发明创造名称：一种半乳甘露聚糖抗原及其制备方法
外观设计名称：
决定号：184845
决定日：2019-07-23
委内编号：1F244031
优先权日：
申请（专利）号：201510387287.2
申请日：2015-07-03
复审请求人：丹娜（天津）生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：周文
合议组组长：崔海云
参审员：许喆
国际分类号：C08B37/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：在判断创造性时，首先，应当确定与该权利要求所述技术方案最接近的现有技术；继而，将该权利要求的技术方案和该最接近的现有技术进行对比，确定二者之间的区别特征，并客观分析要求保护的技术方案相对于该最接近的现有技术实际解决的技术问题；然后，从该最接近的现有技术和发明实际解决的技术问题出发，判断由引入这些区别特征而得到的技术方案对于本领域技术人员来说是否显而易见，如果是显而易见的，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求案涉及申请号为201510387287.2，名称为“一种半乳甘露聚糖抗原及其制备方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为丹娜（天津）生物科技有限公司，申请日为2015年07月03日，公开日为2015年09月30日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门以权利要求第1-10项不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定为由于2017年11月06日驳回了本申请。驳回决定所针对的审查文本为：申请人于2017年02月21日提交的权利要求第1-10项，于申请日2015年07月03日提交的说明书第1-20页、说明书附图第1-3页、说明书摘要以及摘要附图（下称驳回文本）。
驳回文本的权利要求书如下：
“1.一种半乳甘露聚糖抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半乳甘露聚糖粗提物；
(b)将步骤(a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解；
(c)将步骤(b)中的水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分子物质；
(d)将步骤(c)得到的产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳甘露聚糖抗原纯品；
所述步骤(a)包括：将富含半乳甘露聚糖的生物体培养到半乳甘露聚糖含量最高时，灭活处理；过滤，将灭活后的生物体与培养液和/或组织液分离，生物体进行细胞破碎、离心，将细胞质和细胞壁分离，得到有效组分；所述有效组分经过醇沉，洗涤，干燥工艺处理，得到半乳甘露聚糖粗提物；
或者，所述步骤(a)包括：将生物体进行破碎，加水浸提，过滤，有效组分经醇沉，洗涤、干燥工艺处理，得到半乳甘露聚糖粗提物。
2.如权利要求1所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述生物体包括真菌或胚乳豆类植物；优选的，所述真菌包括曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、珠菌或念珠菌，所述胚乳豆类植物包括葫芦巴、瓜儿豆、角豆、刺槐豆、关华豆、皂荚、海红豆或银合欢。
3.如权利要求1所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，生物体培养过程中使用的培养基选自PDA培养基、沙氏培养基、察氏培养基、麦芽汁培养基中的一种或多种；培养方法选自使用固体培养基的平板培养或斜面培养，或使用液体培养基的摇瓶振荡培养或发酵罐培养。
4.如权利要求1所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中，灭活方法包括化学试剂、射线、高温、高渗透压；
和/或，所述步骤(a)中，所述细胞破碎使用机械破碎法、溶胀法、酶解法中的一种或多种；
和/或，所述步骤(a)中，所述醇沉使用甲醇或者乙醇，醇沉的体积为有效组分溶液体积的2-6倍，醇沉时间为1-48小时；
和/或，所述步骤(a)中，所述洗涤使用甲醇或者乙醇；干燥方法为烘干、冻干、减压干燥中的一种或多种。
