发明创造名称：采用具有多形式官能性的颗粒对免疫球蛋白G制备物的色谱纯化
外观设计名称：
决定号：185495
决定日：2019-07-16
委内编号：1F250193
优先权日：2012-05-31
申请（专利）号：201380040418.9
申请日：2013-01-21
复审请求人：新加坡科技研究局
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：唐慧
合议组组长：杨振宇
参审员：李晨
国际分类号：C07K1/16，C07K16/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款，专利法第31条第1款
决定要点
：如果通过修改，删除了不符合专利法相关规定的权利要求，则可视为克服了不符合相关规定的缺陷。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380040418.9，名称为“采用具有多形式官能性的颗粒对免疫球蛋白G制备物的色谱纯化”的发明专利申请。申请人为新加坡科技研究局。本申请的申请日为2013年01月21日，优先权日为2012年05月31日，公开日为2015年04月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月10日以权利要求1-94不符合专利法第31条第1款有关单一性的规定，权利要求1-24、82-94不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2015年01月29日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-251段（即第1-49页）、说明书附图图1-图6、说明书摘要；2017年08月11日提交的权利要求第1-94项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 从含有期望的蛋白的样品纯化所述期望的蛋白的柱色谱方法，所述柱色谱方法由以下步骤组成：
(i)提供具有带正电的多孔颗粒的填充色谱柱，其中所述带正电的多孔颗粒包含阴离子交换颗粒；
(ii)将所述柱平衡至样品的期望的蛋白待洗脱的条件；
(iii)将样品与所述柱接触使得上样至所述柱的样品的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成；以及
(iv)从所述柱收集期望的蛋白，其中期望的蛋白处在更纯的状态并处在平衡所述柱的条件，并且
其中期望的蛋白是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体衍生物或IgG抗体融合蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，其中期望的蛋白是IgG抗体。
3. 如权利要求1所述的方法，其中期望的蛋白源于选自以下形式的IgG抗体：Fab片段、F(ab’)2片段、微抗体、双抗体、VHH结构域、Fc-融合蛋白或具有与IgG抗体相似电荷性质的IgG衍生物。
4. 如权利要求1－3中任一项所述的方法，其中样品可以是未纯化的、中等水平纯度的或高度纯化的。
5. 如权利要求1－4中任一项所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的99％。
6. 如权利要求5所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的95％。
7. 如权利要求6所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电 的多孔颗粒的空隙体积的90％。
8. 如权利要求7所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的80％。
9. 如权利要求8所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的70％。
10. 如权利要求9所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的10％。
11. 如权利要求10所述的方法，其中样品体积小于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的5％。
12. 如权利要求1－4中任一项所述的方法，其中所述柱仅用带正电的多孔颗粒填充，并且样品体积小于填充的柱体积的40％。
13. 如权利要求1－12中任一项所述的方法，其中所述柱被平衡至pH大约4至大约9。
14. 如权利要求1－13中任一项所述的方法，其中所述柱被平衡至电导率值大约0.1mS/cm至大约30mS/cm。
15. 如权利要求1－14中任一项所述的方法，其中所述柱被用具有选自以下pH范围的缓冲液平衡：(1)大约6.5至大约8.5，(2)大约6.5至大约7.5，以及(3)大约7.5至大约8.5。
