发明创造名称：通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择
外观设计名称：
决定号：183995
决定日：2019-07-05
委内编号：1F235280
优先权日：
申请（专利）号：201380041138.X
申请日：2013-05-29
复审请求人：维多利亚农业服务控股公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：吴文英
合议组组长：孙俊荣
参审员：杨莹跃
国际分类号：A01H17/00,C12N5/04,C12N5/074,C12N5/075,C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：当发明请求保护的技术方案和最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果其它现有技术中并未给出将该区别技术特征应用于最接近的现有技术以解决其实际解决的技术问题的技术启示，则该发明是非显而易见的，具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380041138.X，名称为“通过筛选多种宿主-共生生物联合体的共生体选择”的发明专利申请。申请人为维多利亚农业服务控股公司。本申请的申请日为2013年05月29日，最早优先权日为2012年06月01日，公开日为2015年09月02日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月07日以权利要求1-16不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为2015年02月02日提交的说明书附图、说明书摘要、摘要附图以及2017年03月24日提交的权利要求第1-16项、说明书第1-1769段。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于产生改良生物的方法，包括：
(i)首先提供生物的种质的文库，以及共生生物的文库；
(ii)然后用多种选自所述共生生物文库的共生生物接种所述种质文库，以产生大规模的共生体种群；
(iii)然后培育、选择、筛选和/或评估经接种的种质文库或共生体种群的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良生物，
其中：
所述生物是植物；并且
所述步骤(iii)包括遗传分析和/或代谢分析的步骤。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述共生生物能够与所述植物形成共生联合体。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述共生生物选自真菌、病毒、细菌和其他微生物中的一种或多种。
4. 根据权利要求2或3的方法，其中所述共生生物包含选择用于增强共生生物的性状渐渗的遗传变异。
5. 根据权利要求4的方法，其中所述遗传变异是通过随机突变、二-多倍体化、定向诱变、同源转基因、异源转基因、内源转基因中的一种或多种而导入。
6. 根据权利要求1的方法，其中所述生物是与内生菌具有共生相容性的植物。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述植物种质以胚形式存在。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述胚是用含共生生物的包衣层包覆，以形成人工种子。
9. 根据权利要求8的方法，其中所述胚被处理以产生一个或多个所述共生生物的进入点。
10. 根据权利要求1的方法，其中将一群植物种质用一群共生生物接种，使得可鉴别有利的宿主-共生生物联合体。
11. 根据权利要求1的方法，其中所述筛选步骤(iii)包括通过加速 老化筛选人工种子和/或其后代的相容性和/或稳定性，以及选择表现出所需特征的共生体。
12. 根据权利要求11的方法，其还包括对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定。
13. 根据权利要求1的方法，所述方法包括：
(i)首先提供了植物种质的文库；以及内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组的文库；
(ii)然后用多种选自所述文库的内生菌和/或附生植物和/或与植物联合的微生物组接种所述植物种质文库，以产生大规模的共生体种群；
(iii)然后培育、选择、筛选和/或评估所述共生体的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良植物。
