发明创造名称：通过质谱法检测二羟基维生素D代谢物的方法
外观设计名称：
决定号：184441
决定日：2019-07-22
委内编号：1F256704
优先权日：2007-11-28
申请（专利）号：201510071234.X
申请日：2008-11-25
复审请求人：奎斯特诊断投资公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：孙勐
合议组组长：许敏
参审员：张丽
国际分类号：G01N27/62
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征为本领域的常规选择，则该项权利要求相对于现有技术没有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510071234.X，名称为“通过质谱法检测二羟基维生素D代谢物的方法”的发明专利申请（下称本申请），本申请的申请人为奎斯特诊断投资公司，优先权日2007年11月28日，申请日为2008年11月25日，公开日为2015年06月10日，母案申请号为2008801247945，本分案申请提交日为2015年02月11日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年04月17日作出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：本申请权利要求1-22不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。驳回决定引用了以下2篇对比文件：
对比文件1：US 2006/0228809 A1，公开日期2006年10月12日；
对比文件2：“Characterization of vitamin D3 metabolites using continuous-flow fast atom bombardment tandem mass spectrometry and high-performance liquid chromatography”，Bernice Yeung et al.，Journal of Chromatography A，第645卷，第115-123页，公开日期1993年08月13日。
驳回决定所依据的文本为: 申请人于2017年07月04日提交的权利要求第1-22项、2015年09月25日提交的说明书第1-95段、分案申请提交日提交的说明书摘要。驳回决定所针对的权利要求1-22项如下：
“1. 通过串联质谱法测定所取的生物样品中一种或多种二羟基维生素D代谢物的量的方法，所述方法包括：
(i)通过利用大气压化学电离(APCI)对所述一种或多种二羟基维生素D代谢物和内标进行电离，分别产生所述一种或多种二羟基维生素D代谢物和所述内标的至少一种前体离子；
(ii)分别产生所述一种或多种二羟基维生素D代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子；和
(iii)比较步骤(i)、(ii)或两者中产生的所述一种或多种二羟基维生素D代谢物和所述内标的一种或多种所述离子的量以确定所述生物样品中的所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的量；
其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α,25(OH)2D2或1α,25(OH)2D3或两者。
2. 权利要求1的方法，其中所述内标包括1α,25(OH)2D2-[26,26,26,27,27,27]-2H和1α,25(OH)2D3-[6,19,19’]-2H中至少一种。
3. 权利要求1的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α,25(OH)2D2和1α,25(OH)2D3，并且其中所述代谢物的所述量在单一测试中进行测定。
4. 权利要求1的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α,25(OH)2D2；并且其中所述1α,25(OH)2D2的所述前体离子的质/荷比为411.35±0.5。
5. 权利要求1的方法，其中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物包括1α,25(OH)2D3；并且其中所述1α,25(OH)2D3的所述前体离子的质/荷比为399.35±0.5。
6. 权利要求1的方法，其中所述内标包括1α,25(OH)2D2-[26,26,26,27,27,27]-2H并且其至少一种前体离子的质/荷比为592.37。
7. 权利要求6的方法，其中所述内标的一种或多种碎片离子的质荷比为317.12。
8. 权利要求1的方法，其中所述内标包括1α,25(OH)2D3-[6,19,19’]-2H并且其至少一种前体离子的质荷比为577.37。
9. 权利要求8的方法，其中所述内标的一种或多种碎片离子的质荷比为314.12。