16. 如权利要求14－15中任一项所述的方法，其中所述柱被平衡至电导率值大约0.1mS/cm至大约15mS/cm。
17. 如权利要求1－16中任一项所述的方法，其中所述柱被平衡至处在或接近用于对洗出液进行后续纯化步骤的上样条件的条件。
18. 如权利要求1－17中任一项所述的方法，其中样品具有大约2至大约10的pH范围内的pH。
19. 如权利要求1－18中任一项所述的方法，其中样品具有大约0.1mS/cm至大约250mS/cm的电导率值。
20. 如权利要求1－19中任一项所述的方法，其中所述柱平衡的条件包括大约4至大约9的pH范围内的pH。
21. 如权利要求1－20中任一项所述的方法，其中所述柱平衡的条件包括大约0.1mS/cm至大约30mS/cm的范围内的电导率。
22. 如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中阴离子交换颗粒具有正电性，至少部分正电性是由选自以下的部分提供的：三(2-氨基乙基)胺、聚精氨酸、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚烯丙胺、二亚乙基氨基乙基、亚乙基二氨基、伯氨基部分、仲氨基部分、叔氨基部分和季氨基部分。
23. 如权利要求1－11中任一项所述的方法，其中所述柱含有除电正性多孔颗粒之外的颗粒。
24. 如权利要求23所述的方法，其中电正性多孔颗粒和额外颗粒的至少一种具有一个或更多个选自以下的二级化学官能性：阳离子交换、疏水相互作用、氢键结合、π-π相互作用和金属螯合。
25. 从含有期望的蛋白的样品纯化所述期望的蛋白的方法，所述方法包括将样品与聚集体解离剂、有机调节剂、抗病毒剂或酰脲接触， 以及进行柱色谱方法，所述柱色谱方法由以下步骤组成：
(i)提供具有带正电的多孔颗粒的填充色谱柱，其中所述带正电的多孔颗粒包含阴离子交换颗粒；
(ii)将所述柱平衡至样品的期望的蛋白待洗脱的条件；
(iii)将样品与所述柱接触使得上样至所述柱的样品的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成；以及
(iv)从所述柱收集期望的蛋白，其中期望的蛋白处在更纯的状态并处在平衡所述柱的条件，并且
其中期望的蛋白是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体衍生物或IgG抗体融合蛋白。
26. 如权利要求25所述的方法，其中聚集体解离剂是有机阳离子。
27. 如权利要求26所述的方法，其中有机阳离子选自：依沙吖啶、9-氨基吖啶、3,6-吖啶二胺(普鲁黄素)、吖啶锁辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、喹吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、吩番红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(3,6-二氨基-10-甲基吖啶氯化物和3,6-二氨基吖啶)、精氨酸和氯己定。
28. 如权利要求27所述的方法，其中有机阳离子是依沙吖啶、或氯己定、或精氨酸、或它们的盐。
29. 如权利要求28所述的方法，其中有机阳离子是依沙吖啶或其盐。
30. 如权利要求27－29中任一项所述的方法，其中有机阳离子以大约0.01％至大约0.05％的量存在。
31. 如权利要求27－29中任一项所述的方法，其中有机阳离子以 小于大约0.01％的量存在。
32. 如权利要求27－29中任一项所述的方法，其中有机阳离子以小于大约0.005％的量存在。
33. 如权利要求27－29中任一项所述的方法，其中有机阳离子以小于大约0.001％的量存在。
34. 如权利要求27－29中任一项所述的方法，其中有机阳离子以大约0.020至大约0.025％的量存在。
35. 如权利要求27所述的方法，其中在将样品与所述柱接触的步骤之前，用超过一种选自以下的有机阳离子处理样品：依沙吖啶、精氨酸和氯己定及它们的盐。
36. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于1％的浓度提供。
37. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以大约0.01％至大约0.05％的浓度提供。
38. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于大约0.01％的浓度提供。
39. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于大约0.005％的浓度提供。
40. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于大约0.001％的浓度提供。
41. 如权利要求35所述的方法，其中用于在将样品与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以大约0.020至大约0.025％的浓度提供。
