发明创造名称：容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体
外观设计名称：
决定号：185451
决定日：2019-07-23
委内编号：1F247611
优先权日：2009-06-26
申请（专利）号：201410072042.6
申请日：2010-06-25
复审请求人：瑞泽恩制药公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：唐慧
合议组组长：何睿
参审员：贾涛
国际分类号：C07K16/46
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到所述最接近的现有技术中以解决其技术问题的技术启示，则认为该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点，也就不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410072042.6，名称为“容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体”的发明专利申请。该申请是2010年06月25日申请、申请号为201080032565.8、名称为“容易地分离的具有天然免疫球蛋白形式的双特异性抗体”的发明专利申请的分案申请，申请人为瑞泽恩制药公司，优先权日为2009年06月26日。分案提交日为2014年02月28日，公开日为2014年06月04日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年12月11日以权利要求1-41不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年02月28日分案申请递交日提交的说明书第1-12、23-194段（即第1-3、5-42页）、说明书摘要、说明书附图图1-图10、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2017年07月19日提交的说明书第13-22段（即第4页），权利要求第1-41项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 制备包含Fc的抗原结合蛋白的方法，所述包含Fc的抗原结合蛋白包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述Fc相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包括：
a.让哺乳动物细胞表达抗原结合蛋白，其包含：
包含识别第一表位的第一可变结构域的第一免疫球蛋白重链，其中所述第一免疫球蛋白重链包含第一CH3区的免疫球蛋白恒定区，该第一CH3区为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3区，其中所述第一CH3区与A蛋白结合；
包含识别第二表位的第二可变结构域的第二免疫球蛋白重链，其中所述第二免疫球蛋白重链包含第二CH3区的免疫球蛋白恒定区，该第二CH3区为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3区，其中所述第二CH3区中包含根除或减少与A蛋白的结合的修饰；
与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链；和
b.使用A蛋白将所述抗原结合蛋白分离。
2. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链是人IgG重链。
3. 权利要求2的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链是人IgG1重链。
4. 权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白轻链为人免疫球蛋白轻链。
5. 权利要求1的方法，其中所述修饰选自IMGT外显子编号系统中的(a)95R，和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a’)435R，和(b’)435R和436F。
6. 权利要求5的方法，其中所述第二CH3区还包含1至5个选自下列的修饰：IMGT编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或者EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
7. 权利要求1的方法，其中相比于缺乏所述修饰的相应的抗原结合蛋白，所述修饰不改变所述抗原结合蛋白的血清半寿期。
8. 权利要求5的方法，其中所述抗原结合蛋白的第二CH3区在人中是非免疫原性的。
9. 权利要求1的方法，其中所述细胞选自以下组：CHO细胞，COS细胞，293细胞，Hela细胞，昆虫细胞，和视网膜细胞。
10. 权利要求9的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
11. 权利要求1的方法，其中在包含A蛋白的固体支持物上分离所述抗原结合蛋白。
12. 权利要求11的方法，其中所述固体支持物包括A蛋白亲和柱，并且使用pH梯度来分离所述抗原结合蛋白。
13. 权利要求12的方法，其中所述pH梯度为包含一个或多个位于pH 3和pH 5之间的pH阶梯的阶梯式梯度。
14. 权利要求13的方法，其中所述抗原结合蛋白在pH3.9到pH4.4之间洗脱。
15. 权利要求14的方法，其中所述抗原结合蛋白在pH4.2洗脱。
16. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链分别由第一和第二核酸编码，其中所述第一和第二核酸各自从基因改造的小鼠获得。
