发明创造名称：稳定化逆转录酶融合蛋白
外观设计名称：
决定号：184768
决定日：2019-07-24
委内编号：1F243594
优先权日：2009-03-04
申请（专利）号：201080020123.1
申请日：2010-03-04
复审请求人：得克萨斯系统大学评议会
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李娟娟
合议组组长：邢维玲
参审员：王慧
国际分类号：C07K14/195
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201080020123.1，名称为“稳定化逆转录酶融合蛋白”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为得克萨斯系统大学评议会。本申请的申请日为2010年03月04日，优先权日为2009年03月04日，公开日为2012年04月18日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年10月10日以权利要求1-12不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2011年11月01日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要，摘要附图，说明书第1-2、4-14、17-21、23-41页，说明书附图第1-24页；2014年05月21日提交的说明书第3、15、16、22页；2017年03月01日提交的权利要求第1-18项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种稳定化逆转录酶融合蛋白，包含通过刚性接头肽与稳定剂蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的，其中所述稳定剂蛋白是包括50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白。
2. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述热稳定II组内含子衍生的逆转录酶是细长热聚球蓝细菌逆转录酶或嗜热脂肪土芽孢杆菌逆转录酶。
3. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述热稳定逆转录酶包含与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列有至少95％氨基酸序列同一性的多肽。
4. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述稳定剂蛋白包含麦芽糖结合蛋白或N-利用物质A蛋白。
5. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述稳定剂蛋白通过将带电氨基酸置换为不带电氨基酸而修饰。
6. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述刚性接头肽由1-20个氨基酸组成。
7. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述刚性接头肽由1-5个氨基酸组成。
8. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述刚性接头肽由3-5个氨基酸组成。
9. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述刚性接头肽由SEQ ID NO:12组成。
10. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述融合蛋白具有包含多肽的氨基酸序列，所述多肽与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列有 至少95％氨基酸序列同一性。
11. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述稳定化逆转录酶融合蛋白能够在约45℃至约65℃的温度下以2.0×10-5或以下的错误频率进行逆转录。
12. 权利要求1的稳定化逆转录酶融合蛋白，其中所述稳定剂蛋白包括独立折叠结构域和/或不折叠成长寿命错折叠中间体。
13. 一种从RNA分子制备cDNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将引物核苷酸序列加入RNA分子中
(b)在足以合成与所述RNA分子的全部或部分互补的cDNA分子的条件下，在一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸或双脱氧核糖核苷三磷酸和包含通过刚性接头肽与具有50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶的稳定化逆转录酶融合蛋白存在下孵育所述RNA分子，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的。
14. 权利要求13的方法，其中在所述RNA具有实质上减少量的阻碍性稳定二级或三级结构的温度范围内进行逆转录。
15. 权利要求13的方法，其中所述热稳定逆转录酶包含：与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的序列有至少95％氨基酸序列同一性的多肽；和由1-20个氨基酸组成的刚性接头，所述刚性接头是通过蛋白酶非可切割的。
16. 权利要求13的方法，其中在约45℃至约65℃的温度下以2.0×10-5或以下的错误频率进行逆转录。