14. 根据权利要求13的方法，其中所述植物是禾本科植物或豆科植物。
15. 一种生物-共生生物联合体的基因组选择方法，所述方法包括：
(i)首先提供了来自所述生物或所述生物-共生生物联合体的核酸样品的大规模文库；
(ii)使用宏基因组学分析所述样品，获得每个样品的遗传特征；
(iii)然后选择具有所需遗传和代谢特征的生物-共生生物联合体，
所述方法优选地还包括下述预先步骤：
(iv)提供一种生物-共生生物联合体；
(v)使所述生物-共生生物联合体受到一种或多种环境条件的处理；和
(vi)从每种经过环境条件处理的生物-共生生物联合体制备核酸样品的大规模文库；
其中：
所述生物是植物。
16. 根据权利要求15的方法，其中所述生物是植物，并且所述共生生物是细菌微生物组。”
驳回决定认为，对比文件1（“高产高蛋白大豆与高效固氮根瘤菌和菌根菌最佳联合共生体筛选”，常从云等，大豆科学，第11卷第3期，第226-233页，1992年08月）公开了筛选高产高蛋白大豆与高效固氮根瘤菌的最佳共生体组合的方法，权利要求1与其的区别技术特征在于：进一步限定了共生体种群为大规模的，还限定了筛选步骤包括遗传分析和/或代谢分析步骤。由此权利要求1实际解决的技术问题是如何利用现代育种技术在更大量的材料中筛选目标生物体。而为了筛选更大数目的样品，本领域技术人员很容易想到可以构建大规模的共生体种群，在大规模种群中筛选目标个体。对于培育筛选步骤涉及的遗传分析和/或代谢分析步骤，而在现代育种领域，对后代进行基因型和表型分析是最非常常用的技术手段，代谢分析则是根据育种目标的常规选择。遗传分析和代谢分析都是育种领域常用的筛选分析方法。此外，对比文件2（“Construction of a metagenomic DNA library of sponge symbionts and screening of antibacterial metabolites”, Chen Juan等, Journal of Ocean University of China, 5(2):119-122, 2006-04-30）公开了可以对共生生物联合体进行遗传和代谢分析的技术内容；对比文件3（“宏基因组学及其在植物病害生物防治中的应用”，芦晓飞等，中国生物防治，第26卷，增刊，第106-112页，2010年11月）给出了可以用宏基因组学研究植物及其内生微生物的种群结构的技术启示；因而本领域技术人员很容易想到也可以用宏基因组技术研究所述生物是植物的生物-共生生物联合体，从而筛选目标共生体。因此权利要求1不具备创造性。同理，独立权利要求15也不具备创造性。相应的从属权利要求2-14和16的附加技术特征或被对比文件1公开或属于本领域的常规技术手段，因此也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2017年10月23日向国家知识产权局提出了复审请求。复审请求人认为：对比文件1公开的是传统、耗时的育种方法，未建议从头开始的使用多种共生生物接种种质文库以生成大规模共生种群的做法，未对本发明的方法给出技术启示；另外要求提供证据证明对比文件1与本发明权利要求1区别步骤（特别是共同接种和加速成熟的步骤）是本领域的常规技术手段。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月08日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，对比文件1公开的也是从头开始将共生生物（8种根瘤菌）接种到种质（大豆植物）上，然后经过培育、选择、筛选出改良生物体的内容，技术构思与本发明权利要求1是非常相似的，至于“加速成熟”的步骤，该技术特征在权利要求1中并未记载，在说明书全文中也未记载，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年01 月18 日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）对比文件1公开了筛选高产高蛋白大豆与高效固氮根瘤菌的最佳共生体组合的方法，与权利要求1的区别技术特征在于：进一步限定了共生体种群为大规模的，还限定了筛选步骤包括遗传分析或遗传分析和代谢分析步骤。基于此权利要求1实际解决的技术问题是：如何利用现代育种技术在更大量的材料中筛选目标共生体。而为了筛选更大数目的样品，本领域技术人员很容易想到可以构建大规模的共生体种群，在大规模种群中筛选目标个体。这种数量的改变是试验规模、大小的改变，并不涉及创造性的劳动。对于培育筛选步骤涉及的遗传分析和代谢分析步骤，在现代育种领域，对后代进行基因型和表型分析是常用的技术手段，代谢分析则是根据育种目标的常规选择。