17. 权利要求16的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一个或多个人重链可变区核酸序列。
18. 权利要求1的方法，其中所述细胞引入
(a)编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸；
(b)编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸；
(c)编码与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链的第三核酸。
19. 权利要求18的方法，其中使用载体或携带所述核酸的病毒将所述第一，第二和第三核酸引入所述细胞。
20. 权利要求19的方法，其中
(a)所述第一和第二核酸在同一个载体或病毒上；
(b)所述第一和第三核酸在同一个载体或病毒上；或
(c)所述第一，第二和第三核酸在同一个载体或病毒上。
21. 分离包含Fc的抗原结合蛋白的方法，所述包含Fc的抗原结合蛋白包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述Fc相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包含步骤：
将破裂的细胞或抗原结合蛋白混合物与A蛋白亲和支持物接触，并且
在离子改性剂存在下，用pH梯度洗脱抗原结合蛋白，其中所述洗脱的抗原结合蛋白包括第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋 白重链，所述第一免疫球蛋白重链包括修饰的并表现出与A蛋白结合减少或根除的第一CH3区，所述第二免疫球蛋白重链包括与A蛋白结合的第二CH3区。
22. 制备包含Fc的抗原结合蛋白的方法，所述包含Fc的抗原结合蛋白包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述Fc相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包括：
a.培养细胞，所述细胞包含：
(i)第一核酸，其编码包含识别第一表位的第一可变结构域的第一免疫球蛋白重链，其中所述第一免疫球蛋白重链包含第一CH3区的免疫球蛋白恒定区，该第一CH3区为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3区，其中所述第一CH3区与A蛋白结合；
(ii)第二核酸，其编码包含识别第二表位的第二可变结构域的第二免疫球蛋白重链，其中所述第二免疫球蛋白重链包含第二CH3区的免疫球蛋白恒定区，该第二CH3区为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3区，其中所述第二CH3区中包含根除或减少与A蛋白的结合的修饰；
(iii)第三核酸，其编码与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链；
在允许所述细胞表达所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述免疫球蛋白轻链以产生所述抗原结合蛋白的条件下培养所述 细胞，其中所述抗原结合蛋白相对于A蛋白结合为异源二聚的；和
b.使用A蛋白将抗原结合蛋白从所述细胞中分离。
23. 权利要求22的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链是人IgG重链。
24. 权利要求23的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链是人IgG1重链。
25. 权利要求22的方法，其中所述免疫球蛋白轻链为人免疫球蛋白轻链。
26. 权利要求22的方法，其中所述修饰选自IMGT外显子编号系统中的(a)95R，和(b)95R和96F，或者EU编号系统中的(a’)435R，和(b’)435R和436F。
27. 权利要求26的方法，其中所述第二CH3区还包含1至5个选自下列的修饰：IMGT编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或者EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
28. 权利要求22的方法，其中相比于缺乏所述修饰的相应的抗原结合蛋白，所述修饰不改变所述抗原结合蛋白的血清半寿期。
29. 权利要求26的方法，其中所述抗原结合蛋白的第二CH3区在人中是非免疫原性的。
30. 权利要求22的方法，其中所述细胞选自以下组：CHO细胞，COS细胞，293细胞，Hela细胞，昆虫细胞，和视网膜细胞。
31. 权利要求30的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
32. 权利要求22的方法，其中在包含A蛋白的固体支持物上分离所述抗原结合蛋白。
33. 权利要求32的方法，其中所述固体支持物包括A蛋白亲和柱，并且使用pH梯度来分离所述抗原结合蛋白。
34. 权利要求33的方法，其中所述pH梯度为包含一个或多个位于pH 3和pH 5之间的pH阶梯的阶梯式梯度。
35. 权利要求34的方法，其中所述抗原结合蛋白在pH3.9到pH4.4之间洗脱。
36. 权利要求35的方法，其中所述抗原结合蛋白在pH4.2洗脱。
37. 权利要求22的方法，其中所述第一和第二核酸各自从基因改造的小鼠获得。
38. 权利要求37的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一个或多个人重链可变区核酸序列。
39. 权利要求22的方法，其中使用载体或携带所述核酸的病毒将所述第一，第二和第三核酸引入所述细胞。
40. 权利要求39的方法，其中
(a)所述第一和第二核酸在同一个载体或病毒上；