5.如权利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)还包括活性炭脱色。
6.如权利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中肼解时：每毫克半乳甘露聚糖粗提物中加10-100μL的无水肼，肼解温度为100-150℃，肼解时间为2-12小时；
和/或，所述步骤(b)中水解时，采用亚硝酸水解，亚硝酸水解时亚硝酸浓度为1.5-3.0mol/L，水解温度为30℃，水解时间为2-12小时，水解结束后通入空气。
7.如权利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)中，所述酶选自葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶中的一种或多种，酶解温度为20-60℃，酶解时间为6-48小时；
和/或，所述步骤(c)中，加入正丁醇和氯仿溶液，振荡，离心，除去酶，采用透析、超滤或分子筛除去小分子物质。
8.如权利要求1或2所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)中，离子交换柱为阴离子交换柱，缓冲液为PH为7～8.5的Tris-HCl缓冲液，温度4℃；
和/或，所述步骤(d)中，亲和层析柱为Con A-Sepharose 4B亲和层析柱，缓冲液为PH 7～8.5的Tris-HCl缓冲液，温度4℃，洗脱液为PH 8～8.5的浓度为0.2～0.3mol/L的α-甲基-D-甘露糖苷；
和/或，所述步骤(d)中，凝胶色谱柱选自葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中。
9.一种半乳甘露聚糖抗原，其特征在于：采用如权利要求1-8任一项所述的半乳甘露聚糖抗原的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的半乳甘露聚糖抗原在制备半乳甘露聚糖多克隆抗体或制备用于检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒中的应用。”
驳回决定指出：（1）权利要求1与对比文件1（“曲霉菌胞壁及胞外多糖的分离和纯化”，黄尔，中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑，2013年第01期，E061-70，公开日为2013年01月15日）的区别为：①权利要求1使用富含半乳甘露聚糖的生物体作为原料，而对比文件1使用胞外液，且权利要求1还包括加入酶进行酶解、除去酶解产物中的酶及小分子物质、亲和层析柱及凝胶色谱纯化；②权利要求1和对比文件1得到半乳甘露聚糖粗提物的方法存在区别。基于上述区别特征可以确定权利要求1实际解决的技术问题是如何拓展提取原料并进一步提高半乳甘露聚糖的纯度和均一性。对于区别①，对比文件1给出了采用生物体提取半乳甘露糖的技术启示，本领域技术人员有动机在此基础上对提取来源进行扩展。且对比文件1公开了对于胞壁粗多糖进行酶解并除去酶解产物中的酶及小分子物质、亲和层析处理。本领域技术人员为进一步提高生物体多糖的纯度，有动机选择对其进行酶解并在酶解后除去酶和小分子物质，以及亲和层析处理。将亲和层析树脂制成层析柱、亲和层析处理和酶解处理的顺序等均是常规实验手段。对于区别②，在对比文件1的基础上进行常规选择或常规实验即可得到。因此，权利要求1不具备创造性。（2）从属权利要求2-8的附加技术特征或被对比文件1公开，或为本领域的常规选择。因此从属权利要求2-8不具备创造性。（3）权利要求9要求保护一种半乳甘露聚糖抗原，其与对比文件1的区别在于：制备方法存在差别。当权利要求1-8中的制备方法不具备创造性时，权利要求9也不具备创造性。（4）权利要求10与对比文件1的区别为：①两者的制备方法存在差别；②权利要求10限定了半乳甘露聚糖抗原的用途。对于区别特征①，参见权利要求1-8的评述。对于区别特征②，其用途是本领域的常规选择。因此，权利要求10不具备创造性。（5）申请人在意见陈述中认为：对比文件1中指出自然界中分离得到粗多糖的成分复杂，并需采用适合其结构特点的方法进行分离和纯化。同时，胞外多糖和胞壁多糖结构存在差别，因此，对比文件1中给出的启示为分离胞壁和分离胞外多糖应采取不同的方式。本申请提供了一种适合各种半乳甘露聚糖存在形式的制备方法，该方法制备的半乳甘露聚糖纯度更高，适于批量生产，并具有好的效果。对此，驳回决定认为：本领域技术人员公知，采用特定的纯化方法能够除去特定的杂质但同时也会增加步骤和成本。在提取纯化特定类型的多糖时，本领域技术人员会根据其主要杂质类型，在平衡纯度和成本的基础上选择比较有针对性的方法。因此，在面对多种类型的原料时，其含有的杂质类型也比较复杂，本领域技术人员为保证针对不同原料的不同杂质类型均能够实现有效纯化，有动机将多种不同的纯化方法进行组合，效果也是可以预期的。
