术效果，因此在其引用的权利要求不具有创造性的情况下，上述从属权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
2.3关于权利要求23、24
权利要求23要求保护一种用于在生产期生产多肽的立即可用的包含天冬酰胺的无谷氨酰胺细胞培养基。从属权利要求24引用了权利要求23，进一步限定了天冬酰胺（天冬氨酸）的浓度。基于前述分析可知，权利要求23与对比文件1公开的上述技术方案相比，区别技术特征在于：权利要求23限定了培养基中所加入的天冬酰胺的浓度为7.5mM至10mM。该权利要求实际解决的技术问题是提供了一种具体的无谷氨酰胺生产培养基。然而，在对比文件1已经公开了用天冬酰胺替换培养基中的组分谷氨酰胺的原理和适用条件的前提下，为了增强培养效果、提高蛋白产量，本领域技术人员有动机对培养基中天冬酰胺的浓度进行调整；由于本领域公知培养基中谷氨酰胺的常用浓度为1-20mM，且如前所述对比文件1明确公开了天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同，因此亦有动机在上述浓度范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定。因此，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
关于复审请求人的意见
对于复审请求人答复复审通知书时强调的理由，合议组认为：
（1）本领域公知，采用谷氨酰胺培养基进行细胞培养时，氨对细胞生长有明显抑制作用，其来源包括两方面，一是来源于培养基中谷氨酰胺的自发分解，二是细胞代谢谷氨酰胺所产生。对比文件1明确公开天冬酰胺和谷氨酰胺进入细胞的转运系统相同，而在37℃下存放10天后自发分解率分别为7.4%和52.3%（参见第26页第2.1小节）；其中图4显示培养第14天时天冬酰胺培养基和谷氨酰胺培养基中氨浓度分别约为1.25mM和1.75mM，尽管在数值上不如前述自发分解率的差距那么大，但是这是与具体培养条件和培养基更换情况直接相关的，且整体趋势也与理论预期一致，由此本领域技术人员容易想到用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养动物细胞将有效降低氨浓度。
（2）对比文件1第26页倒数第2段重点分析论述了由其表1的实验数据所得出的结论，表1中测定了饱和细胞密度和重组多肽的表达量数据，其中用天冬酰胺代替谷氨酰胺培养动物细胞，使饱和细胞密度略为降低（由9.8±0.8降低至8.9±1.6），而重组蛋白质表达量则升高了（由719±270提高至856±178），由此恰恰证明了前述培养基组分的改变有助于提升表达表达重组多肽的能力，从而给出了改进的动机；上述倒数第2段后半句提到的“培养基实施全量更换”时, “不同培养条件下培养的细胞培养上清液中氨浓度无明显差别”的结论，恰恰是由于依靠培养基全量更换的手段实现了避免氨积累的目的，从而达到“氨浓度无明显差别”的效果，也是与该对比文件“用天冬酰胺替代培养基中的谷氨酰胺以便有效减缓培养基中氨的积聚”的整体构思完全一致的。
（3）对比文件1明确教导无论是天冬酰胺还是谷氨酰胺，都是体外培养细胞生长代谢的主要营养物质，因此本领域技术人员容易想到要在“提供细胞生长的营养”与“减少抑制细胞生长代谢的氨积聚”之间达到平衡；如前所述，本领域公知培养基中谷氨酰胺的常用浓度为1-20mM，且如前所述对比文件1明确公开了天冬酰胺和谷氨酰胺均为含酰胺氨的氨基酸，且进入细胞的转运系统相同，因此亦有动机在上述浓度范围内对天冬酰胺的浓度进行调整，并通过常规实验手段加以选择确定，得到本申请的技术方案。
综上，复审请求人强调的理由都不具备说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月09日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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