10. 权利要求1的方法，进一步包括在电离之前从所述生物样品纯化所述一种或多种二羟基维生素D代谢物。
11. 权利要求1的方法，进一步包括基于所述内标的前体和碎片离子构建标准曲线并且利用所述标准曲线确定所述生物样品中所述一种或多种二羟基维生素D代谢物的量。
12. 通过串联质谱法测定取自人的生物样品中1α,25二羟基维生素D2(1α,25(OH)2D2)的量的方法，其包括：
(a)通过一种或多种方法加工来自人的生物样品以产生加工的样品，其中所用的至少一种方法是用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生1α,25(OH)2D2；
(b)通过高效液相层析(HPLC)富集来自步骤(a)的衍生的1α,25(OH)2D2；
(c)产生从步骤(b)获得的所述衍生的1α,25(OH)2D2的前体离子，其中所述前体离子的质荷比为586.37±0.5；
(d)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子的至少一种包括质荷比为314.12±0.5的离子；和
(e)通过质谱法检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子与所述来自人的生物样品中的所述1α,25(OH)2D2的量相关联。
13. 权利要求12的方法，其中所述加工进一步包括在衍生之前通过免疫纯化富集1α,25(OH)2D2。
14. 权利要求12的方法，其中所述方法进一步包括通过串联质谱法测定所述来自人的生物样品中1α,25二羟基维生素D3(1α,25(OH)2D3)的量。
15. 权利要求14的方法，其中所述1α,25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生；并且其中所述1α,25(OH)2D3的所述前体离子的质荷比为574.37±0.5。
16. 权利要求12的方法，其中所述生物样品包括血浆或血清。
17. 权利要求12的方法，其中所述产生前体离子包括通过大气压化学电离(APCI)电离。
18. 通过串联质谱法测定取自人的生物样品中1α,25二羟基维生素D3(1α,25(OH)2D3)的量的方法，其包括：
(a)通过一种或多种方法加工来自人的生物样品以产生加工的样品，其中所用的至 少一种方法是用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生1α,25(OH)2D3；
(b)通过高效液相层析(HPLC)纯化来自步骤(a)的衍生的1α,25(OH)2D3；
(c)产生所述衍生的1α,25(OH)2D3的前体离子，其质荷比为574.37±0.5；
(d)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，其中所述一种或多种碎片离子的至少一种包括质荷比为314.12±0.5的离子；和
(e)通过质谱法检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子与所述来自人的生物样品中的所述1α,25(OH)2D3的量相关联。
19. 权利要求18的方法，其中所述加工进一步包括在衍生之前通过免疫纯化富集1α,25(OH)2D3。
20. 权利要求18的方法，其中所述方法进一步包括测定所述来自人的生物样品中1α,25二羟基维生素D2(1α,25(OH)2D2)的量。
21. 权利要求20的方法，其中所述1α,25(OH)2D2在质谱法之前用PTAD衍生；并且其中所述1α,25(OH)2D2的所述前体离子的质荷比为586.37±0.5。
22. 权利要求18的方法，其中所述产生前体离子包括通过大气压化学电离(APCI)电离。”
驳回决定认为：权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征为：所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子的一种或多种离子。而对于该区别技术特征，对比文件1公开了：所述二羟基维生素D代谢物选自1,25-二羟基维生素D2（即1α,25(OH)2D2）、1,25-二羟基维生素D3（即1α,25(OH)2D3）中的一种或多种（参见说明书35段）。在明确了待测物质即二羟基维生素D代谢物的具体类型后，通过质谱法检测该待测物质时确定碎片离子的质/荷比是本领域技术人员常规的试验技能。本领域技术人员容易选择具体的碎片离子质/荷比，而选择特定的质/荷比也没有取得预料不到的技术效果。因此在对比文件1的基础上结合公知常识以得到权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此权利要求1不具备创造性。进而，由于权利要求2-11加技术特征被对比文件1-2公开或属于本领域公知常识，权利要求2-11也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。权利要求12与对比文件1相比，其区别技术特征在于：1）用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生1α,25(OH)2D2；2）前体离子的质荷比为586.37±0.5；碎片离子的至少一种包括质荷比为314.12±0.5的离子。区别技术特征（1）被对比文件2公开且作用相同，区别技术特征（2）是本领域公知常识，权利要求12不具备创造性。由于权利要求13-17加技术特征或被对比文件1-2公开或属于本领域公知常识，权利要求13-17也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。出于与权利要求12-15，17不具备创造性相似的理由，权利要求18-22也不具备创造性。