遗传分析和代谢分析都是育种领域常用的筛选分析方法，具体的代谢分析项目也是本领域技术人员根据宿主与寄生菌的共生特定而进行的常规选择。例如，对比文件2公开了一种通过构建海绵共生体的宏基因组DNA文库来筛选抗菌代谢物的方法，对比文件3给出了可以用宏基因组学研究植物及其内生微生物的种群结构的技术启示，由此本领域技术人员很容易想到也可以用宏基因组技术研究所述生物是植物的生物-共生生物联合体，从而筛选目标共生体。因此权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同理，独立权利要求15也不具备创造性。相应的从属权利要求2-14和16的附加技术特征或被对比文件1公开或属于本领域的常规技术手段，因此也不具备创造性。
（2）针对复审请求人的意见，合议组认为，基于分析更多数量的生物共生体的需求，本领域技术人员容易想到扩大样品数量和种类；权利要求1与对比文件1的区别技术特征并不包括其声称的共同接种和加速成熟的步骤：对比文件1已经公开了“先后对18个...大豆品种分别用8个有效大豆根瘤菌株接种”，即已经公开了共同接种的技术特征。而“加速成熟”的技术特征并未记载在权利要求1中，而且在说明书全文中也无相应记载。虽然权利要求11中限定通过加速老化筛选人工种子和/或其后代的相容性和/或稳定性，但加速老化测定种子的活力也是常规的（参见沈火林主编，《园艺植物育种学》，中央广播电视大学出版社，2011年4月，第234页）。因此复审请求人的意见不具有说服力。
复审请求人于2019 年04 月29 日提交了意见陈述书和修改后的权利要求书。复审请求人进一步限定了权利要求1和15，相应修改了其他权利要求，并删除了权利要求12和14。复审请求人认为：修改后的权利要求保护的方法包括对所产生的共生体进行快速内生菌生活力测定的步骤，这不是常规的筛选方法。本申请人发现内生菌特异性基因在约1-10天内表达，使早期植物中内生菌生活力的评估得以进行。所引用的对比文件均未涉及或建议快速内生菌生活力测定，因此权利要求1-14具备创造性。
复审请求人于2019年06月10日提交了意见陈述书和修改后的权利要求书（共3页13项）。进一步限定了独立权利要求1和12，适应性修改或删除了其他权利要求。修改后的权利要求如下：
“1. 一种用于产生改良植物的方法，包括：
(i)提供植物种质的文库，以及共生生物的文库；
(ii)用多种选自所述共生生物文库的共生生物接种所述植物种质文库，以产生大规模的共生体种群；
(iii)然后培育、选择、筛选和/或评估经接种的种质文库或共生体种群的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良植物，
其中：
所述植物是禾本科植物或豆科植物；
所述共生生物是内生菌；
所述步骤(iii)包括遗传分析和/或代谢分析的步骤；并且
所述步骤(iii)包括对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定的步骤，所述测定包括培养种子3-7天以产生小植株、幼苗或发芽的种子，从所述小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA，并且对所提取的DNA和/或RNA进行用于检测在植物中表达的内生菌特异性基因的测定。
2. 根据权利要求1的方法，其中所述共生生物能够与所述植物形成共生联合体。
3. 根据权利要求2的方法，其中所述共生生物包含选择用于增强共生生物的性状渐渗的遗传变异。
4. 根据权利要求3的方法，其中所述遗传变异是通过随机突变、二-多倍体化、定向诱变、同源转基因、异源转基因、内源转基因中的一种或多种而导入。
5. 根据权利要求1的方法，其中所述生物是与内生菌具有共生相容性的植物。
6. 根据权利要求5的方法，其中所述植物种质以胚形式存在。
7. 根据权利要求6的方法，其中所述胚是用含共生生物的包衣层包覆，以形成人工种子。
8. 根据权利要求7的方法，其中所述胚被处理以产生一个或多个所述共生生物的进入点。
9. 根据权利要求1的方法，其中将一群植物种质用一群共生生物接种，使得可鉴别有利的宿主-共生生物联合体。
10. 根据权利要求1的方法，其中所述筛选步骤(iii)包括通过加速老化筛选人工种子和/或其后代的相容性和/或稳定性，以及选择表现出所需特征的共生体。
11. 根据权利要求1的方法，所述方法包括：
(i)首先提供了植物种质的文库；以及内生菌的文库；
(ii)然后用多种选自所述文库的内生菌接种所述植物种质文库，以产生大规模的共生体种群；
(iii)然后培育、选择、筛选和/或评估所述共生体的所需共生体特征；和
(iv)随后鉴别、培养又或使用表现出所需特征的共生体，以产生改良植物；