42. 如权利要求25－41中任一项所述的方法，其中所述有机调节剂选自：非离子有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲。
43. 如权利要求42所述的方法，其中将样品与有机调节剂接触在将样品与有机阳离子接触之前发生。
44. 如权利要求42所述的方法，其中将样品与有机调节剂接触与将样品与有机阳离子接触基本上同时发生。
45. 如权利要求42所述的方法，其中将样品与有机调节剂接触在将样品与有机阳离子接触之后发生。
46. 如权利要求42－45中任一项所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的非离子有机聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。
47. 如权利要求46所述的方法，其中非离子有机聚合物具有大约500D或更小的平均分子量。
48. 如权利要求42－45中任一项所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的有机溶剂：乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇和苯氧基乙醇。
49. 如权利要求42－48中任一项所述的方法，其中有机调节剂以大约1％(w/v)或更大的浓度提供。
50. 如权利要求42－45中任一项所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的表面活性剂：Tween、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷。
51. 如权利要求50所述的方法，其中表面活性剂以大约1％(w/v)或更小的浓度提供。
52. 如权利要求50所述的方法，其中表面活性剂以大约0.1％(w/v)或更小的浓度提供。
53. 如权利要求42－45中任一项所述的方法，其中有机调节剂是以亚饱和量提供的酰脲。
54. 如权利要求53所述的方法，其中酰脲选自：尿素、乙内酰脲和尿囊素。
55. 如权利要求25－53中任一项所述的方法，其中将样品与抗病毒剂接触。
56. 如权利要求55所述的方法，其中抗病毒剂是具有至少一个正电荷的非多价有机阳离子。
57. 如权利要求55所述的方法，其中抗病毒剂缺乏正电荷。
58. 如权利要求55－57中任一项所述的方法，其中抗病毒剂以小于大约1％(w/v)的量存在。
59. 如权利要求58所述的方法，其中抗病毒剂以小于大约0.1％(w/v)的量存在。
60. 如权利要求59所述的方法，其中抗病毒剂以小于大约0.01％(w/v)的量存在。
61. 如权利要求60所述的方法，其中抗病毒剂以小于大约0.001％(w/v)的量存在。
62. 如权利要求25－61中任一项所述的方法，在将样品与所述柱接触的步骤之前，所述方法包括将样品与足够使得酰脲在样品中过饱和的量的酰脲接触，并将含有期望的蛋白的上清与样品的固体或不溶解部分分开。
63. 如权利要求62所述的方法，其中将样品与酰脲接触在将样品与有机阳离子接触之前发生。
64. 如权利要求62所述的方法，其中将样品与酰脲接触与将样品与有机阳离子接触基本上同时发生。
65. 如权利要求62所述的方法，其中将样品与酰脲接触在将样品与混合化学性质的可溶性有机阳离子接触之后发生。
66. 如权利要求62－65中任一项所述的方法，其中酰脲选自：尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟铝、尿囊素铝、Hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧代基-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
67. 如权利要求66所述的方法，其中酰脲是尿囊素。
68. 如权利要求66所述的方法，其中酰脲是尿酸。
69. 如权利要求67所述的方法，其中尿囊素是以大于0.5％(w/v) 的量存在。
70. 如权利要求69所述的方法，其中尿囊素是以大于大约1％(w/v)的量存在。
71. 如权利要求68所述的方法，其中尿酸是以大于0.0025％(w/v)的量存在。
72. 如权利要求71所述的方法，其中尿酸是以大于大约0.01％(w/v)的量存在。
73. 如权利要求71所述的方法，其中尿酸是以大于大约0.1％(w/v)的量存在。
74. 如权利要求71所述的方法，其中尿酸是以大于大约1％(w/v)的量存在。
75. 如权利要求25－74中任一项所述的方法，在将样品与所述柱接触之前，所述方法包括去除不溶性固体。
76. 如权利要求75所述的步骤，其中在将样品与有机调节剂、抗病毒剂或过饱和的酰脲接触之后，进行去除不溶性固体。
77. 如权利要求25－76中任一项所述的方法，其中在将样品与有机调节剂、抗病毒剂过或饱和的酰脲接触之后，将样品与具有化学部分的固体材料接触，所述化学部分能够吸附至少一部分的加至样品的有机调节剂、抗病毒剂和酰脲。