申请人丹娜（天津）生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年02月01日向国家知识产权局提出了复审请求，并对权利要求书进行了修改，相对于驳回文本，修改体现在：将权利要求6-8的附加技术特征合并到权利要求1中，去除“或”部分的技术方案，并对权利要求的序号和引用关系进行适应性修改。
修改后的权利要求1如下：
“1.一种半乳甘露聚糖抗原的制备方法，包括如下步骤：
(a)富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半乳甘露聚糖粗提物；
(b)将步骤(a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解；
(c)将步骤(b)中的水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分子物质；
(d)将步骤(c)得到的产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳甘露聚糖抗原纯品；
所述步骤(a)包括：将富含半乳甘露聚糖的生物体培养到半乳甘露聚糖含量最高时，灭活处理；过滤，将灭活后的生物体与培养液和/或组织液分离，生物体进行细胞破碎、离心，将细胞质和细胞壁分离，得到有效组分；所述有效组分经过醇沉，洗涤，干燥工艺处理，得到半乳甘露聚糖粗提物；
或者，所述步骤(a)包括：将生物体进行破碎，加水浸提，过滤，有效组分经醇沉，洗涤、干燥工艺处理，得到半乳甘露聚糖粗提物；
所述步骤(b)中肼解时：每毫克半乳甘露聚糖粗提物中加10-100μL的无水肼，肼解温度为100-150℃，肼解时间为2-12小时；
和，所述步骤(b)中水解时，采用亚硝酸水解，亚硝酸水解时亚硝酸浓度为1.5-3.0mol/L，水解温度为30℃，水解时间为2-12小 时，水解结束后通入空气；
所述步骤(c)中，所述酶选自葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶中的一种或多种，酶解温度为20-60℃，酶解时间为6-48小时；
和，所述步骤(c)中，加入正丁醇和氯仿溶液，振荡，离心，除去酶，采用透析、超滤或分子筛除去小分子物质；
所述步骤(d)中，离子交换柱为阴离子交换柱，缓冲液为PH为7～8.5的Tris-HCl缓冲液，温度4℃；
和，所述步骤(d)中，亲和层析柱为Con A-Sepharose 4B亲和层析柱，缓冲液为PH 7～8.5的Tris-HCl缓冲液，温度4℃，洗脱液为PH 8～8.5的浓度为0.2～0.3mol/L的α-甲基-D-甘露糖苷；
和，所述步骤(d)中，凝胶色谱柱选自葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、纤维素凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中。”
复审请求人认为：（1）细胞壁不是生物体的下位概念；（2）对比文件1明确记载从胞外多糖P1（曲霉菌发酵液）中提取的半乳甘露聚糖分子量均一，而从胞壁多糖P2（菌丝体）中所提取的半乳甘露聚糖不单一。据此，本领域技术人员没有动机选择成分更加复杂的生物体作为原料进行提取；（3）本申请权利要求1提供的制备半乳甘露聚糖的方法是一种适合于各种半乳甘露聚糖存在形式的制备方法，该方法制备的半乳甘露聚糖纯度更高且适于批量生产，而且在保证免疫活性的同时，使得原材料来源更广泛、成本更低；（4）本申请正是在平衡纯度、成本的基础上对工艺步骤及其工艺参数进行选择，从选择发明的角度考虑，本申请的技术方案具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局受理了该复审请求，并于2018年02月11日向复审请求人发出了复审请求受理通知书，同时将本申请转送至国家知识产权局原审查部门进行前置审查。