17. 一种用于生产稳定化逆转录酶融合蛋白的DNA表达载体，包含编码多肽的分离核酸，所述多肽与选自SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的序列有至少85％氨基酸序列同一性。
18. 一种生产稳定化逆转录酶融合蛋白的方法，包括以下步骤：
(a)培养包含权利要求17的DNA表达载体的宿主细胞；
(b)表达由所述DNA表达载体编码的稳定化逆转录酶融合蛋白；和
(c)从所述宿主细胞中分离所述稳定化逆转录酶融合蛋白。”
驳回决定指出：权利要求1请求保护一种稳定化的逆转录融合蛋白，权利要求1与对比文件1（WO2005/084409A2，公开日期：2005年09月15日）的区别在于：限定了通过刚性接头肽将稳定剂蛋白与热稳定II组内含子衍生的逆转录酶连接，且所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切的。然而对于该区别，使用刚性接头肽连接双功能融合肽的两部分是常规的技术手段，使用蛋白酶可切割或非可切割的连接肽也是常规的选择。在完成多肽的表达纯化后本领域技术人员可根据标签是否影响目的蛋白的所需功能的实际情况确定是否需要进行标签清除的步骤，进一步反过来确定连接肽设计的具体类型，上述过程可通过常规的技术手段实现。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2-12的附加技术特征为本领域的常规技术或被对比文件2（US2008/0118949A1，公开日期：2008年05月22日）公开，因此，权利要求2-12不具备创造性。在其他说明部分中评述了权利要求17-18基于前述评述权利要求1-12的理由以及常规技术也不具备创造性。
申请人得克萨斯系统大学评议会（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年01月23日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的全文替换页（共3页18项），相对于驳回决定所针对的权利要求，修改之处在于：在权利要求1中增加了“其中所述融合蛋白能够以比SuperScriptIII更大的持续合成能力或保真度执行RNA模板的逆转录”。复审请求人认为：对比文件1中优选聚组氨酸标签，仅在一处指出使用pMAL系统，且对比文件1中使用的标签是需要切除的，本领域通常也会将较大的蛋白标签，例如麦芽糖结合蛋白标签，在制备之后去除，而不会保留麦芽糖结合蛋白标签以提高溶解度和稳定性，此外，pMAL系统的接头序列也不属于非切割刚性接头。在本申请之前，本领域技术人员不能预见所述融合蛋白具有显著的活性，不能进行生产。同时提交附件2-13用于说明本申请取得了出乎意料的好结果以及商业上的成功。
附件2：US7670807B2，公开日期2010年03月02日，共29页。
附件3：“Thermostable group II intron reverse transcriptase fusion proteins and their use in cDNA synthesis and next-generation RNA sequencing”，SABINE MOHR等，RNA，第19卷第7期，第958-970页， 2013年。
附件4：US9012183B2，公开日期2015年04月21日。
附件5：“Broad and adaptable RNA structure recognition by the human interferon-induced tetratricopeptide repeat protein IFIT5”，George E. Katibaha等，PNAS，第111卷第33期，第12025-12030页，2014年08月19日。
附件6：“tRNA base methylation identification and quantification Via high-throughput sequencing”，WESLEY C. CLARK等，RNA，第22卷第11期，第1771-1784页，2016年。
附件7：“Base-Resolution Mapping Reveals Distinct m1A Methylome in Nuclear- and Mitochondrial-Encoded Transcripts”，Xianyu Li等，Molecular Cell，第68卷，第993-1005页，2017年12月07日。
附件8：“The m1A landscape on cytosolic and mitochondrial mRNA at single-base resolution”，Modi Safra等，NATURE，第551卷，2017年11月09日，共20页。
附件9：“High-throughput sequencing of human plasma RNA by using thermostable group II intron reverse transcriptases”，YIDAN QIN等，RNA，第22卷第1期，第111-128页，2016年。
附件10：“Broad role for YBX1 in defining the small noncoding RNA composition of exosomes”，Matthew J. Shuttleff等，PNAS，E8987-E8995，2017年10月10日。
附件11：“Enzyme engineering through evolution: Thermostable recombinant group II intron reverse transcriptases provide new tools for RNA research and biotechnology”，KATHLEEN COLLINS等，RNA，第19卷第8期，第1017-1018页，2013年。