78. 如权利要求77所述的方法，其中固体材料由加至样品的颗粒组成并随后从样品分离。
79. 如权利要求77所述的方法，其中固体材料由样品能穿过或跨过的膜、单块材料或颗粒填充柱组成。
80. 如权利要求77－79中任一项所述的方法，其中固体材料上的化学部分可以包括一个或多个具有阳离子交换、阴离子交换、疏水相互作用、氢键结合、π-π相互作用或金属螯合的能力的基团。
81. 如权利要求77－80中任一项所述的方法，在将样品与具有能够吸附至少一部分的加至样品的有机调节剂、抗病毒剂和酰脲的化学部分的固体材料接触的步骤之后，并且在将样品与所述柱接触的步骤之前，所述方法包括从样品分离或从样品去除不溶性固体的额外步骤。
82. 如权利要求1－81中任一项所述的方法，其中样品含有聚集体，其中更纯状态的期望的蛋白与样品相比具有降低的聚集体含量。
83. 如权利要求82所述的方法，其中聚集体包括期望的蛋白的同源聚集体。
84. 如权利要求83所述的方法，其中在样品中期望的蛋白的同源聚集体基本上被消除。
85. 如权利要求82所述的方法，其中聚集体包括期望的蛋白和污染物的异源聚集体。
86. 如权利要求85所述的方法，其中异源聚集体具备与期望的蛋白基本上相同的流体动力学大小。
87. 如权利要求85所述的方法，其中污染物是核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质、或细胞培养基成分。
88. 如权利要求85－87中任一项所述的方法，其中期望的蛋白和污染物的异源聚集体基本上被消除。
89. 如权利要求1－88中任一项所述的方法，其中样品含有一种或更多污染物，其中更纯状态的期望的蛋白与样品相比具有降低的所述污染物的含量。
90. 如权利要求1－89中任一项所述的方法，其中所述期望的蛋白被收集在等于或小于所述柱的空隙体积的体积中，并且所收集的体积包含大于80％的所述样品中存在的所述期望的蛋白。
91. 如权利要求1或90所述的方法，其中在步骤(iv)中收集的所述期望的蛋白具有90％或更高的纯度。
92. 如权利要求90所述的方法，其中收集之后的期望的蛋白具有约7.5至8.5的pH。
93. 如权利要求1或90所述的方法，其中所述样品中期望的蛋白待洗脱的条件包括的pH或电导率不同于在步骤(iii)中与所述柱接触的所述样品的pH或电导率。
94. 能够便利地实施权利要求1－93中任一项的方法的试剂盒。”
驳回决定指出：（1）权利要求1-24、82-94（部分），权利要求25-74、82-94（部分），权利要求75-76、82-94（部分）和权利要求77-81、82-94（部分）之间相应的技术特征是都涉及一种使用带正电的多孔颗粒填充色谱柱用于纯化IgG抗体，或其片段、衍生物或融合蛋白，但对比文件1（CN1311797A，公开日：2001年09月05日）公开了使用阴离子交换树脂（即带正电的多空颗粒填充色谱柱）纯化IgG。对于是仅运行阴离子交换柱，还是在之后继续运行阳离子交换柱可以根据纯化需求进行选择，对于样品体积可以根据色谱柱的交换容量进行选择调整，因此上述4项发明之间相应的技术特征不能构成特定技术特征，不属于一个总的发明构思，不符合专利法第31条第1款的规定。（2）对于权利要求1-24、82-94（部分）而言，权利要求1要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于① 权利要求1仅运行阴离子交换柱，之后不再运行阳离子交换柱；② 权利要求1限定所述柱的样品体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成；③ 权利要求1进一步限定先平衡再上样，以及洗脱后的IgG处在平衡所述柱的条件。权利要求1实际要解决的技术问题是：提供另外一种IgG的纯化手段。但，①根据具体的研究目的和预期效果，本领域技术人员有动机选择仅运行阴离子交换柱，还是在其后再运行阳离子交换柱进一步纯化目的蛋白。而本申请省略了运行阳离子交换柱的步骤，也失去了阳离子交换柱进一步纯化目的蛋白的技术效果。②阴离子交换色谱的交换容量可以通过实验测定，其产生的效果可以合理预期。③在上样之前进行平衡是所属技术领域中所常用的技术手段，洗脱后的IgG处在平衡所述柱的条件属于本领域公知常识，并不具备预料不到的技术效果。因此在对比文件1的基础上结合本领域常规技术获得权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相似的理由，权利要求2-12、17、82-91也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。从属权利要求13-16、18-23、92-94的附加技术特征或是本领域通过常规技术手段经有限的实验即可获得，或是常规技术手段；从属权利要求24的附加技术特征被对比文件1公开，因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，这些从属权利要求也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。