国家知识产权局原审查部门在前置审查意见书中认为：首先，本申请与对比文件1均是半乳甘露聚糖的制备方法，且主要研究对象均是曲霉菌。在技术手段上，本申请也仅是将对比文件1中胞外多糖和胞壁多糖的纯化分离手段进行组合，在技术效果上也与对比文件1相当。本申请与对比文件1最初始的原料均是曲霉菌生物体，后续再进行发酵培养、提取纯化等处理。细胞壁也是源自于生物体。本申请实施例中并未说明采用曲霉菌的哪一部分进行提取。进而，无法确认本申请测定的高效凝胶色谱的样本是何种原料。并且，根据本申请说明书中记载的“通过本发明的制备方法从1L烟曲霉培养液最终可得到155mg半乳甘露聚糖纯品”，以及本申请高效凝胶色谱图及分子量与对比文件1中发酵液多糖非常接近，即更倾向于本申请实施例从培养液（即发酵液）中提取得到半乳甘露聚糖。因此，无法将本申请所用的提取原料与对比文件1区别开来。即便考虑对比文件1中胞壁多糖的不均一性，对比文件1第33页第4段也分析了不均一的原因，如部分未除去的糖蛋白。在此基础上，本领域技术人员可选择相应的纯化分离方法除去不均一的多糖，如肼解（断裂N-糖肽键）、离子交换（不同类型多糖的分离）、凝胶色谱柱（分子量控制）等，这是本领域技术人员基于现有技术可以选择和预期的。此外，在本申请说明书和意见陈述中指出的其他原料，实施例2中仅从瓜尔豆干种子中进行了提取，但并未对提取得到的多糖进行任何测试和表征。因此，其他更广泛原料提取得到多糖的纯度、均一性及生物活性的效果均是缺乏直接证据支持的。并且，本申请将针对发酵液和细胞壁的分离纯化方法进行结合，在追求除杂全面性的同时牺牲了针对性，将除去各种杂质的方法进行堆积必然能够更多的除去不同原料中的不同杂质，这是本领域技术人员可预期的。本申请增加除杂步骤后并没有取得相比于对比文件1更好的除杂效果。关于提取的参数条件，对比文件1公开了主要的提取分离工艺和部分参数，对于剩余参数也是在对比文件1的基础上可以调整得到的，复审请求人并没有提供充分证据证明这样的参数条件选择取得了预料不到的技术效果。综上所述，复审请求人的意见陈述不具备说服力，因而坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月20日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1与对比文件1的区别为：①权利要求1将生物体经灭活处理、破碎、离心，并限定过了具体过程，而对比文件1是将烟曲霉菌胞外液经过收集、浓缩而得到浓缩液；②权利要求1限定的水解温度、水解时间和对比文件1不同，并限定水解结束后通入空气；③权利要求1限定通过加入酶进行酶解的具体步骤，以及除去产物中的酶及小分子物质，并限定了酶的种类、酶解温度和时间；④权利要求1限定了亲和层析柱及凝胶色谱纯化，并限定了亲和层析柱的选择、工艺参数以及凝胶色谱柱的选择。权利要求1相对于对比文件1实际解决的技术问题是提供一种得到相近的纯度、尺寸均一的半乳甘露聚糖抗原的替代的制备方法。对于区别①，将生物体进行灭活处理、破碎、离心均是本领域的常规实验手段。对于区别②，水解温度和水解时间是本领域的常规选择，水解结束后通入空气是本领域的常规实验手段。对于区别③，在对比文件1已经公开烟曲霉菌丝体胞壁多糖的提取过程的基础上，根据实际需求选择酶解步骤，并在酶解后除去酶和小分子物质是很容易想到的。对于区别④，对于亲和层析柱和凝胶色谱纯化是在对比文件1的基础上进行的常规实验手段，其他未公开的特征是本领域技术人员的常规选择。因此，权利要求1不具备创造性。（2）从属权利要求2-5或被对比文件1公开，或为本领域的常规实验手段。因此，权利要求2-5不具备创造性。（3）权利要求6要求保护一种半乳甘露聚糖抗原。当权利要求1-5不具备创造性时，权利要求6也不具备创造性。（4）权利要求7要求保护一种应用。在对比文件1的基础上，本领域技术人员很容易想到将其制备用于检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒。对于利用半乳甘露聚糖抗原制备多克隆抗体是本领域的常规试验手段。因此，权利要求7也不具备创造性。（5）针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：首先，本申请说明书记载（具体参见说明书第8页第12-16行以及实施例1），可以认为不论是曲霉菌的细胞壁还是胞外液均属于富含半乳甘露聚糖的生物体。其次，对比文件1分别记载了胞外多糖和胞壁多糖提取半乳甘露聚糖的方法，根据其摘要的记载，胞外多糖P1的纯度达94.7%，且分子量均一，而胞内多糖P2的分子量不均一，据此，本领域技术人员很容易想到选择胞外多糖P1的制备方法作为最接近的现有技术，在此基础上，可以结合胞内多糖P2的一些提纯手段进行结合，该结合不需要克服任何技术障碍即可实现。第三，本申请并没有任何实验数据表明本申请的制备方法附加了酶解、亲和层析柱和凝胶色谱柱步骤相对于对比文件1产生了何种预料不到的技术效果。