附件12：Paul Gold 声明，共2页，2017年12月28日。
附件13：2015-2017年稳定化II组内含子RT销售数据，共6页，2017年12月28日。
复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种稳定化逆转录酶融合蛋白，包含通过刚性接头肽与稳定剂蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的，其中所述稳定剂蛋白是包括50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白，其中所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力或保真度执行RNA模板的逆转录。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月14日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1增加了新的技术特征“所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力或保真度执行RNA模板的逆转录”，而基于原始申请文件的记载，无法直接地、毫无疑义地确定所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的保真度执行RNA模板的逆转录。由此可见，权利要求1的修改超范围，不符合专利法第33条的规定。（2）假设复审请求人克服了权利要求1超范围的缺陷，对假设后的权利要求进行如下评述。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1限定接头肽为刚性非可切割的，所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录。本领域公知，麦芽糖结合蛋白标签等能够增加蛋白稳定性，促进蛋白可溶性和正确折叠，甚至某些融合蛋白已具有相应的生物活性（例如参见公知常识证据1：《基因工程》，张惠展编著，华东理工大学出版社出版，2005年08月出版）；基于本领域的公知常识以及在对比文件2的教导下，本领域技术人员在面对重组II组内含子型逆转录酶的稳定性差、溶解性差、无法正确折叠等技术问题时，其有动机在对比文件1的基础上来构建麦芽糖结合蛋白MBP与相应II组内含子型逆转录酶的融合蛋白载体，并获得相应的融合蛋白。对于本领域技术人员而言，无论所述融合蛋白使用可切割接头还是非切割接头，均能够保持融合状态；此外，对于本领域技术人员而言，在没有限定具体刚性接头序列以及相应融合蛋白的序列的前提下，无论是刚性接头还是传统的柔性接头都是本领域已知的，本领域技术人员可根据需要常规选择，且由此获得具有逆转录活性的溶解度提高的II组内含子型逆转录酶融合蛋白也是容易实现的。至于技术效果方面，基于本申请所验证的技术效果，无法确定该权利要求1中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2-12所述酶、稳定剂蛋白、接头的选择均属于本领域可常规选择的范围，所述耐高温以及高保真活性所对应的融合蛋白没有经过具体的试验验证，且基于本申请所验证的技术效果，无法确定权利要求2-12中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。因此，权利要求2-12也不具备创造性。权利要求13所述的方法属于本领域的常规技术。因此，在权利要求1所述的逆转录酶融合蛋白不具备创造性的前提下，该权利要求13也不具备创造性。基于对比文件1的公开以及本领域的公知常识，权利要求14也不具备创造性。基于对权利要求3、6、11的评述，权利要求15-16也不具备创造性。基于权利要求1的评述理由，以及本申请所验证的技术效果，无法确定该权利要求17中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。因此，权利要求17不具备创造性。权利要求18所述方法属于本领域的常规技术，且对比文件2也公开了上述步骤。因此，权利要求18也不具备创造性。
复审请求人于2019年03月20日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书的全文替换页，相对于复审通知书所针对的权利要求，修改之处在于：删除权利要求1有关“保真度”的技术特征；在权利要求13中增加技术特征“其中所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录”。复审请求人认为：（1）II组内含子RTs与其协同进化的内含子RNA模板紧密结合，妨碍了II组内含子RTs在商业上的应用，请求人通过生产与包括50个或更多氨基酸的稳定剂蛋白的融合蛋白的II组内含子衍生的RT解决了上述问题。为了反映应保留稳定剂蛋白，请求本申请记载了刚性的、非可切割的接头。该解决方案是非显而易见的。尽管对比文件1表明麦芽糖结合蛋白可用于纯化II组内含子RT，但其从未实际生产该蛋白，且其在实际工作中使用较短的聚组氨酸标签以及其提示应该去除较大的标签的教导清楚地背离了在最终产物中保留包括50个或更多氨基酸的稳定剂蛋白。提供附件14用于阐述本领域生产II组内含子RTs存在的技术问题。提供附件17说明虽然现有技术通常已知可去除的麦芽糖结合蛋白标签可增加纯化期间的蛋白溶解度和稳定性，但是附件15以及附件16的作者Lampson博士和Bergquist博士也不认为永久附着的稳定剂蛋白如麦芽糖结合蛋白的使用是显而易见的。（2）对比文件1中描述的技术方案仅仅能够生成非常小且相对无活性的II组内含子RT。