（3）对比文件1与本申请均用了流-穿（flow-through）模式运行阴离子交换柱纯化IgG，这种模式并不需要洗脱。根据IgG的纯度需求、纯化成本、操作简繁等实际因素，本领域技术人员可以决定是否需要后续的阳离子交换步骤阴离子交换柱是否需要阳离子交换步骤，并可以预期纯化效果。根据公知常识（《生物化学实验指导》，袁榴娣主编，南京：东南大学出版社，2007年8月第1版第1次印刷，第38-40页）可知加样量的多少和体积主要取决于待分离组分的浓度及其与交换剂的亲和力，色谱纯化过程中上样体积是本领域技术人员能够优化和/或控制的常规参数之一，流-穿模式同样如此。而本申请图1中左右两幅图的样品并不相同，不足以证明右图中基本上纯的IgG是由“样品体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成”所带来的技术效果。
申请人新加坡科技研究局（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月24日向专利复审委员会提出了复审请求，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）以闭合方式限定的权利要求1不包括其他的，例如样品平衡或者洗涤步骤。而对比文件1描述的阴离子交换柱的常规方法flow-through模式制备的蛋白还需下一步的纯化工艺，例如需要第二下游阳离子交换柱，对比文件1也没有公开、教导或提示有关样品平衡的技术特征。（2）“上样至所述样品的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成”是区别技术特征，本申请图1左图表明，IgG在空隙体积范围内以高度纯化的形式洗脱，空隙体积之后洗脱出的部分含大量蛋白/聚集体污染物。因此，施加于柱的样品小于或等于柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积就能提供高度纯化的IgG抗体，而向色谱柱加载额外的体积或引入洗涤步骤，会有显著量的污染蛋白污染的抗体。对比文件1的实施例表明，其样品体积超过了空隙体积100倍，并教导进一步洗涤阴离子交换柱，那么如本申请图1所示，则会导致抗体制备产物被污染。现有技术没有限定上样量的发现，也没有证据表明现有技术意识到上述技术问题，或者给出合理和确凿的原因导致本领域技术人员会限制样品上样体积。驳回决定中引用的《生物化学实验指导》使用的是“结合-洗脱”模式的色谱柱，而本申请涉及的是“流过”模式运行的阴离子交换柱，且没有关于限定施加于阴离子交换柱样品体积的教导。即在“流过”模式下限制样品体积不属于公知常识，也不是常规认为可用于优化色谱效果的参数。（3）在权利要求1具有创造性的基础上，权利要求1-94请求保护的发明之间具备单一性，符合专利法第31条第1款的规定。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月03日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：（1）本申请与对比文件1均为阴离子交换柱流穿模式（flow-through），本申请权利要求也包括平衡的步骤（ii）。对比文件1中其他步骤（如进一步纯化）的功能和原理是本领域技术人员熟知的，省略这些步骤其相应的效果也将消失。另外，快速、低成本、简单、高效的纯化效果是本领域普遍追求的目标，在缺乏严格对比实验也未阐明原理的情况下，没有证据表明本申请相对于对比文件1进一步解决了上述声称的技术问题。（2）本申请图1中均是以35%的柱体积上样至两种不同的色谱柱，左图为UNOsphere Q柱，右图为蛋白A柱；图1表明流-穿阴离子交换色谱纯化曲妥珠单抗的产物情况（说明书第110、237-240段）。因此图1表明流-穿阴离子交换色谱纯化曲妥珠单抗的效果与蛋白A纯化曲妥珠单抗的效果对比，不能表明选择35%的上样体积取得了纯度更高的技术效果，更不能由此概括得出因选择了“施加于柱的样品体积限制为小于或等于柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积”而使得所述流-穿阴离子交换色谱取得的预料不到的技术效果。如驳回决定中引用的公知常识性证据，本领域根据待纯化样品的具体情况能够按常规选择上样体积。本领域公知，结合-洗脱模式是上样后将目标分子吸附到色谱柱上，放弃流出的杂质，然后通过洗脱步骤收集洗脱峰从而将目标分子从柱上洗脱回收。然而，流-穿模式则是上样后将杂质吸附于色谱柱上，目标分子流穿出来，收集流穿液，因此，流-穿模式下不必包括洗脱步骤，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月05日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求1要求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别技术特征在于：①权利要求1仅运行阴离子交换柱，之后不再进行阳离子交换；② 权利要求1限定所述柱的样品体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成；对比文件1不涉及样品体积与柱内空隙体积的关系。