也没有任何实验数据表明其工艺步骤和工艺参数的选择产生了何种预料不到的技术效果。第四，本申请的来源和对比文件1相同，且原料的来源及成本是本领域技术人员在满足需求的情况下普遍追求的，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择和控制。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年04月11日提交了意见陈述书，未对申请文件进行修改。复审请求人在意见陈述书中认为：（1）对比文件1明确记载从胞外多糖P1（曲霉菌发酵液）中提取的半乳甘露聚糖分子量均一，而从胞壁多糖P2（菌丝体）中所提取的半乳甘露聚糖不单一。据此，本领域技术人员没有动机选择成分更加复杂的生物体作为原料进行提取；（2）本申请权利要求1以整个生物体作为原料，其制备方法不仅适合于胞外半乳甘露聚糖的提取，而且适合用于胞壁半乳甘露聚糖的提取，胞外、胞壁的半乳甘露聚糖可同时提取，无需分开提取，该方法不受生物体原料的限制，且制备的半乳甘露聚糖纯度更高，分子量均一且适于批量生产，取得了出乎意料的技术效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审程序中，复审请求人于2018年02月01日提交了权利要求书修改替换页（共3页，7项）。经审查，该修改符合专利法第33条及专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定依据的审查文本是：复审请求人于2018年02月01日提交的权利要求第1-7项，于申请日2015年07月03日提交的说明书第1-20页、说明书附图第1-3页、说明书摘要以及摘要附图。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在判断创造性时，首先，应当确定与该权利要求所述技术方案最接近的现有技术；继而，将该权利要求的技术方案和该最接近的现有技术进行对比，确定二者之间的区别特征，并客观分析要求保护的技术方案相对于该最接近的现有技术实际解决的技术问题；然后，从该最接近的现有技术和发明实际解决的技术问题出发，判断由引入这些区别特征而得到的技术方案对于本领域技术人员来说是否显而易见，如果是显而易见的，则该权利要求不具备创造性。
（1）具体到本申请，权利要求1要求保护一种半乳甘露聚糖抗原的制备方法（具体参见案由部分）。
对比文件1公开了一种从曲霉菌的细胞壁和胞外液提取纯化半乳甘露聚糖的方法，具体公开了如下技术内容（参见第7页第1段、第9页最后一段、第10-11页、第16-18页2.1-2.9）：目前临床上IA（侵袭性曲霉病）的早期诊断主要依赖于曲霉菌抗原的监测，包括半乳甘露聚糖（GM），1,3-p-D-葡聚糖等，GM的应用更为广泛。半乳甘露聚糖存在于曲霉菌的胞壁，也会释放到曲霉菌生长的胞外液中，分别从胞壁和胞外提取半乳甘露聚糖，选择合适的适配子筛选靶物质。
2烟曲霉菌胞外多糖（相当于权利要求1中所述的富含半乳甘露聚糖的生物体）的提取
2.1．培养
2.1.1从沙保弱平板（相当于沙氏培养基）上挑取菌落接种于含150m1液体培养基的1L摇瓶（即培养方法为摇瓶震荡培养）中，28℃ 180rpm/min，培养48h。作为种子培养基。
2.1.2将Ⅰ菌液以5%的比例转种于新的培养基中（成分同Ⅰ），培养条件同Ⅰ。
2.2．收集菌液和菌丝体
在48h时，停止培养。通过滤纸过滤，将菌丝体与培养液分离。菌丝体先后用4L 0.85% NaCl溶液和8L去离子水清洗，过滤沥干，于60℃烘箱中烘干至恒重，称量重量。存于-20℃冰箱。
培养菌液中残余的菌丝体碎片通过抽滤除去，得到澄清的上清液，量取体积。
2.3．浓缩上清液
将得到的上清液，通过旋转蒸发仪，70℃减压浓缩至1L。
2.4．醇沉
在浓缩液中加入4L（其中步骤2.3中记载70℃减压浓缩至1L，即相当于醇沉的体积为有效组分溶液体积的4倍）的95%乙醇，边加边搅拌，4℃静置过夜（即落入1-48小时的数值范围），抽滤得醇沉物。将上清重新浓缩，再次醇沉，汇集沉淀物。用乙醇将沉淀洗3遍（即权利要求1中所述的洗涤）。
2.5．透析
将醇沉物用蒸馏水复溶，装于透析袋中，在4℃冰箱中加入搅拌子透析，期间多次更换透析外液。直至外液中不出现糖为止，此时小分子糖已去除干净。
2.6．冻干
透析后的液体分装于数个已知重量的5Oml带塞玻璃瓶中，液体体积不得超过瓶身的1/5，防止冻干时喷瓶。后放于-80℃冰箱中预冻4h，于冷冻干燥机中过夜干燥（即权利要求1中所述的干燥处理）。
2.7．无水肼和亚硝酸钠处理（即权利要求1中所述的肼解和水解）