然而，本发明人已证实作为稳定化的逆转录酶融合蛋白表达的II组内含子逆转录酶可以以即使在不含紧密结合的RNA时也保持可溶和有活性的形式大量且高活性地进行纯化，且其适合于多种逆转录酶应用。本发明人证实这些热稳定的II组内含子逆转录酶融合蛋白具有比SuperScriptIII高的持续合成能力和保真度，获得了预料之外的效果。（3）权利要求中所述的II组内含子衍生的逆转录酶(RT)是本领域技术人员众所周知的，且详细记载于本申请说明书第14页第16行-第16页第25行。数百个编码II组内含子逆转录酶的可读框已通过细菌、古细菌和细胞器(线粒体和叶绿体)基因组的测序进行鉴定，根据其氨基酸序列进行比对，并汇编入数据库（附件18）；并提供附件19-22用于阐述II组内含子RT的结构域、晶体结构等，用于阐明在整个II组内含子RTs中有助于其活性且特别是有助于其高持续合成能力和保真度的关键保守氨基酸残基和结构特征。本申请技术问题和解决方案两者都不涉及个别II组内含子衍生的RT的特性，所以本领域技术人员能够合理预期请求保护的融合蛋白具有预期的持续合成能力。此外，如果某些II组内含子衍生的RT融合蛋白不具有预期的活性，那么其不在权利要求的范围内。复审请求人认为所述权利要求范围内的融合蛋白将具有所宣称的技术效果。
附件14：“Enzyme engineering through evolution: Thermostable recombinant group II intron reverse transcriptases provide new tools for RNA research and biotechnology”，KATHLEEN COLLINS等，RNA，第19卷第8期，第1017-1018页，2013年。
附件15：“A Group II Intron-Type Open Reading Frame from the Thermophile Bacillus (Geobacillus) stearothermophilus Encodes a Heat-Stable Reverse Transcriptase”，Jaishree Vellore等，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，第70卷第12期，第7140–7147页,2004。
附件16：“Reverse transcriptases: Intron-encoded proteins found in thermophilic bacteria”，Bernie Ng等，Gene，第393卷，第137–144页,2007。
附件17：“Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused”，RACHEL B. KAPUST等，Protein Science，第8卷，第1668–1674页,1999。
附件18：“Database for bacterial group II introns”，Manuel A. Candales等，Nucleic Acids Research，第40卷，第187-190页,2012。
附件19：“Domain structure and three-dimensional model of a group II intron-encoded reverse transcriptase”，FORREST J.H. BLOCKER等，RNA，第11卷，第14-28页,2005。
附件20：“Group II Introns: Mobile Ribozymes that Invade DNA”，Alan M. Lambowitz等，Cold Spring Harb Perspect Biol，第3卷，a003616，2011。
附件21：“A Group II Intron-encoded Maturase Functions Preferentially In Cis and Requires Both the Reverse Transcriptase and X Domains to Promote RNA Splicing”，Xiaoxia Cui等，J. Mol. Biol. ，第340卷，第211–231页，2004。
附件22：“Structure of a Thermostable Group II Intron Reverse Transcriptase with Template-Primer and Its Functional and Evolutionary Implications”，Jennifer L. Stamos等，Molecular Cell，第68卷，第926–939页，2017。
新修改的权利要求1、13如下：
“1. 一种稳定化逆转录酶融合蛋白，包含通过刚性接头肽与稳定剂蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的，其中所述稳定剂蛋白是包括50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白，其中所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录。”
“13. 一种从RNA分子制备cDNA的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将引物核苷酸序列加入RNA分子中