基于上述区别技术特征，确定权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种工艺简化的有效的蛋白色谱纯化方法。但是，对于区别技术特征①，由对比文件1的技术方案可以看出，经过阴离子交换DEAE-Sepharose层析后，大部分的杂质已经结合到了阴离子交换柱上，那么此时收集得到的穿过柱子不与树脂结合的IgG已经得到了纯化。是否需要再进一步纯化得到的IgG，例如再结合阳离子交换层析，本领域技术人员可以根据生产目标，并结合快速、低成本、简单、高效等普遍技术追求有动机选择不再进行阳离子交换层析。对于区别技术特征②，本领域技术人员公知，进行层析分离时，“上样量越少和上样体积越小，则分离效果越好”，对于制备性柱层析，加样量不超过床体积1%-3%。且最大上样量必须在具体实验条件下通过反复实验来决定（参见陈来同等编，《生物化学产品制备技术（2）》，科学技术文献出版，2004年1月第1版，第15页）。因此为了得到更有效的色谱分离方法，本领域技术人员有动机进行上样量和上样体积的实验，而该实验属本领域技术人员能力范围所及，并不需要付出创造性的劳动。综上所述，在对比文件1的基础上结合本领域常规技术获得权利要求1要求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于类似的理由，权利要求2-12、17、82-91也不具备创造性。从属权利要求13-16、18-23、92-93的附加技术特征是本领域技术人员使用常用的技术手段和有限的试验，不需要付出创造性劳动即可确定的；从属权利要求24的附加技术特征被对比文件1公开，因此在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，这些权利要求也不具备创造性。在引用的方法不具备创造性的情况下，权利要求94要求保护的试剂盒也不具备创造性。（2）权利要求1-24、82-94（部分），权利要求25-74、82-94（部分），权利要求75-76、82-94（部分）与权利要求77-81、82-94（部分）组成的4组权利要求的相同技术特征“从含有期望的蛋白的样品纯化所述期望的蛋白的柱色谱方法，包括以下步骤：(i)提供具有带正电的多孔颗粒的填充色谱柱，(ii)将所述柱平衡至样品的期望的蛋白待洗脱的条件，(iii)将样品与所述柱接触使得上样至所述柱的样品的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的孔隙体积的组成，(iv)从所述柱收集期望的蛋白，其中期望的蛋白处在更纯的状态并处在平衡所述柱的条件；其中期望的蛋白是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体衍生物或IgG抗体融合蛋白”相对于对比文件1与公知常识的结合不具备创造性，因此上述4组权利要求缺乏相同或相应的特定技术特征而不属于一个总的发明构思，权利要求1-94不符合专利法第31条第1款有关创造性的规定。
复审请求人于2019年04月16日提交了意见陈述书和权利要求书全文替换页（共5页42项）。相对于驳回决定和复审通知书针对的文本，主要修改在于：删除原权利要求1-24、43-45、53-54、62-68、71-81、90-94，其余权利要求形成新的权利要求1-42，适应性调整引用关系；原权利要求25修改为权利要求1时，将技术特征“将样品与聚集体解离剂、有机调节剂、抗病毒剂或酰脲接触”修改为“(a)将所述样品与尿囊素接触，所述尿囊素的量在所述样品中过饱和；(b)将含有所述期望的蛋白的上清与所述样品的固体或不溶解部分分开；以及（c）进行色谱柱方法”等。复审请求人认为：（1）修改后的权利要求1为原权利要求25，其在原权利要求1的基础上增加了“将样品与聚集体解离剂、有机调节剂、抗病毒剂或酰脲接触”的步骤，并做了进一步限定，因此修改后的权利要求并不是直接删除了评价过的原权利要求1，且复审通知书进行单一性评价时引用了对比文件1，因此属于“不明显缺乏单一性”的情形，基于此，本申请的修改符合专利法实施细则第61条的规定。（2）因对比文件1没有公开或教导新权利要求1中步骤（a）和（b），相对于对比文件1新的权利要求1具有创造性，其从属权利要求2-42也具备创造性。基于具有创造性的理由，权利要求1-42也具备单一性。
修改后的权利要求书如下：
“1. 从含有期望的蛋白的样品纯化所述期望的蛋白的方法，所述方法包括
(a)将所述样品与尿囊素接触，所述尿囊素的量在所述样品中过饱和；
(b)将含有所述期望的蛋白的上清与所述样品的固体或不溶解部分分开；以及
(c)进行柱色谱方法，所述柱色谱方法由以下步骤组成：
(i)提供具有带正电的多孔颗粒的填充色谱柱，其中所述带正电的多孔颗粒包含阴离子交换颗粒；
(ii)将所述柱平衡至所述期望的蛋白待洗脱的条件；