(b)所述第一和第三核酸在同一个载体或病毒上；或
所述第一，第二和第三核酸在同一个载体或病毒上。
41. 权利要求1-20和22-40中任一项的方法，其中使用A蛋白将所述抗原结合蛋白分离还包括在离子改性剂的存在下使用pH梯度。”
驳回决定指出：权利要求1请求保护制备包含Fc的抗原结合蛋白的方法，其与对比文件4（US6165745A，公开日：2000年12月26日）公开的技术内容相比，区别特征在于：抗体结构不同，权利要求1通过对抗体CH3区进行突变，导致抗体对蛋白A亲和性发生改变。基于该区别特征，本发明实际解决的技术问题是提供另一种通过抗体结构突变影响抗体对蛋白A亲和力变化的机制从而纯化抗体的方法。对比文件2（“Engineering of Fc1 and Fc3 from human immunoglobulin G to analyse subclass specificity for staphylococcal protein A”，Jendeberg 等，Journal of Immunological Methods，第201卷，第25-34页，公开日：1997年12月31日）公开了对人类免疫球蛋白Fc区域改造使得IgG1减少结合葡萄球菌蛋白A（SPA），R435和F436替代的CH3抑制或降低检测SpA的结合，还公开了增加取代氨基酸356E和358M（见第30页的第3.1节）。因此，对比文件2给出了通过对抗体CH3区进行突变来改变对比文件1中抗体对蛋白A亲和性从而纯化抗体的启示。在对比文件4和对比文件2的基础上获得权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于同样的理由，权利要求21、22也不具备创造性。从属权利要求2-20、23-41的附加技术特征或被对比文件4和对比文件2公开，或是本领域常规技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，这些权利要求也不具备创造性。
申请人瑞泽恩制药公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年03月26日向国家知识产权局提出了复审请求，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）驳回决定存在程序问题。案由称US5945311为对比文件1，US6165745为对比文件4，驳回理由中认为与对比文件4相比本申请不具备创造性，但描述的却是对比文件1和对比文件3公开的内容，即驳回决定内容不一致。此外，驳回决定之前的第四次审查意见通知书中以对比文件4评述了创造性，驳回决定中增加引用了对比文件2，对于对比文件4结合对比文件2的评述，没有给予复审请求人陈述本申请相对于该组合具有创造性的机会，不符合听证原则。（2）对比文件4是基于对蛋白A亲和力的“天然差异”来纯化双特异性抗体，如大鼠除IgG2c外的IgG抗体不结合蛋白A，而小鼠IgG抗体结合蛋白A，则将具有一种特异性的小鼠杂交瘤与具有另一种特异性的大鼠杂交瘤融合，产生具有一个大鼠重链和一个小鼠重链的双特异性“四联体”，其对蛋白A具有不同的亲和力。或者利用人IgG3（不结合蛋白A）与人IgG1，IgG2a和IgG2b亚型的蛋白A的结合差异，通过组合获得天然蛋白A差异的抗体，但其中全部使用人IgG3 CH2-CH3恒定区，不是对IgG1，IgG2a和IgG2b进行修饰。对比文件4的抗体具有高免疫原性的缺陷。尽管本领域存在多种替代途径，但对比文件4结合对比文件2却是“事后诸葛亮”——对比文件4没有提及“序列修饰”，对比文件2研究的是蛋白A与细菌产生的同源二聚体片段之间的相互作用，没有提及抗体，更不涉及双特异性抗体。而且基于对比文件4的大鼠/小鼠四源杂交瘤的实验，对比文件2的在含部分铰链区和CH2、CH3结构域但缺乏抗原结合区的Fc片段上进行的同源二聚体的实验，不能预期到改变蛋白A亲和力的序列修饰方法能否有效分离完整的、异源二聚体，因此本领域技术人员不会将对比文件4与对比文件2进行结合。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）对比文件1和4序号错误并不影响驳回决定的实质内容；在最后一次（第四次）审查意见通知书已经引用了对比文件4和对比文件2，并对本申请的创造性进行评述，基于本申请不具备授权前景，为节约程序而进行驳回，驳回的事实、理由和证据并无改变；（2）本申请实际解决的技术问题是提供另一种通过抗体结构突变从而影响抗体对蛋白A亲和力变化的机制从而纯化抗体的方法。对比文件4公开了一种制备异源化双特异性抗体的方法，并具体公开了将异源二聚体培养上清液在将蛋白A作为功能基团的结合柱中滤过，用pH梯度以洗脱异源二聚体，而对比文件2给出了将通过对抗体CH3区进行突变来改变对比文件4中抗体对蛋白A亲和性从而纯化抗体的启示。在对比文件2的教导下，本领域技术人员容易想到采用对比文件2中通过抗体CH3区结构突变的方法，从而影响对比文件4中抗体对蛋白A的亲和力，从而将异源化双特异性抗体分离纯化出来，申请人的意见陈述不具备说服力，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月16日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1要求保护的技术方案与对比文件4公开的内容相比，区别特征在于：权利要求1限定第二抗体重链包含的CH3区包含根除或减少与A蛋白的结合的修饰，而对比文件4的第二抗体为不与A蛋白结合的人或人源化的IgG3。由于对比文件4与本申请的方法均是基于双特异性抗体与A蛋白的亲和性差异达到分离纯化的目的，而本申请不能证明相对于对比文件4具有更好的分离效果，因此确定权利要求1实际解决的技术问题是提供另一种制备与A蛋白亲和性具有差异的异源双特异性抗体的方法并利用所述差异实现对所述双特异性抗体的分离纯化。对比文件4除了公开上述内容外，还公开了与A蛋白结合的位点在CH2和CH3区域之间。