(b)在足以合成与所述RNA分子的全部或部分互补的cDNA分子的条件下，在一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸或双脱氧核糖核苷三磷酸和包含通过刚性接头肽与具有50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶的稳定化逆转录酶融合蛋白存在下孵育所述RNA分子，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的，且其中所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时，提交了权利要求书全文替换页（共3页18项）。经审查，其修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定通知书针对的审查文本为：2011年11月01日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要，摘要附图，说明书第1-2、4-14、17-21、23-41页，说明书附图第1-24页；2014年05月21日提交的说明书第3、15、16、22页；2019年03月20日提交的权利要求第1-18项。
有关专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护一种稳定化逆转录酶融合蛋白，包含通过刚性接头肽与稳定剂蛋白连接的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶，所述刚性接头肽是通过蛋白酶非可切割的，其中所述稳定剂蛋白是包括50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白，其中所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录。
对比文件1公开了一种来自嗜热脂肪芽孢杆菌的逆转录酶Tirt，该逆转录酶是II组内含子型逆转录酶，在75℃还能保持活性（参见对比文件1摘要，权利要求1）；还公开了能够使用利用麦芽糖结合蛋白融合促进纯化的pMAL系统来表达和纯化该逆转录酶（参见对比文件1说明书第17页第1段）；其中pMAL系统包含了融合麦芽糖结合蛋白和II组内含子型逆转录酶的接头肽。由此可见，对比文件1实质上公开了能够将麦芽糖结合蛋白（稳定剂蛋白的下位概念）和来自嗜热脂肪芽孢杆菌的II组内含子型逆转录酶Tirt（一种具体的热稳定II组内含子衍生的逆转录酶）通过接头肽融合。
权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：权利要求1限定接头肽为刚性非可切割的，所述融合蛋白能够以比SuperScript III更大的持续合成能力执行RNA模板的逆转录。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1技术方案所要解决的技术问题是：提供一种II组内含子型逆转录酶融合蛋白。
本领域公知，麦芽糖结合蛋白标签等能够增加蛋白稳定性，促进蛋白可溶性和正确折叠，甚至某些融合蛋白已具有相应的生物活性（例如参见公知常识证据1）；此外，对比文件2公开了一种细胞内生产核酸酶的方法，并公开了提供融合形式的核酸酶，即麦芽糖结合蛋白MBP与核酸酶的融合蛋白，能够降低核酸酶的毒性，使其能够以可溶形式和高表达水平捕获在宿主细胞的细胞质中，然后可以通过直链淀粉亲和层析用简单的纯化步骤从裂解的细胞中纯化融合蛋白；并具体公开了使用载体pMAL-c2X来制备该融合蛋白（参见对比文件2说明书第29-31、56段）。在以上公知常识以及对比文件2的教导下，本领域技术人员在面对重组II组内含子型逆转录酶的稳定性差、溶解性差、无法正确折叠等技术问题时，其有动机在对比文件1的基础上来构建麦芽糖结合蛋白MBP与相应II组内含子型逆转录酶的融合蛋白载体，并获得相应的融合蛋白。对于本领域技术人员而言，无论所述融合蛋白使用可切割接头还是非切割接头，在没有人为提供相应切割试剂的情况下，两种融合蛋白均不会被切割，即均能够保持融合状态；此外，对于本领域技术人员而言，在没有限定具体刚性接头序列以及相应融合蛋白的序列的前提下，无论是刚性接头还是传统的柔性接头都是本领域已知的，本领域技术人员可根据需要常规选择，且由此获得具有逆转录活性的溶解度提高的II组内含子型逆转录酶融合蛋白也是容易实现的。至于技术效果方面，本申请实施例中验证了SEQ ID NO.6-10所示的具体II组内含子型逆转录酶融合蛋白以及LtrA及其融合蛋白在高温下的酶活性，通过图11所示LtrA及其融合蛋白和GsI1RF的数据可见，并非所有的II组内含子型逆转录酶经过融合后都能够实现耐高温高活性的效果；还验证了SEQ ID NO.6、10所示融合蛋白与SuperScript III相比，在不同温度下进行逆转录的情况，以及SEQ ID NO.6所示融合蛋白与SuperScript III相比，两者的持续合成能力比较；还验证了不同接头对融合蛋白活性的影响等，且通过图13A能够看出并非任意的刚性接头都能够起到比柔性接头预料之外的技术效果。由于不同菌种来源、甚至同一菌种不同菌株来源的II组内含子型逆转录酶的序列和性质均存在不同，其与麦芽糖结合蛋白MBP在任意刚性非可切割接头融合后，是否能够产生比SuperScript III更大的持续合成能力等技术效果是无法确定的。因此，基于本申请所验证的技术效果，无法确定该权利要求1中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。