(iii)将含有所述期望的蛋白的上清与所述柱接触使得上样至所述柱的上清的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的空隙体积的体积组成；以及
(iv)从所述柱收集期望的蛋白，其中期望的蛋白处在更纯的状态并处在平衡所述柱的条件，并且
其中期望的蛋白是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体衍生物或IgG抗体融合蛋白。
2. 如权利要求1所述的方法，还包括使所述样品与有机阳离子接触。
3. 如权利要求2所述的方法，其中有机阳离子选自：依沙吖啶、9-氨基吖啶、3,6-吖啶二胺、吖啶锁辛、吖啶氯、吖啶橙、喹吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖胺、吩番红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄、精氨酸和氯己定。
4. 如权利要求3所述的方法，其中有机阳离子是依沙吖啶、或氯己定、或精氨酸、或它们的盐。
5. 如权利要求4所述的方法，其中有机阳离子是依沙吖啶或其盐。
6. 如权利要求3－5中任一项所述的方法，其中有机阳离子以0.01％至0.05％的量存在。
7. 如权利要求3－5中任一项所述的方法，其中有机阳离子以小于0.01％的量存在。
8. 如权利要求3－5中任一项所述的方法，其中有机阳离子以小于0.005％的量存在。
9. 如权利要求3－5中任一项所述的方法，其中有机阳离子以小于0.001％的量存在。
10. 如权利要求3－5中任一项所述的方法，其中有机阳离子以0.020至0.025％的量存在。
11. 如权利要求3所述的方法，其中在将所述上清与所述柱接触的步骤之前，用超过一种选自以下的有机阳离子处理所述样品：依沙吖啶、精氨酸和氯己定及它们的盐。
12. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于1％的浓度提供。
13. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以0.01％至0.05％的浓度提供。
14. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于0.01％的浓度提供。
15. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于0.005％的浓度提供。
16. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以小于0.001％的浓度提供。
17. 如权利要求11所述的方法，其中用于在将所述上清与所述柱接触的步骤之前处理样品的有机阳离子以0.020至0.025％的浓度提供。
18. 如权利要求1－17中任一项所述的方法，还包括将所述样品与选自以下的可溶性有机调节剂接触：非离子有机聚合物、有机溶剂和表面活性剂。
19. 如权利要求18所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的非离子有机聚合物：聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。
20. 如权利要求19所述的方法，其中非离子有机聚合物具有500D或更小的平均分子量。
21. 如权利要求18所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的有机溶剂：乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇和苯氧基乙醇。
22. 如权利要求18－21中任一项所述的方法，其中有机调节剂以1％(w/v)或更大的浓度提供。
23. 如权利要求18所述的方法，其中有机调节剂是选自以下的表面活性剂：Tween、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡糖苷。
24. 如权利要求23所述的方法，其中表面活性剂以1％(w/v)或更小的浓度提供。
25. 如权利要求23所述的方法，其中表面活性剂以0.1％(w/v)或更小的浓度提供。
26. 如权利要求1－25中任一项所述的方法，其中将样品与抗病毒剂接触。
27. 如权利要求26所述的方法，其中抗病毒剂是具有至少一个正电荷的非多价有机阳离子。
28. 如权利要求26所述的方法，其中抗病毒剂缺乏正电荷。
29. 如权利要求26－28中任一项所述的方法，其中抗病毒剂以小于1％(w/v)的量存在。
30. 如权利要求29所述的方法，其中抗病毒剂以小于0.1％(w/v)的量存在。
31. 如权利要求30所述的方法，其中抗病毒剂以小于0.01％(w/v)的量存在。
32. 如权利要求31所述的方法，其中抗病毒剂以小于0.001％(w/v)的量存在。
33. 如权利要求1所述的方法，其中尿囊素是以大于0.5％(w/v)的量存在。
34. 如权利要求33所述的方法，其中尿囊素是以大于1％(w/v)的量存在。