申请人奎斯特诊断投资公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年07月23日向国家知识产权局提出了复审请求，并同时提交了参考文献A-C来证明由于离子化过程的难度，尤其是利用诸如APCI的软离子化的方法，对具体分析物的质谱法分析是预料不到的，但未修改申请文件。参考文献A-C分别为：
文献A：期刊“LCGC NORTH AMERICA”于2006年05月出版的第24卷第498页刊载的文献“Ion Suppression：A Major Concern in Mass Spectrometry”；
文献B： Fiehn等编著的书籍“Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine”，2006年版，第1030-1034页；
文献C：期刊“Journal of Chromatography A”于2004年1045卷刊载的文献“One-year routine application of a new method based on liquid chromatography-tandem mass spectrometry to the analysis of 16 multiclass pesticides in vegetable samples”。
复审请求人认为：1）对比文件1没有公开该质/荷比151.12±0.5 和135.12±0.5，这也不是公知常识；对比文件2提供的教导“过具极性而不能通过传统EI或化学离子化技术而离子化”使得本领域技术人员有动机不去采用本权利要求限定的APCI法，而去采用FAB离子化法；2）文献A-C分别指出：“针对每种基质与分析物的组合需要特定的方案”，“预测离子抑制的严重程度时不可能的”，“这个问题的解决比较困难，鉴于其不可预测性和对被考虑的基质种类的高度依赖性”，因此，鉴于质谱法离子化效率的不可预测性，权利要求1并非显而易见；3）用APCI检测和定量1,25-二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3预料不到地实现了高精度。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年07月31日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
经前置审查，原审查部门坚持原驳回决定，认为权利要求1-22不具备创造性。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年01月28日发出复审通知书，通知书中指出：权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征为：所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的离子中的一种或多种离子，该区别技术特征属于本领域技术人员的常规选择。在对比文件1的基础上结合公知常识以得到权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备创造性。进而，由于权利要求2-11附加技术特征被对比文件1-2公开或属于本领域公知常识，权利要求2-11也不具备创造性。权利要求12与对比文件1相比，其区别技术特征在于：1）用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生1α,25(OH)2D2；2）前体离子的质荷比为586.37±0.5；碎片离子的至少一种包括质荷比为314.12±0.5的离子。区别技术特征（1）被对比文件2公开且作用相同，区别技术特征（2）是本领域常规选择，权利要求12不具备创造性。由于权利要求13-17的附加技术特征被对比文件1-2公开或属于本领域公知常识，权利要求13-17也不具备创造性。出于与权利要求12-15，17不具备创造性相似的理由，权利要求18-22也不具备创造性。对于复审请求中提出的意见，合议组认为：1）在分析物相同，分析手段都是APCI质谱的前提下，关注100以上的质/荷比碎片离子是本领域的常规选择，并无技术障碍阻碍本领域技术人员关注该范围内的碎片离子。