在冻干粉中加入无水肼5Oml（1ml/15mg，约等于67μl/mg)，100℃，12h。在浆状物中加入4倍体积的95%乙醇沉淀。沉淀物用无水乙醇洗3次。透析48h，直至颜色趋于无色，冻干。
冻干粉中加入现配的1.5N亚硝酸钠[1.5N亚硝酸溶液：3N亚硝酸钠(20.7g亚硝酸钠溶于80m1去离子水，待完全溶解，加去离子水定容至1OOml)与3N HCL(5.6m1浓盐酸加去离子水定容至1OOml)等体积混合(现配)，即相当于1.5mol/L的亚硝酸溶液]，混匀，室温下过夜。透析，4倍体积95%乙醇沉淀，沉淀物用无水乙醇洗涤3次，冻干。
肼解和亚硝酸钠处理均重复一次。
2.8．过Q柱（即权利要求1中所述的阴离子交换柱）
平衡:通过蠕动泵，用6个柱体积的平衡缓冲液A（25 mM Tris-HC1，pH7.5）[平衡缓冲液A:0.606g Tris溶于40m1去离子水，混匀，待完全溶解，加去离子水定容至5Oml。加入40.3m1 O.lmol/L HCL (427μL浓盐酸加去离子定容至5Oml)，加去离子水，定容至100m1。配成100m1 O.O5mol/L的缓冲液。加入等体积100m1的去离子水配得目的缓冲液。高压灭菌，4℃保存]以3 ml/min的流速平衡层析柱，至流出液pH不变(与平衡液一致)。
进样：将(7)步得到的粗多糖冻干粉溶于平衡缓冲液，0.45μm滤膜过滤，以2m1/min的流速进样。
淋洗：以3ml/min的流速用平衡缓冲液A淋洗，每5ml收集一管，以苯酚硫酸法，485nm测定吸光度值，绘制洗脱曲线，根据洗脱曲线，汇集未结合部分，浓缩，得到溶液B。
再生：用1M NaCl溶液清洗层析柱，由于柱子吸附很多色素，用1N NaOH在位清洗，再用平衡缓冲液A平衡。
2.9．sevage法去蛋白
正丁醇氯仿混合溶液(正丁醇:氯仿=1:4)与溶液B以1:4比例混合，剧烈振荡30min，4000rpm/min，离心15min。重复5次，直至液面交界处无白色混悬。留取每次去蛋白后的溶液，计算去蛋白效率及多糖的损失率。将最终得到的溶液70℃旋转蒸发浓缩，透析、冻干，得到多糖样品P1，4℃保存。
权利要求1要求保护的技术方案与对比文件1开的技术内容相比，区别特征在于：①权利要求1将生物体经灭活处理、破碎、离心，并限定过了具体过程，而对比文件1是将烟曲霉菌胞外液经过收集、浓缩而得到浓缩液。②权利要求1限定的水解温度、水解时间和对比文件1不同，并限定水解结束后通入空气。③权利要求1限定通过加入酶进行酶解的具体步骤，以及除去产物中的酶及小分子物质，并限定了酶的种类、酶解温度和时间。④权利要求1限定了亲和层析柱及凝胶色谱纯化，并限定了亲和层析柱的选择、工艺参数以及凝胶色谱柱的选择。
根据本申请说明书的记载，本申请要解决的技术问题是提供一种纯度更高且适于批量生产的半乳甘露聚糖抗原的制备方法。本申请为了实现上述技术问题所采用的技术手段是具体包括如下步骤：(a)富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半乳甘露聚糖粗提物；(b)将步骤(a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解；(c)将步骤(b)中的水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分子物质；(d)将步骤(c)得到的产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳甘露聚糖抗原纯品。对得到的半乳甘露聚糖抗原纯品，进行鉴定（参见本申请说明书第2页第12行-第3页第2行）。本申请说明书实施例3-5将实施例1（以曲霉菌为代表的微生物组分的分离）或2（以瓜尔豆种子为代表的植物胶的分离）获得的富含半乳甘露聚糖的有效组分进行半乳甘露聚糖粗聚物的提取，并通过肼解、水解、酶解、Mono Q阴离子交换柱、ConA-Sepharose4B亲和层析柱、凝胶色谱柱后得到尺寸均匀、分子量分布均一的半乳甘露聚糖抗原纯品。合议组查明，实施例的数据显示：由表4的检测结果可知，核酸及蛋白质的总含量与多糖含量的比例小于5%；从图2可以看出，样品出峰单一，尖窄，并且无明显杂峰；从图3可以看出，除衍生峰外，只含有少量葡萄糖，无其它单糖杂峰；表5的检测结果呈阳性，且OD值大于阳性质控。即本申请纯化的烟曲霉半乳甘露抗原纯度高、分子量分布均匀，且具备免疫活性（参见本申请说明书表4-5以及图2-3）。