35. 如权利要求1－34中任一项所述的方法，其中样品含有聚集体，并且其中更纯状态的期望的蛋白与所述样品相比具有降低的聚集体含量。
36. 如权利要求35所述的方法，其中聚集体包括期望的蛋白的同源聚集体。
37. 如权利要求36所述的方法，其中所述样品中期望的蛋白的同源聚集体基本上被消除。
38. 如权利要求35所述的方法，其中聚集体包括期望的蛋白和污染物的异源聚集体。
39. 如权利要求38所述的方法，其中异源聚集体具备与期望的蛋白基本上相同的流体动力学大小。
40. 如权利要求38所述的方法，其中污染物是核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质、或细胞培养基成分。
41. 如权利要求38－40中任一项所述的方法，其中期望的蛋白和污染物的异源聚集体基本上被消除。
42. 如权利要求1－41中任一项所述的方法，其中样品含有一种或更多污染物，其中更纯状态的期望的蛋白与样品相比具有降低的所述污染物的含量。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查的文本
复审阶段中，复审请求人于2019年04月16日提交了权利要求书全文替换页（共5页42项）。经审查，所做修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此本复审请求审查决定针对的文本为：2015年01月29日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请文件中文译文的说明书第1-251段（即第1-49页）、说明书附图图1-图6、说明书摘要；2019年04月16日提交的权利要求第1-42项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果通过修改，删除了不具备创造性的技术方案，则不符合创造性规定的缺陷即视为被克服。
驳回决定、前置审查意见和复审通知书认为，权利要求1-24、82-94相对于对比文件1与公知常识和/或常规技术的结合不具备创造性。复审请求人在答复复审通知书时，修改了权利要求书，删除了驳回决定、前置审查意见和复审通知书针对的权利要求1-24，基于此，原权利要求82-94中引用原权利要求1-24的技术方案不复存在。由此可见，通过修改，驳回决定、前置审查意见和复审通知书针对的事实已不存在，本申请权利要求不符合创造性规定的缺陷被克服。
专利法第31条第1款
专利法第31条第1款规定，一件发明专利申请应当限于一项发明。属于一个总的发明构思的两项以上的发明可以作为一件申请提出。
如果通过修改，删除了缺乏单一性的技术方案，则克服了不具备单一性的缺陷。
驳回决定认为：权利要求1-24、82-94（部分），权利要求25-74、82-94（部分），权利要求75-76、82-94（部分）与权利要求77-81、82-94（部分）组成的4组权利要求之间相应的技术特征是都涉及一种使用带正电的多孔颗粒填充色谱柱用于纯化IgG抗体，或其片段、衍生物或融合蛋白。对比文件1公开了使用阴离子交换树脂（即带正电的多空颗粒填充色谱柱）纯化IgG。对于是仅运行阴离子交换柱，还是在之后继续运行阳离子交换柱可以根据纯化需求进行选择，对于样品体积可以根据色谱柱的交换容量进行选择调整，因此上述权利要求之间相应的技术特征不能构成特定技术特征，不属于一个总的发明构思，不符合专利法第31条第1款的规定。复审通知书认为：上述4组权利要求之间的相同技术特征为“从含有期望的蛋白的样品纯化所述期望的蛋白的柱色谱方法，包括以下步骤：(i)提供具有带正电的多孔颗粒的填充色谱柱，(ii)将所述柱平衡至样品的期望的蛋白待洗脱的条件，(iii)将样品与所述柱接触使得上样至所述柱的样品的体积由小于或等于所述柱内带正电的多孔颗粒的孔隙体积的组成，(iv)从所述柱收集期望的蛋白，其中期望的蛋白处在更纯的状态并处在平衡所述柱的条件；其中期望的蛋白是IgG抗体、IgG抗体片段、IgG抗体衍生物或IgG抗体融合蛋白”，而该技术特征相对于对比文件1与公知常识的结合不具备创造性，因此权利要求1-94缺乏相同或相应的特定技术特征而不属于一个总的发明构思，不符合专利法第31条第1款有关创造性的规定。
复审请求人在答复复审通知书时，删除了包括权利要求1-24、75-76、77-81、90-94在内的部分权利要求，将原权利要求25修改为新的权利要求1，其余权利要求为权利要求1的直接或间接权利要求。即修改后的权利要求书仅保留了一组权利要求，从而克服了驳回决定和复审通知书所指不符合专利法第31条第1款有关单一性规定的缺陷。
在上述事实和理由的基础上，合议组做出如下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年01月10日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审请求审查决定针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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