对比文件2则给予了将结合A蛋白的IgG1上某些位点替换为不结合A蛋白的IgG3相应氨基酸可以改变抗体结合A蛋白能力的技术启示，在对比文件4的基础上，本领域技术人员得到权利要求1要求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于类似的理由，权利要求21、22也不具备创造性。权利要求1的直接或间接从属权利要求2-20、41，权利要求21的直接或间接从属权利要求23-41的附加技术特征或被对比文件4和对比文件2公开，或为本领域常规技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2-20、23-41也不具备创造性。此外，驳回决定案由部分将对比文件1指称为US5945311A，将对比文件4指称为US6165745A只是行文错误，由于审查过程中引用的对比文件均已告知过复审请求人，其内容复审请求人应当悉知，上述行文错误不会导致事实认定与历次的审查意见有所不同。对比文件2公开了从属权利要求的附加技术特征，前审过程中用以评述从属权利要求，驳回决定结合该对比文件用以评述权利要求1并不违反听证原则。
复审请求人于2019年04月26日提交了意见陈述书和权利要求书全文替换页（共11页51项）。相对于驳回决定针对的文本，所做修改在于：将原权利要求1、21、22中所述“包含Fc的抗原结合蛋白”修改为“人的双特异性抗体”，进一步限定第二CH3结构域中的修饰，增加技术特征“其中相比于在所述第二CH3结构域缺乏所述修饰的相应的抗体，所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变”；原权利要求1、8、11、12、14、15、29、32、33、35、36、41中的“抗原结合蛋白”修改为“双特异性抗体”；原权利要求1、6、8、21、22、27、29中的 “CH3区”修改为“CH3结构域”；原权利要求2、23中的“IgG”修改为“IgG4”；删除原权利要求4、5、7、25、26、28，增加权利要求4-6、21、23-30、34-36、50；修改原权利要求3、24的引用关系，适应性修改权利要求的序号。复审请求人同时提交了如下证据：
证据1：“Stability of IgG isotypes in serum”，Ivan R.Correia，mAbs，第2卷，第3期，第221-232页，2010年5/6月，英文，复印件，共12页；
证据2：“High Resolution Mapping of the Binding Site on Human IgG1 for FcγRI，FcγRII，FcγRIII，and FcRn and Design of IgG1 Variants with Improved Binding to the FcγR”，Robert L等，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，第276卷，第9期，2001年03月02日，第6591-6604页，英文，复印件，共14页。
复审请求人认为：（1）对比文件2和4没有教导修改后的权利要求1中所述的第二CH3结构域的具体修饰，并提供证据证明可以合理预期所述修饰产生的对蛋白A的亲和力差别足以使双特异性抗体与其同源二聚体的对应物分离。（2）证据1认为人IgG3半寿期短，不用于治疗性抗体；证据2指出对I253、S254、H435或Y436的修饰可以消除人IgG1与FcRn的结合而减少血清半寿期，因此本领域技术人员不会有动机修饰IgG1、IgG2或IgG4的H435，或Y436残基，也不能预期改变后半寿期没有改变。而本申请实施例9证明，与野生型IgG1抗体相比，H435R和Y436F修饰的人IgG1的双特异性抗体半寿期没有显著差异。由此也可以合理扩展至IgG1、IgG2或IgG4中的任何一种抗体。综上，修改后的权利要求具有创造性。
修改后的权利要求书如下：
“1. 制备人的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述双特异性抗体相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包括：
a.让哺乳动物细胞表达双特异性抗体，其包含：
包含识别第一表位的第一可变结构域的第一免疫球蛋白重链，其中所述第一免疫球蛋白重链包含第一CH3结构域，该第一CH3结构域为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，其中所述第一CH3结构域与A蛋白结合；
包含识别第二表位的第二可变结构域的第二免疫球蛋白重链，其中所述第二免疫球蛋白重链包含第二CH3结构域，该第二CH3结构域为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，其中所述第二CH3结构域中包含减少或根除所述第二CH3结构域与A蛋白的结合的修饰，所述修饰为IMGT外显子编号系统中的(a)95R修饰或(b)95R和96F修饰，或者EU编号系统中的(a’)435R修饰或(b’)435R和436F修饰；
与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链；和
b.使用A蛋白将所述双特异性抗体分离，
其中相比于在所述第二CH3结构域缺乏所述修饰的相应的抗体，所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变。
2. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG4重链。
3. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG1重链。
4. 权利要求1的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