对比文件1公开了一种烟曲霉菌胞外多糖的提取方法，并具体公开了如下步骤：收集菌液和菌丝体、浓缩上清液、醇沉、透析、冻干、肼解和水解、阴离子交换柱和sevage法去蛋白，即公开了权利要求1中所述的主要步骤，且胞外多糖P1的纯度达94.7%，且胞外多糖分子量均一（参见对比文件1的摘要），即对比文件1也公开了一种与本申请纯度相近、分子量均一的半乳甘露聚糖抗原。虽然本申请说明书记载了酶解和凝胶色谱柱所产生的技术效果，即酶解可以除去产物中混杂的葡聚糖、几丁质、纤维素、果胶等多糖杂质，进一步提高了半乳甘露聚糖的纯度（参见本申请说明书第5页第20-21行）。对于通过凝胶色谱柱进行分离从而得到尺寸均匀的半乳甘露聚糖纯品（参见本申请说明书第6页第15-17行）。但本申请说明书并没有记载通过酶解、亲和层析柱和凝胶色谱柱之后，可以获得相对于没使用该步骤的技术方案产生了更好的技术效果，即没有证据表明通过酶解、亲和层析柱和凝胶色谱柱之后，可以获得相较于对比文件1更好的技术效果。
因此，基于上述区别特征可以确定，权利要求1相对于对比文件1实际解决的技术问题是提供一种得到相近的纯度、尺寸均一的半乳甘露聚糖抗原的替代的制备方法。
对于区别特征①，将生物体进行灭活处理、破碎、离心均是本领域技术人员常规的实验手段，本领域技术人员完全可以根据实际需求进行操作，其技术效果也是可以预期的。
对于区别特征②，在对比文件1公开了“冻干粉中加入现配的1.5N亚硝酸，混匀，室温下过夜”的基础上，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择水解温度和水解时间，水解结束后通入空气也是本领域的常规实验手段，其产生的技术效果均是可以预期的。
对于区别特征③，对比文件1还公开了烟曲霉菌丝体胞壁多糖的提取过程（参见对比文件1第18页第3行-第19页第4行），并具体公开了加入葡聚糖酶的步骤：将3.5步得到的粗多糖配成饱和多糖水溶液，加入葡聚糖酶配成的酶含量为3%的样品溶液，37℃水浴过夜。后采用sevage法（即使用正丁醇氯仿混合溶液，且剧烈震荡，离心）除去葡聚糖酶，经过透析，浓缩，冻干得到多糖样品P2。在此基础上，本领域技术人员可以根据实际需求，进一步选择酶解步骤，并在酶解后除去酶和小分子物质。
对于区别特征④，对于亲和层析柱处理，对比文件1公开了烟曲霉菌丝体胞壁多糖的提取（参见对比文件1第18页第3.5节），并具体公开了conA-sepharose 4B beads纯化粗多糖，珠子混悬液的配制中加入平衡缓冲液B（pH7.4，20mM Tris-HCL缓冲液，含0.5M NaCl，1mM CaCl2，1mM MnCl2），制成75%的beads slurry，混匀，放4℃待用。加入200μl Elution Buffer（0.2M α-MM）洗脱结合多糖，其中0.2M洗脱液：1.94g α-甲基-D-甘露糖苷溶于30mL去离子水，待完全溶解，定容至50ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，放于4℃冰箱中保存。且对比文件1还公开（参见对比文件1第32页第3段）：ConA sepharose beads 能与α-甘露糖、α-葡萄糖专一地结合，可以用来捕获多糖液中的目标多糖。在此基础上，本领域技术人员可以根据需要选择进行亲和层析柱处理。洗脱液的pH值是根据实际需求进行的常规选择。对于凝胶色谱纯化，对比文件1公开（参见对比文件1第33页第2段）：凝胶色谱柱是按照分子尺寸大小顺序进行样品行分离的，固定相凝胶是一种多孔性的聚合材料，稳定性较好。凝胶色谱柱中可供分子通行的路径有较大的粒子间的间隙和较小的粒子内的通孔。多糖溶液通过色谱柱时，较大的分子被排除在粒子的小孔之外，只能从粒子间的间隙通过，速率较快；而较小的分子可以进入粒子中的小孔，通过的速率则较慢。经过一定长度的色谱柱，分子根据相对分子量的大小被分开。即对比文件1给出了凝胶色谱柱可以按照分子量分离多糖的技术启示。据此，本领域技术人员为了进一步提高半乳甘露聚糖的均一性，有动机选择凝胶色谱纯化处理。对于亲和层析柱和凝胶色谱纯化的工艺的顺序是本领域技术人员根据实际需求进行的常规调整，凝胶色谱柱的选择也是本领域技术人员的常规选择，其产生的技术效果均是可以预期的。