对比文件2中并未限定D3-PTAD不能采用大气压化学电离（APCI），即对比文件2中并未给出相反的教导；本领域技术人员公知的是， FAB、APCI都是属于进化的“软性电离”技术范畴， FAB和APCI相比，只是离子化效果，如不同大小的碎片离子的量/比例略有差异，一般并不影响定性分析；因此，对比文件2并没有给出相反的教导。2）质谱法离子化效率的不可预测性现实中确实存在，但据此无法推断出权利要求1非显而易见。文献（B）并不是指不能量化和不能定性分析，而且在该页左栏第二段中还补充说明了多数生物分子都可以在加成之后被离子化；文献（C）其中针对多菌灵选取160质/荷比的离子进行量化，与上述区别技术特征中的碎片离子峰数值相近；申请人所引证文献并不认为质谱法离子化效率的不可预测性能够阻碍生物物质被APCI所离子化，其文献中前述的内容恰恰说明本领域技术人员可以采用一些手段进行质谱检测并得到有效的检测结果，文献（A）-（C）都没有任何明示或暗示任何技术偏见。本领域教科书《色谱联用技术》证实了，APCI必然适用于1,25-二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3的质谱分析。3）合议组认为，本申请的表2-3只是记载了在申请人人为选定的若干质/荷比区域内出现的峰值数据的记录，并未出现质/荷比151.12±0.5 和135.12±0.5的峰值，无法证实申请人所述的灵敏度高的说法。综上所述，复审请求人的观点不能成立。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年05月13日提交了意见陈述书和权利要求书的全文修改替换页。所作修改为删除了原权利要求18-22项，仅保留权利要求1-17。修改后的权利要求书与前次权利要求书中的权利要求1-17项内容完全相同。
复审请求人认为新的权利要求1与对比文件1相比具备创造性，具体意见为：1）合议组在评述权利要求1相对于对比文件1的区别技术特征时，引用了两篇现有技术文件，即对比文件2和中南大学博士学位论文“API-MS离子化规律及LC-MS联用技术在药物和内源性物质代谢中的应用研究”，而在复审阶段不允许引用新的现有技术文件。2）合议组认为质/荷比为151.12±0.5和135.12±0.5的碎片离子已被对比文件2的图3（b）公开或暗示，但是对比文件2采用的手段是FAB，图3（b）显示的是CID谱图，本申请的前体离子具有399±0.5的质荷比，基于对比文件2的教导，不能容易想到本申请方案。3）引用的《色谱联用技术》并没有公开在审权利要求1限定的具体质荷比，依据对比文件2的图2内容，前体离子和碎片离子的峰无法合理预期。
在上述程序的基础上，本案合议组经合议，认为本案事实已经清楚，依法作出本审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
在复审程序中，复审请求人于2019年05月13日提交了权利要求书的全文修改替换页，经核实，权利要求书的修改没有超出原始申请记载内容的范围，符合专利法第33条及专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定所依据的文本为：申请人于2019年05月13日提交的权利要求第1-17项、2015年09月25日提交的说明书第1-95段、分案申请提交日提交的说明书摘要。
（二）、关于权利要求是否符合专利法第22条第3款的规定
专利法第22条第3款规定：创造性，是指同现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具备实质性特点和进步。
如果一项权利要求与作为最接近现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，而这些区别技术特征为本领域的常规选择，则该项权利要求相对于现有技术没有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性。具体到本案：
权利要求1要求保护一种通过串联质谱法测定所取的生物样品中一种或多种二羟基维生素D 代谢物的量的方法，对比文件1公开了一种通过串联质谱法检测待测样品中一种或多种维生素D代谢物的方法（参见说明书第0034-0038段、0042段），并具体公开了：该方法包括：(a)产生所述一种或多种维生素D代谢物和内标的前体离子；(b)产生所述前体离子的一种或多种碎片离子；(c) 检测步骤(a)或(b)或两者中产生的一种或多种所述离子的量，并且将检测的离子的量与所述样品中的所述维生素D代谢物的量相关联，所述维生素D代谢物是选自25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3的一种或多种，样品可以是取自人的生物样品例如血、血浆，电离方法包括大气压化学电离（APCI）等。
通过对比可知，对比文件1公开的一种通过串联质谱法检测待测样品中维生素D代谢物的方法，以及维生素D代谢物是选自25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3的一种或多种，对应于权利要求1中的通过串联质谱法测定所取的生物样品中一种或多种二羟基维生素D 代谢物的量的方法；对比文件1中的电离方法包括大气压化学电离，维生素D代谢物是选自1,25-二羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3，以及步骤（a）、（b）、（c），分别对应于权利要求1中的步骤（i）、步骤（ii）中的分别产生所述一种或多种二羟基维生素D 代谢物和所述内标的所述前体离子的一种或多种碎片离子，以及步骤（iii）。