5. 权利要求1的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
6. 权利要求1的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
7. 权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述第二CH3结构域还包含1至5个选自下列的修饰：IMGT编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和82I，或者EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
8. 权利要求1的方法，其中所述双特异性抗体的所述第二CH3结构域在人中是非免疫原性的。
9. 权利要求1的方法，其中所述细胞选自以下组：CHO细胞，COS细胞，293细胞，Hela细胞，昆虫细胞，和视网膜细胞。
10. 权利要求9的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
11. 权利要求1的方法，其中在包含A蛋白的固体支持物上分离所述双特异性抗体。
12. 权利要求11的方法，其中所述固体支持物包括A蛋白亲和柱，并且使用pH梯度来分离所述双特异性抗体。
13. 权利要求12的方法，其中所述pH梯度为包含一个或多个位于pH3和pH5之间的pH阶梯的阶梯式梯度。
14. 权利要求13的方法，其中所述双特异性抗体在pH3.9到pH4.4之间洗脱。
15. 权利要求14的方法，其中所述双特异性抗体在pH4.2洗脱。
16. 权利要求1的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链分别由第一和第二核酸编码，并且所述第一和第二核酸各自从基因改造的小鼠获得。
17. 权利要求16的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一个或多个人重链可变区核酸序列。
18. 权利要求1的方法，其中所述细胞引入
(a)编码所述第一免疫球蛋白重链的第一核酸；
(b)编码所述第二免疫球蛋白重链的第二核酸；以及
(c)编码与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链的第三核酸。
19. 权利要求18的方法，其中使用载体或携带所述核酸的病毒将所述第一，第二和第三核酸引入所述细胞。
20. 权利要求19的方法，其中
(a)所述第一和第二核酸在同一个载体或病毒上；
(b)所述第一和第三核酸在同一个载体或病毒上；或
(c)所述第一，第二和第三核酸在同一个载体或病毒上。
21. 权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体是治疗性双特异性抗体。
22. 分离人的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述双特异性抗体相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包含步骤：
将破裂的细胞或抗原结合蛋白混合物与A蛋白亲和支持物接触，并且
在离子改性剂存在下，用pH梯度洗脱双特异性抗体，其中所述洗脱的双特异性抗体包括第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链，所述第一免疫球蛋白重链包括与A蛋白结合的第一CH3结构域，所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包含减少或根除所述第二CH3结构域与A蛋白的结合的修饰，所述修饰为IMGT外显子编号系统中的(a)95R修饰或(b)95R和96F修饰，或者EU编号系统中的(a’)435R修饰或(b’)435R和436F修饰，
其中相比于在所述第二CH3结构域缺乏所述修饰的相应的抗体，所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变。
23. 权利要求22的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG4重链。
24. 权利要求22的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG1重链。
25. 权利要求22的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
26. 权利要求22的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
27. 权利要求22的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
28. 权利要求22至27中任一项所述的方法，其中所述第二CH3结构域还包含1至5个选白下列的修饰：IMGT编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和821，或者EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
29. 权利要求22的方法，其中所述双特异性抗体的所述第二CH3结构域在人中是非免疫原性的。
30. 权利要求22至29中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体是治疗性双特异性抗体。
31. 制备人的双特异性抗体的方法，所述双特异性抗体包括修饰的CH3结构域和未修饰的CH3结构域，以使得所述双特异性抗体相对于A蛋白结合是异源二聚的，所述方法包括：
a.培养细胞，所述细胞包含：
(i)第一核酸，其编码包含识别第一表位的第一可变结构域的第一免疫球蛋白重链，其中所述第一免疫球蛋白重链包含第一CH3结构域，该第一CH3结构域为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，其中所述第一CH3结构域与A蛋白结合；