由此可知，在对比文件的1基础上结合本领域的常规实验手段以得到权利要求1要求保护的技术方案，对本领域的技术人员而言是显而易见的，因此，权利要求1要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（2）从属权利要求2是对生物体的种类作了进一步限定。其中曲酶菌已被对比文件1公开，具体参见上文对权利要求1的评述。对于权利要求2中其它生物体的种类也是常见的富含半乳甘露聚糖的原料，本领域技术人员可以根据实际需求进行常规选择，其产生的技术效果是可以预期的。因此，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（3）从属权利要求3是对步骤（a）的进一步限定。其中沙氏培养基、摇瓶震荡培养均已被对比文件1公开，具体参见权利要求1的评述过程。对于培养基的其他种类和其他培养方法也均是本领域技术人员的常规选择或常规实验手段，其产生的技术效果是可以预期的。因此，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求3不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（4）从属权利要求4是对步骤（a）的进一步限定。其中醇沉和洗涤的步骤已被对比文件1公开，具体参见权利要求1的评述过程。对于灭活方法和细胞破碎方法均是本领域技术人员根据实际需求进行的常规实验手段，其产生的技术效果是可以预期的。因此，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求4不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（5）从属权利要求5进一步限定步骤（a）还包括活性炭脱色。对于活性炭脱色是本领域的常规实验手段，本领域技术人员可以根据实际需求进行选择，其产生的技术效果是可以预期的。因此，当其引用的权利要求1或2不具备创造性时，权利要求5不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（6）权利要求6要求保护一种半乳甘露聚糖抗原，采用权利要求1-5任一项所述的方法制备得到。对比文件1公开了一种半乳甘露聚糖抗原，具体公开内容参见权利要求1。而且如上文所述，权利要求1-5都不具有创造性。因此，权利要求6相对于对比文件1也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（7）权利要求7要求保护一种半乳甘露聚糖抗原在制备半乳甘露聚糖多克隆抗体或制备用于检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒中的应用。对比文件1公开了一种从曲霉菌的细胞壁和胞外液提取纯化半乳甘露聚糖的方法，具体公开了目前临床上IA（侵袭性曲霉病）（即权利要求7中所述的侵袭性真菌疾病的下位概念）的早期诊断主要依赖于曲霉菌抗原的监测，包括半乳甘露聚糖（GM），1,3-p-D-葡聚糖等，GM的应用更为广泛，具体的制备方法参见权利要求1。在此基础上，本领域技术人员很容易想到将其制备用于检测侵袭性真菌疾病检测试剂盒。对于利用半乳甘露聚糖抗原制备多克隆抗体是本领域技术人员的常规试验手段。因此，当引用权利要求6所述的半乳甘露聚糖抗原不具备创造性时，权利要求7相对于对比文件1也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、关于复审请求人的意见陈述（具体参见案由部分）
合议组认为：（1）对比文件1分别记载了胞外多糖和胞壁多糖提取半乳甘露聚糖的方法，根据其摘要的记载，胞外多糖P1的纯度达94.7%，且分子量均一，而胞内多糖P2的分子量不均一，据此，本领域技术人员很容易想到选择胞外多糖P1的制备方法作为最接近的现有技术，在此基础上，可以结合胞内多糖P2的一些提纯手段进行结合，该结合不需要克服任何技术障碍即可实现。（2）由本申请说明书实施例1和3的记载可知，本申请以曲霉菌为代表的微生物组分进行分离，得到曲霉菌中富含半乳甘露聚糖的发酵液、细胞质和细胞壁成分；将实施例1获得的富含半乳甘露聚糖的有效组分加水溶解等过程后得到半乳甘露聚糖粗提物。即本申请的来源和对比文件1是相同，均是曲霉菌。本申请说明书并没有具体记载富含半乳甘露聚糖的有效组分是胞外或胞壁，还是胞外和胞壁同时进行提取。且本申请也没有数据证明本申请的制备方法适合胞外、胞壁的半乳甘露聚糖可以同时提取。本领域技术人员完全可以根据实际需求对有效组分进行选择和控制。对比文件1也并没有任何记载表明其公开的制备方法只能适应于特定的生物体原料。对于其技术效果，参见前述评述可知，对比文件1也公开了一种与本申请纯度相近、分子量均一的半乳甘露聚糖抗原。此外，本申请也没有任何实验数据表明其工艺步骤和工艺参数的选择产生了何种预料不到的技术效果。综上，对于复审请求人的上述主张，合议组不予支持。
基于以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月06日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