其中所述植物是禾本科植物或豆科植物。
12. 一种生物-共生生物联合体的基因组选择方法，所述方法包括：
(i)首先提供了来自所述生物或所述生物-共生生物联合体的核酸样品的大规模文库；
(ii)使用宏基因组学分析所述样品，获得每个样品的遗传特征；
(iii)然后选择具有所需遗传和代谢特征的生物-共生生物联合体，
所述方法优选地还包括下述预先步骤：
(iv)提供一种生物-共生生物联合体；
(v)使所述生物-共生生物联合体受到一种或多种环境条件的处理，并进行快速内生菌生活力测定；和
(vi)从每种经过环境条件处理的生物-共生生物联合体制备核酸样品的大规模文库；
其中：
所述生物是禾本科植物或豆科植物，
其中所述共生生物是内生菌，
其中所述快速内生菌生活力测定包括培养种子3-7天以产生小植株、幼苗或发芽的种子，从所述小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA，并且对所提取的DNA和/或RNA进行用于检测在植物中表达 的内生菌特异性基因的测定。
13. 根据权利要求12的方法，其中所述共生生物是细菌微生物组。”
请求人同时提交了以下参考文献的电子件：
参考文献1：D.R.Musgrave,“Detection of an endophutic fungus of lolium perenne using enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)”,New Zealand Journal of Agricultural Research,1984,第27卷，网络信息页和第283-288页；
参考文献2：D.R.Musgrave等,“Optimisation and characterization of enzyme-linked immunosorbent assay……”,New Zealand Journal of Agricultural Research,1986,第29卷，网络信息页和第117-120页；
参考文献3：N.S.Hill等，“Detection of ergoline alkaloids in endophyte-infected tall fescue by immunoassay”,Crop Science,第34卷，1994年，第530-534页；
参考文献4：E.E.Hiatt III 等，“Monoclonal antibodies for detection of neotyphodium coenophialum”,Crop Science,第37卷，1997年，第1265-1269页；
参考文献5：E.E.Hiatt III 等，“Tall fescue endophyte detection:Commercial immunoblot test kit compared with microscopic analysis”,Crop Science,第39卷，1999年，第796-799页。
请求人认为，参考文献1和2记载了用于检测多年生黑麦草内生菌羊茅香柱菌的基于ELISA的测定，参考文献3-5涉及开发、优化和商业化基于ELISA的测试。这些常规的内生菌生活力测定均是基于ELISA的方法，其要求内生菌在植物中生长约6周，然后进行基于颜色的染色以确定生活力。而本发明的快速内生菌生活力测定仅花费约1周时间。因此本申请具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年6月10日提交了权利要求书的替换页（共2页13项），经审查，所述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定针对的文本为：申请人于2015年02月02日提交的说明书附图1-184、说明书摘要、摘要附图，2017年03月24日提交说明书第1-1769段，以及2019年06月10日提交的权利要求1-13。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
当发明请求保护的技术方案和最接近的现有技术相比存在区别技术特征时，如果其它现有技术中并未给出将该区别技术特征应用于最接近的现有技术以解决其实际解决的技术问题的技术启示，则该发明是非显而易见的，具有突出的实质性特点。
复审请求人在于2019年06月10日提交的权利要求1中进一步限定了“对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定的步骤，所述测定包括培养种子3-7天以产生小植株、幼苗或发芽的种子，从所述小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA，并且对所提取的DNA和/或RNA进行用于检测在植物中表达的内生菌特异性基因的测定”。