(ii)第二核酸，其编码包含识别第二表位的第二可变结构域的第二免疫球蛋白重链，其中所述第二免疫球蛋白重链包含第 二CH3结构域，该第二CH3结构域为选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，其中所述第二CH3结构域中包含减少或根除所述第二CH3结构域与A蛋白的结合的修饰，所述修饰为IMGT外显子编号系统中的(a)95R修饰或(b)95R和96F修饰，或者EU编号系统中的(a’)435R修饰或(b’)435R和436F修饰；
(iii)第三核酸，其编码与所述第一和第二免疫球蛋白重链配对的免疫球蛋白轻链；
在允许所述细胞表达所述第一和第二免疫球蛋白重链和所述免疫球蛋白轻链以产生所述双特异性抗体的条件下培养所述细胞，其中所述双特异性抗体相对于A蛋白结合为异源二聚的；和
b.使用A蛋白将所述双特异性抗体从所述细胞中分离，
其中相比于在所述第二CH3结构域缺乏所述修饰的相应的抗体，所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变。
32. 权利要求31的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG4重链。
33. 权利要求31的方法，其中所述第一和第二免疫球蛋白重链均是人IgG1重链。
34. 权利要求31的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
35. 权利要求31的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
36. 权利要求31的方法，其中所述第一免疫球蛋白重链包括第一CH3结构域，所述第一CH3结构域包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列，并且所述第二免疫球蛋白重链包括第二CH3结构域，所述第二CH3结构域包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
37. 权利要求31至36中任一项所述的方法，其中所述第二CH3结构域还包含1至5个选自下列的修饰：IMGT编号系统中的16E、18M、44S、52N、57M和821，或者EU编号系统中的356E、358M、384S、392N、397M和422I。
38. 权利要求31的方法，其中所述双特异性抗体的所述第二CH3结构域在人中是非免疫原性的。
39. 权利要求31的方法，其中所述细胞选自以下组：CHO细胞，COS细胞，293细胞，Hela细胞，昆虫细胞，和视网膜细胞。
40. 权利要求39的方法，其中所述细胞是CHO细胞。
41. 权利要求31的方法，其中在包含A蛋白的固体支持物上分离所述双特异性抗体。
42. 权利要求41的方法，其中所述固体支持物包括A蛋白亲和柱，并且使用pH梯度来分离所述双特异性抗体。
43. 权利要求42的方法，其中所述pH梯度为包含一个或多个位于pH3和pH5之间的pH阶梯的阶梯式梯度。
44. 权利要求43的方法，其中所述双特异性抗体在pH3.9到pH4.4之间洗脱。
45. 权利要求44的方法，其中所述双特异性抗体在pH4.2洗脱。
46. 权利要求31的方法，其中所述第一和第二核酸各自从基因改造的小鼠获得。
47. 权利要求46的方法，其中所述基因改造的小鼠包含一个或多个人重链可变区核酸序列。
48. 权利要求31的方法，其中使用载体或携带所述核酸的病毒将所述第一，第二和第三核酸引入所述细胞。
49. 权利要求48的方法，其中
(a)所述第一和第二核酸在同一个载体或病毒上；
(b)所述第一和第三核酸在同一个载体或病毒上；或
(c)所述第一，第二和第三核酸在同一个载体或病毒上。
50. 权利要求31至49中任一项所述的方法，其中所述双特异性抗体为治疗性双特异性抗体。
51. 权利要求1-21和31-50中任一项的方法，其中使用A蛋白将所述双特异性抗体分离还包括在离子改性剂的存在下使用pH梯度。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
决定的理由
1、审查的文本
复审阶段中，复审请求人于2019年04月26日提交了修改后的权利要求书全文替换页（共11页51项），经审查所做修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，因此本复审请求审查决定针对的文本为：2014年02月28日分案申请递交日提交的说明书第1-12、23-194段（即第1-3、5-42页）、说明书摘要、说明书附图图1-图10、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2017年07月19日提交的说明书第13-22段（即第4页）；2019年04月26日提交的权利要求第1-51项。
2、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指同申请日以前已有的技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
当要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征时，如果现有技术给出了将上述区别技术特征应用到所述最接近的现有技术中以解决其技术问题的技术启示，则认为该技术方案是显而易见的，不具有突出的实质性特点，也就不具备创造性。