权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别技术特征为：所述一种或多种碎片离子包括选自质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5 的离子的一种或多种离子。基于上述区别技术特征，确定权利要求1相对于对比文件1实际要解决的技术问题是：如何具体确定适于分析的碎片离子质/荷比。
对于该区别技术特征，对比文件1公开了（参见说明书0035段）：所述二羟基维生素D代谢物选自1,25-二羟基维生素D2（即1α,25(OH)2D2）、1,25-二羟基维生素D3（即1α,25(OH)2D3）中的一种或多种。1,25-二羟基维生素D2对应于1α,25(OH)2D2，1,25-二羟基维生素D3对应于1α,25(OH)2D3。在明确了待测物质即二羟基维生素D代谢物的具体类型后，通过质谱法检测该待测物质时确定碎片离子的质/荷比是本领域技术人员常规的试验技能。上述区别技术特征中的质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5 的碎片离子，是本领域技术人员常规选择具体的碎片离子质/荷比。以下现有技术可以佐证上述观点：（①对比文件2中选择使用FAB方式质谱分析1,25-二羟基维生素D3的类似物D3-PTAD，而从对比文件2图3（b）中可以看出，其314质/荷比的碎片离子峰进一步解离形成了明显的134和152的碎片离子峰，与质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子相近，而FAB与权利要求1所使用的APCI同属于“软性电离”方式，本领域技术人员都了解，其实施效果虽有差异，但在碎片离子峰捕捉能力上并无本质不同，FAB能捕捉到的碎片离子峰，本领域技术人员可以合理预期APCI方式也可以捕捉到；②在2006年06月01日发表的中南大学博士学位论文“API-MS离子化规律及LC-MS联用技术在药物和内源性物质代谢中的应用研究” 中，其利用ESI APCI的方式分析化学物质质谱，在正文第20页中给出了1,25-二羟基维生素D3的类似物25-羟基维生素D3的质谱图，可以看到图中在120-160质/荷比的范围内出现了多个有分析价值的碎片离子峰，明显存在与质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子非常相近的峰值。在利用APCI方式电离分析1,25-二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3的碎片离子峰时，本领域技术人员可以合理预期其可以产生质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子，对上述质/荷比的碎片离子峰捕捉并分析是本领域技术人员的常规选择，这对于本领域技术人员而言并不存在实现的障碍，也在本领域技术人员的合理预期范围内，也没有产生任何预料不到的技术效果。
复审请求人在意见陈述书中认为：（1）对比文件2和中南大学博士学位论文“API-MS离子化规律及LC-MS联用技术在药物和内源性物质代谢中的应用研究”是两篇现有技术文件，在复审阶段不允许引用新的现有技术文件。
对此，合议组认为：1）对比文件2是一篇期刊文献，列举对比文件2和该博士论文的特定公开内容，这种列举不是作为对比文件，而是通过列举现有技术文献中的已公开事实作为公知常识性证据，用于佐证区别技术特征中的质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5 的碎片离子，是本领域技术人员常规选择的具体的碎片离子质/荷比。这一点，在复审通知书中进行了明确地说明。
复审请求人认为：（2）对比文件2采用的手段是FAB，图3（b）显示的是CID谱图，本申请的前体离子具有399±0.5的质荷比，基于对比文件2的教导，不能容易想到本申请方案。
对此，合议组认为：对比文件2中是先用FAB进行电离，而用CID针对FAB电离出的314/298等碎片离子进而二次电离，该二次电离是在前次电离产生前体离子的基础上进行的，权利要求1中的方案同样是在APCI电离的基础上再次“分别产生……前体离子的一种或多种碎片离子”，虽然权利要求1没有明确指出以何种具体方式进行二次电离，FAB与权利要求1所使用的APCI相比，在碎片离子峰的定性的产生上作用相似，在定性分析中是可以互相换用的，从本领域技术人员的角度来看，对比文件2对于二羟基维生素D的代谢物二次电离后能够生成质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子给出了技术启示。