对比文件1公开了一种改良生物的方法，其具体公开了（参见对比文件1第226页第3段至第227页第1段）：“1987、1988年先后对18个蛋白质含量40～45%、适宜黄淮地区种植的丰产型夏播大豆品种（即权利要求1所述的提供生物的种质文库的一种形式）分别用8个有效大豆根瘤菌株接种（即提供共生生物的文库的一种形式，并且公开了用共生生物文库接种种质文库的技术特征），见表l。用乙炔还原活体方法测定共生固氮活性…这样由菌液浸种形成的共生组合，是各菌株 土著菌与豆株形成的混合共生体。混合共生体共生效应，以共生固氮能力高低作为筛选主要标准，辅之其它生育考种数据做参考。经过盆栽初筛和田间共生效应试验鉴定，把筛选出的分别适宜山东巨野地区和河南驻马店地区的高产高蛋白大豆与高效固氮根瘤菌的最佳共生体组合（即培育、筛选、选择和/或评估共生体的特征，并且鉴别，产生改良生物）：鲁豆2号与113-2 或2048根瘤菌，中豆19、中豆14与113-2、617A6根瘤菌、做为1989、1990年筛选大豆-根瘤菌-菌根菌最佳联合共生体的试验材料，再分别接种吸磷功能强的菌根菌株Glomus epigacum和Glomus mosseae。”可见对比文件1公开了筛选高产高蛋白大豆与高效固氮根瘤菌的最佳共生体组合的方法，且其步骤顺序也与权利要求1相同。其中用乙炔还原活体方法测定共生固氮活性属于一种代谢分析。
修改后的权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：限定了共生体种群为大规模的，还限定了筛选步骤包括遗传分析或遗传分析和代谢分析步骤，并且包括对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定的步骤，所述测定包括培养种子3-7天以产生小植株、幼苗或发芽的种子，从所述小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA，并且对所提取的DNA和/或RNA进行用于检测在植物中表达的内生菌特异性基因的测定。
对于区别技术特征“并且包括对所选择的共生体进行快速内生菌生活力测定的步骤，所述测定包括培养种子3-7天以产生小植株、幼苗或发芽的种子，从所述小植株、幼苗或发芽的种子中提取DNA和/或RNA，并且对所提取的DNA和/或RNA进行用于检测在植物中表达的内生菌特异性基因的测定”，本申请实施例18和附图155-157显示在从3-7龄混合上胚轴共提取的DNA/RNA中检测到内生菌特异性基因，证明了所述快速内生菌生活力测定的可行性，因此权利要求1实际解决的技术问题是：如何利用现代育种技术在更大量的材料中快速筛选目标共生体。
对比文件1中采用的是乙炔还原活体方法测定共生固氮活性，其初筛以生物产量、籽粒产量和菌根侵染率为筛选标准，最后还需田间共生效应试验确认，至花荚期取样进行固氮活性的测量（参见对比文件1第227页）。可见，对比文件1在内生菌生活力测定时需将种质培养至花荚期，需要数十日的培养周期，未涉及或教导在较短时间内快速测定内生菌生活力的步骤。
对比文件2涉及海绵共生体宏基因组DNA文库的构建以及抗菌代谢物的筛选，对比文件3涉及宏基因组学及其在植物病害生物防治中的应用，都没有公开或教导权利要求1中所述的“在培养种子3-7天后提取DNA和/或RNA进行内生菌特异性基因测定的快速内生菌生活力测定的步骤”。参考文献1-5涉及的是基于ELISA的方法测定内生菌，其要求内生菌在植物中生长约6周，然后进行基于颜色的染色以确定生活力，上述参考文献能够表明现有技术中在测定内生菌生活力时通常需要花费数周的培养时间，本领域技术人员难以预期种质仅仅培养或生长3-7天即能实现内生菌生活力的测定。同时也没有证据表明上述的“快速内生菌生活力测定的步骤”属于本领域的常规技术手段。因此权利要求1相对于对比文件1-3的结合是非显而易见的，具有突出的实质性特点。且本申请实施例18和附图155-157证明了所述快速内生菌生活力测定步骤的有效性，即产生了有益的技术效果。因此权利要求1相对于对比文件1-3的结合具备专利法第22条第3款规定的创造性。
同理，独立权利要求12相对于对比文件1-3的结合具备专利法第22条第3款规定的创造性。在此基础上，相应的从属权利要求1-11和13也具备创造性。
基于以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于 2017年07 月07 日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请第一时间联系我们修改或删除，多谢。