具体到本申请，权利要求1要求保护制备人的双特异性抗体的方法，包括，a.让哺乳动物细胞表达双特异性抗体，其第一免疫球蛋白重链包含与A蛋白结合的CH3结构域，第二免疫球蛋白重链包含减少或根除与A蛋白结合的修饰后的CH3结构域，所述修饰为IMGT外显子编号系统中的(a)95R修饰或(b)95R和96F修饰，或者EU编号系统中的(a’)435R修饰或(b’)435R和436F修饰；b.使用A蛋白将所述双特异性抗体分离，并限定所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变。对比文件4公开了一种制备异源双特异性抗体的方法及所述的抗体，制备方法包括培养由杂交瘤融合的细胞杂交瘤，其中一个杂交瘤产生第一抗体，含有可与蛋白A结合的小鼠、人或人源化的IgG1，IgG2，IgG4或大鼠的IgG2c，另一个杂交瘤产生第二抗体，含有与蛋白A具备较小亲和性或无亲和性的大鼠的IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，或，人或人源化的IgG3；将扩大培养后的细胞杂交瘤物培养上清液在将蛋白A作为功能基团的结合柱中滤过，用pH梯度洗脱所述抗体。且公开了一种具体制备得到的异源双特异性抗体，其含有与人或人源化的抗体的IgG3融合的人或人源化的IgG1（参见对比文件4权利要求1，4，第3栏第53-56行，实施例2a）。权利要求1要求保护的技术方案与对比文件4公开的内容相比，区别特征在于：（1）权利要求1限定的双特异性抗体为人的，而对比文件4公开的双特异性抗体是鼠源的，并对其进行了人源化改造；（2）权利要求1限定第二抗体重链包含选自IgG1、IgG2和IgG4的人IgG的CH3结构域，该区域包含了根除或减少与A蛋白的结合的修饰，并限定了具体的修饰位点是EU编号系统中的(a’)435R修饰或(b’)435R和436F修饰，而对比文件4的第二抗体则直接选择了不与A蛋白结合的人或人源化的IgG3。至于权利要求1的特征“所述双特异性抗体的血清半寿期没有改变”虽然没有在对比文件4中公开，但该技术特征并没有隐含对所述制备方法的步骤的进一步限定，因此不作为与对比文件4的区别特征。由于对比文件4与本申请的方法均是基于双特异性抗体制备过程中，产生的二聚体与A蛋白的亲和性差异达到分离纯化具有活性的双特异性抗体的目的（参见对比文件4第3栏第23-34行），在本申请不能证明相对于对比文件4具有更好的分离效果的情况下，确定权利要求1实际解决的技术问题是提供另一种制备与A蛋白亲和性降低或消除的异源双特异性抗体的方法并利用抗体二聚体之间的A蛋白亲和性差异实现对所述双特异性抗体的分离纯化。对于区别特征（1），无论是鼠源还人源抗体的制备，均是本领域技术人员的常规技术选择，没有证据证明鼠源抗体，包括双特异性抗体的制备原理不适用于人的抗体制备。对于区别特征（2），对比文件4除了公开上述内容外，还公开了与A蛋白结合的位点在CH2和CH3区域之间（参见对比文件4第5栏第8-12行），所述CH3区域包括了权利要求1所述CH3结构域。对比文件2则进一步公开了人类免疫球蛋白IgG1的Fc上与A蛋白结合的CH2-CH3区域，其中CH3上的His435（H435）和Tyr436（Y436）是结合的位点。以IgG3相应位置的R435和F436对Fc1进行替代修饰得到Fc1(3)，以IgG1的H435和Y436替代IgG3相应位置的R435，F436得到Fc3(1)，结果发现CH3的突变改变了IgG与A蛋白的结合能力，其中Fc1(3)减少了结合葡萄球菌蛋白A（SPA），而Fc3（1）与A蛋白的结合增加。由此说明，IgG1上CH3的H435，Y436是A蛋白结合的关键氨基酸，证实了IgG3不结合A蛋白是因为CH3相应位置是R435和F436（参见对比文件2的摘要，图2，第27页右栏第2段，第30-33页，图4B）。另外，Fc1与Fc3除了存在D356E和L358M不同外，在CH3上的区别还包括N384S，K392N，V397M和V422I（参见对比文件2第30页的第3.1节），即对比文件2给予了将结合A蛋白的IgG1的CH3上的某些位点替换为不结合A蛋白的IgG3相应氨基酸可以改变抗体结合A蛋白能力的技术启示。由此，本领域技术人员为了解决上述实际技术问题，有动机在对比文件4的基础上结合对比文件4和对比文件2给予的技术启示对双特异性抗体的第二重链CH3区域中的435R或435R和436F进行修饰，使得修饰后的CH3结构域与蛋白A结合减少或根除，即在对比文件4的基础上，本领域技术人员结合对比文件2和常规技术选择得到权利要求1要求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
权利要求1的直接或间接从属权利要求2-6将所述的免疫球蛋白的重链或轻链进一步限定为人的IgG重链、IgG1重链和人免疫球蛋白轻链，并具有限定了CH3结构域的序列。对比文件4公开了抗体类型可为人的 IgG1（参见权利要求1），本领域技术人员容易想到选择人IgG1重链及人的免疫球蛋白轻链，而权利要求具体限定的序列分别来自人IgG1、IgG2和IgG4，这些序列是本领域的常规技术选择，且本申请没有证明这些序列的选择带来了何种预料不到的技术效果。因此，在引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2-6也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求1的直接或间接从属权利要求7进一步限定了所述的修饰及修饰位点，其中位点356E、358M、384S、392N、397M和422I已经被对比文件2公开（参见权利要求1的评述）。因此，在引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求7也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。从属权利要求8进一步限定所述第二CH3区在人中是非免疫原性的，而该技术特征是本领域技术人员的常规技术选择，因此在权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求8也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求1的直接或间接从属权利要求9-20进一步限定了所述的细胞，所述抗原结合蛋白的分离方法，第一和第二免疫球蛋白重链的获得，包括编码核酸来源、细胞引入核酸、引入核酸时的载体或病毒。