复审请求人认为：（3）通知书中所引用的《色谱联用技术》并没有公开权利要求1限定的具体质荷比，依据对比文件2的图2内容，前体离子和碎片离子的峰无法合理预期。
对此，合议组认为：《色谱联用技术》虽然没有公开具体的质荷比，但是其对于APCI的记载内容是本领域技术人员公知的，其证明了APCI适用于1,25-二羟基维生素D2和1,25-二羟基维生素D3的质谱分析，而且其特性适于使得质/荷比151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子出现。
综上所述，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识以得到权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2是从属权利要求，其附加技术特征属于本领域的常规选择。对比文件1公开了内标可选含重氢维生素D代谢物。在该内容的基础上，本领域技术人员基于实际需要，对所述具体内标的选择属于本领域的常规选择，因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的前提下，权利要求2不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求3是从属权利要求，附加技术特征对权利要求1中的二羟基维生素D代谢物作了进一步的限定。上述具体代谢物已被对比文件1公开（参见说明书第35段第9-13行），而代谢物的所述量在单一测试中进行测定，这是本领域的常规选择。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的前提下，权利要求3不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求4-9是从属权利要求，其附加技术特征对二羟基维生素D代谢物和内标作了进一步的限定，其中某一些的特定位置用氘原子取代，并对分析中的前体离子或一种或多种碎片离子的质/荷比作了进一步的限定。然而，上述二羟基维生素D代谢物和内标1α,25(OH)2D2 和1α,25(OH)2D3已被对比文件1公开（参见说明书第35段第9-13行），换用其特定氘原子取代物也是本领域的常规选择，而本领域技术人员可以合理预期其可以产生质/荷比为151.12±0.5 和135.12±0.5的碎片离子，对上述质/荷比411.35±0.5、399.35±0.5、592.37、317.12、577.37、314.12的碎片离子峰捕捉并分析，对于本领域技术人员而言并不存在实现的障碍，也在本领域技术人员的合理预期范围内，也没有产生任何预料不到的技术效果。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的前提下，权利要求4-9不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求10是从属权利要求，对于其附加技术特征，对比文件1公开了（参见说明书第4页左栏第1-3行）：在电离之前从所述生物样品纯化所述一种或多种二羟基维生素D代谢物。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的前提下，权利要求10不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求11是从属权利要求，对比文件1公开了（参见说明书0046段）：基于内标物所产生的前体和碎片离子构建一标准曲线，并且根据碎片离子的丰度计算质谱源物质的量，对应于基于所述内标的前体和碎片离子构建标准曲线并且利用所述标准曲线确定所述生物样品中所述一种或多种二羟基维生素D 代谢物的量。因此在其引用的权利要求1不具备创造性的前提下，权利要求11也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求12请求保护一种通过串联质谱法测定取自人的生物样品中1α,25二羟基维生素D2(1α,25(OH)2D2)的量的方法。对比文件1（参见说明书第0034-0038段、0042段、权利要求1-4）公开了：一种通过串联质谱法检测待测样品中维生素D代谢物的方法，所述维生素D代谢物可选1,25-二羟基维生素D2；在离子化步骤之前包括使用色谱手段进行富集的步骤，富集所用的色谱手段具体是HPLC，一种维生素D代谢物的串联质谱定性定量方法，具体包括：（a）通过质子化或者脱水产生所述代谢物的前体离子；（b）产生所述前体离子的碎片离子；（c）检测步骤（a）和（b）所述产生的一种或多种离子的存在与量，并将其与维生素D代谢物的存在与量联系起来。
通过对比可知，对比文件1中的一种通过串联质谱法检测待测样品中维生素D代谢物的方法，所述维生素D代谢物可选1,25-二羟基维生素D2，对应于权利要求12中的通过串联质谱法测定取自人的生物样品中1α,25 二羟基维生素D2(1α,25(OH)2D2)的量的方法，另外，1α,25(OH)2D2是常见的人体代谢物，因此对比文件1中的步骤（a）-（c）对应于权利要求12中的步骤（b）的通过高效液相层析(HPLC)富集来自步骤(a)的衍生的1α,25(OH)2D2，以及步骤(c)中的产生从步骤(b)获得的所述衍生的1α,25(OH)2D2 的前体离子，步骤(d)中的产生所述前体离子的一种或多种碎片离子，以及步骤(e)通过质谱法检测步骤(c)或(d)或两者中产生的一种或多种所述离子的量并且将检测的离子与所述来自人的生物样品中的所述1α,25(OH)2D2 的量相关联。