由此可见，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及公知常识、常规技术以获得该权利要求所要求保护的技术方案，对所属技术领域的技术人员而言是显而易见的，该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-12对酶的来源、具有95%同一性的酶序列和融合蛋白序列、稳定剂蛋白的类型以及修饰和结构、接头的组成、耐高温以及高保真情况进行了限定，由于上述酶、稳定剂蛋白、接头的选择均属于本领域可常规选择的范围，所述耐高温以及高保真活性所对应的融合蛋白没有经过具体的试验验证，且基于本申请所验证的技术效果，无法确定权利要求2-12中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。因此，结合对权利要求1的评述可知，权利要求2-12也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求13请求保护一种从RNA分子制备cDNA的方法。对于本领域技术人员而言，在RNA逆转录cDNA的方法中，将引物加入RNA分子中，以及在足以合成与所述RNA分子的全部或部分互补的cDNA分子的条件下，在一种或多种脱氧核糖核苷三磷酸或双脱氧核糖核苷三磷酸和逆转录酶存在的条件下孵育所述RNA分子，进行逆转录，属于本领域的常规技术手段。因此，在权利要求1所述的逆转录酶融合蛋白不具备创造性的前提下，该权利要求13所述的方法也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
如前所述，对比文件1公开了Tirt在75℃还能保持活性，因此，构建融合蛋白获得能够耐受一定高温的逆转录酶融合蛋白是显而易见的，在高温反应条件下，减少RNA的二级或三级结构也属于本领域的公知常识。因此，权利要求14也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
基于上述对权利要求3、6、11的评述，权利要求15-16也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求17请求一种用于生产稳定化逆转录酶融合蛋白的DNA表达载体，基于权利要求1的评述理由，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2和公知常识、常规技术获得麦芽糖结合蛋白与II组内含子型逆转录酶通过接头连接的具有逆转录活性且可溶性提高的融合蛋白是很容易做到的，此外，基于本申请所验证的技术效果，无法确定该权利要求17中所涵盖的所有融合蛋白均具有耐高温、高活性、持续合成能力、高保真等不可预期的技术效果。因此，将权利要求17所述的核酸来构建表达载体用于生产逆转录酶融合蛋白是显而易见的。权利要求17不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求18请求保护一种生产稳定化逆转录酶融合蛋白的方法，对于本领域技术人员而言，将融合蛋白表达载体导入宿主细胞，培养细胞，通过表达载体来表达目的融合蛋白，从宿主中分离所述融合蛋白，以上均属于本领域的常规技术，且对比文件2也公开了上述步骤（参见对比文件2实施例1-2）。由此可见，在权利要求17不具备创造性的前提下，该权利要求18也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
合议组认为：（1）如前所述，本领域公知麦芽糖结合蛋白标签等能够增加蛋白稳定性，促进蛋白可溶性和正确折叠，甚至某些融合蛋白已具有相应的生物活性（例如参见公知常识证据1）。且对比文件1实施例中也说明了在不影响蛋白活性的情况下，也可以选择不去除标签（参见说明书第26页第1段），也证实了带有his标签的融合蛋白具有酶活性，不用去除（参见说明书实施例2）。由此可见，虽然现有技术使用麦芽糖结合蛋白等标签时，通常选择在制备之后将标签去除，但是也不排除在其不影响融合蛋白生物活性时，选择不去除标签；且基于麦芽糖结合蛋白标签的功能，制备获得溶解度提高的融合蛋白也是显而易见的。此外，无论该融合蛋白所使用的接头是否为非切割，在没有切割试剂存在的情况下，均能够起到连接的作用；接头是否为刚性，也不会对融合蛋白的活性产生决定性的作用（参见本申请图13A）。（2）复审请求人所提交的附件14以及附件15-16的作者肯定了请求人的某些成果，但是并不能依此认定权利要求1-18概括的所有技术方案均具备创造性。本申请实施例中验证了SEQ ID NO.6-10所示的具体II组内含子型逆转录酶融合蛋白以及LtrA及其融合蛋白在高温下的酶活性，通过图11所示LtrA及其融合蛋白和GsI1RF的数据可见，并非所有的II组内含子型逆转录酶经过融合后都能够实现耐高温高活性的效果；还验证了SEQ ID NO.6、10所示融合蛋白与SuperScript III相比，在不同温度下进行逆转录的情况，以及SEQ ID NO.6所示融合蛋白与SuperScript III相比，两者的持续合成能力比较；还验证了不同接头对融合蛋白活性的影响等，且通过图13A能够看出并非任意的刚性接头都能够起到比柔性接头预料之外的技术效果。由于不同菌种来源、甚至同一菌种不同菌株来源的II组内含子型逆转录酶的序列和性质均存在不同，其与麦芽糖结合蛋白MBP在任意刚性非可切割接头融合后，是否能够产生比SuperScript III更大的持续合成能力等技术效果是无法确定的。虽然附件18-22对II组内含子RTs的结构域、晶体结构等进行了阐述，但是仅仅基于上述信息，结合申请日之前所完成的工作以及说明书中所记载的技术效果，无法得出所有的II组内含子RTs与包括50个或更多氨基酸的亲和蛋白或溶解度增加蛋白所构建的融合蛋白均具有比SuperScript III更大的持续合成能力。在不经过具体实验的前提下也不能确定具体有哪些融合蛋白可以达到预期的技术效果。即无法认定权利要求1-18所述的技术方案取得了意料之外的技术效果。由此可见，请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年10月10日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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