但上述技术特征对本领域技术人员而言均为本领域的常规技术手段，在此基础上基于抗体的亲和力、纯化介质、pH梯度洗脱方法进行调整是本领域技术人员能力所及，具体的操作参数经过有限实验即可确定。因此，在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求9-20也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求21为权利要求1-20的从属权利要求，附加技术特征进一步限定了双特异性抗体是治疗性双特异性抗体，而该附加技术特征为本领域常规技术选择，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求21页不具备创造性。
权利要求22请求保护分离包含Fc的抗原结合蛋白的方法；权利要求31请求保护制备包含Fc的抗原结合蛋白的方法。参照对权利要求1的评述，在对比文件4的基础上，本领域技术人员有动机结合对比文件4和对比文件2的教导，通过抗体CH3区结构突变来改变对比文件4中抗体对蛋白A的亲和力，从而将异源化双特异性抗体分离纯化出来；同时，结合本领域常规技术手段表达并纯化所述抗原结合蛋白，包括在允许所述细胞表达蛋白的条件下培养所述细胞，利用A蛋白亲和层析，在离子改性剂存在下pH梯度洗脱等，因此，在对比文件4的基础上，结合对比文件2 和本领域的常规技术手段获得权利要求22和31请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，因此权利要求22和31不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求23-30为权利要求22的直接或间接从属权利要求，基于与评述权利要求2-8、11相同的理由，在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求23-30也不具备创造性。
权利要求32-50为权利要求31的直接或间接从属权利要求，基于与评述权利要求2-21相同的理由，在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求32-50也不具备创造性。
权利要求51为权利要求1-21和31-50的从属权利要求，其附加技术特征限定使用A蛋白将所述抗原结合蛋白分离还包括在离子改性剂的存在下使用pH梯度。而该技术特征为本领域常规技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求51也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
3、对复审请求人意见陈述的答复
针对复审请求人的意见，合议组认为：（1）如本决定第二部分所述，相对于现有技术，本申请实际解决的技术问题是提供另一种制备与A蛋白亲和性降低或消除的异源双特异性抗体的方法，并利用抗体二聚体与A蛋白的亲和性差异实现对所述双特异性抗体的分离纯化。对比文件4虽然没有直接公开权利要求限定的CH3结构域的具体修饰位点，但是对比文件4指出与A蛋白结合的位点在CH2和CH3区域之间，给予了本领域技术人员该区域的氨基酸序列与蛋白A的亲和性相关的技术启示。对比文件2公开的将IgG1的Fc 上CH3中的H435和Y436替换为IgG3相应位置的R435和F436，获得的Fc变体与蛋白A的结合能力下降，而相反的替换则得到与蛋白A结合能力增加的效果，证明了IgG1上CH3的H435，Y436是A蛋白结合的关键氨基酸，IgG3不结合A蛋白是因为CH3相应位置是R435和F436。因此，为了降低或根除源自IgG1、IgG2或IgG4抗体或片段与蛋白A的结合，本领域技术人员有动机对这些抗体的CH3结构域中H435和Y436做如上修饰。此外，对比文件2还公开了IgG3与IgG1在其他位点氨基酸上的差别，包括CH3区域（结构域）中的N384S，K392N，V397M和V422I，结合上述实验和技术启示，本领域技术人员为了降低或根除源自IgG1、IgG2或IgG4抗体或片段与蛋白A的结合也有动机对其他的、IgG1与IgG3存在差异的位点进行相应的替换修饰。至于亲和力具体降低多少，或是否被根除，本领域技术人员通过常规的实验即可确定，并不需要付出创造性的劳动。（2）对比文件4与本申请均是通过减少或根除双特异性抗体中一个重链中与蛋白A的亲和力，利用二聚化形成的不同抗体之间与蛋白A结合差异达到分离的目的，不同的是对比文件4的抗体中的一条重链采用的是不与蛋白A结合的IgG3，而本申请是对IgG1等的CH3结构域进行修饰，但对比文件4和对比文件2给予了进行这种修饰的技术启示，因此即使如证据1所述，通常治疗抗体不采用IgG3，本领域技术人员结合对比文件4、对比文件2和常规技术选择，在选用IgG1等的重链的基础上同样可以显而易见地得到本申请权利要求要求保护的技术方案。此外，即使证据2曾指出对H435或Y436的修饰会减少血清半寿期，但本领域技术人员为了解决实际解决的技术问题，在对比文件4和对比文件2的启示下有动机尝试对现有技术公开的位点进行修饰。至于获得的抗体实际的性能，包括半寿期、活性等，按照常规本领域技术人员均要进行验证，而验证的过程并不需要付出创造性的劳动。综上所述，复审请求人关于本申请具有创造性的理由不能被接受，对本申请的修改不足以克服本申请不符合专利法第22条第3款有关创造性规定的缺陷。
在上述事实和理由的基础上，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年12月11日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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