权利要求12要求保护的技术方案和对比文件1公开的内容相比，区别技术特征为：（1）用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生1α,25(OH)2D2；（2）前体离子的质荷比为586.37±0.5；碎片离子的至少一种包括质荷比为314.12±0.5的离子；基于上述区别技术特征，可以确定本发明实际解决的技术问题是：采用何种衍生试剂对1α,25(OH)2D2进行衍生，以及如何确定合适的前体离子和碎片离子的质/荷比。
对于区别技术特征（1），属于相同的串联质谱技术领域的对比文件2（参见第118页左栏第二段）公开了一种通过串联质谱法检测待测样品中维生素D代谢物的方法，其中包括在质谱法之前用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(即PTAD)对维生素D代谢物进行衍生。上述技术特征在对比文件2中所起的作用与其在本发明中为解决其技术问题所起的作用相同，都是用于衍生维生素D代谢物，也就是说对比文件2给出了将该技术特征用于该对比文件1以解决其技术问题的启示，根据该技术启示，本领域技术人员容易想到利用PTAD对1α,25(OH)2D2进行衍生，无需付出创造性劳动，也没有产生预料不到的技术效果。
对于区别技术特征（2），对比文件2中第119页图2（c）中可以看出，与权利要求12中的1α,25(OH)2D2-PTAD结构相似的1α,25(OH)2D3-PTAD在590和314的质/荷比上产生了极强的离子峰，在此启示下，在利用APCI方式电离分析1,25-二羟基维生素D2的碎片离子峰时，本领域技术人员可以根据其前体带电离子和碎片离子的可能情况，合理预期其可以产生质/荷比为586.37±0.5的前提离子和314.12±0.5的碎片离子，是本领域技术人员的常规选择，对上述质/荷比的碎片离子峰捕捉并分析对于本领域技术人员而言并不存在实现的障碍，也在本领域技术人员的合理预期范围内，也没有产生任何预料不到的技术效果。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的公知常识以得到权利要求12所要求保护的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，权利要求12所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求13进一步限定了权利要求12，对于其附加技术特征：对比文件1公开了（参见说明书0035-0038段）在衍生之前通过高湍流液相层析（HTLC）纯化富集1α,25(OH)2D2，而免疫纯化是本领域进行纯化的常规选择。因此当其引用的权利要求12不具备创造性时，该从属权利要求13也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求14进一步限定了权利要求12，其附加技术特征的代谢物选择已经被对比文件1公开（参见说明书第35段第9-13行），因此当其引用的权利要求12不具备创造性时，该从属权利要求14所要求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
权利要求15进一步限定了权利要求14，对于其附加技术特征：对比文件2公开了1α,25(OH)2D3在质谱法之前用4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮(PTAD)衍生，且衍生应用的作用相同，再者，对比文件2中第119页图2（c）中可以看出，与权利要求12中的1α,25(OH)2D2-PTAD结构相似的1α,25(OH)2D3-PTAD在574的质/荷比上产生了极强的离子峰。因此当其引用的权利要求不具备创造性时，该从属权利要求所要求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
权利要求16-17分别进一步限定了权利要求12，其附加技术特征：生物样品包括血浆及血清，前体离子包括通过APCI电离，都已经被对比文件1公开（说明书第36段第9-14行、第42段第4-11行），因此当其引用的权利要求不具备创造性时，该从属权利要求所要求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。
综上所述，权利要求1-17不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年04月17日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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