发明创造名称：用于检测生物组分的方法和系统
外观设计名称：
决定号：183037
决定日：2019-07-05
委内编号：1F236400
优先权日：
申请（专利）号：201380053258.1
申请日：2013-08-12
复审请求人：加利福尼亚大学董事会
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王慧
合议组组长：吴文英
参审员：安玉苹
国际分类号：C12Q1/68，F04B13/00，C12M1/34，C12P19/34
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380053258.1，名称为“用于检测生物组分的方法和系统”的发明专利申请。申请人为加利福尼亚大学董事会。本申请的申请日为2013年08月12日，最早优先权日为2012年08月13日，公开日为2015年06月24日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月17日以权利要求2-31不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2015年04月10日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-98页、说明书附图第1-55页、说明书摘要、摘要附图，以及2017年02月07日提交的权利要求第1-30项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在液滴中从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；
(b)在第一温度下在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性并且在第二温度下孵育所述裂解物以灭活所述蛋白酶；
(c)向所述裂解物加入用于进行核酸扩增反应的试剂以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及
(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；
其中，在步骤(d)之前不从所述裂解液滴或从所述扩增液滴中选择性除去试剂。
2. 一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在液滴中使用蛋白酶从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；
(b)灭活所述蛋白酶；
(c)向所述裂解物加入用于进行核酸扩增反应的试剂以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及
(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；
其中，步骤(a)的所述蛋白酶在步骤(c)之前是灭活的。
3. 如权利要求1或2所述的方法，所述扩增液滴的体积是0.001至1000皮升。
4. 如权利要求3所述的方法，所述扩增液滴的直径是0.1微米至1000微米。
5. 如权利要求1或2所述的方法，所述含有多核苷酸的组分是细胞、病毒或孢子。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(c)包括(i)将所述裂解液滴与包含所述用于进行核酸扩增反应的试剂的流体流融合，以及(ii)从所述流体流形成所述扩增液滴。
7. 如权利要求1或2所述的方法，其中，通过液滴聚结或皮可注射将所述用于进行核酸扩增反应的试剂添加至所述裂解液滴。
8. 如权利要求5所述的方法，所述裂解液滴含有单细胞裂解物。
9. 如权利要求1或2所述的方法，所述一种或多种目标多核苷酸是DNA。
10. 如权利要求1或2所述的方法，所述一种或多种目标多核苷酸是RNA。
11. 如权利要求10所述的方法，其中，扩增包括逆转录以生成逆转录产物。
12. 如权利要求1或2所述的方法，所述用于进行核酸扩增反应的试剂包括用于扩增多个不同目标多核苷酸的试剂。
13. 如权利要求1或2所述的方法，所述一种或多种目标多核苷酸对应于癌基因。
14. 如权利要求1或2所述的方法，所述方法还包括检测是否存在步骤(d)中扩增的扩增产物的步骤。
15. 如权利要求14所述的方法，其中，检测是否存在扩增产物包括在所述扩增液滴中对检测组分进行检测。
16. 如权利要求14所述的方法，其中，检测是否存在扩增产物包括对所述扩增产物进行测序。
17. 如权利要求14所述的方法，其中，检测是否存在扩增产物包括形成双重乳液，所述双重乳液包含外部液滴内的扩增液滴，并基于液滴尺寸和荧光分选所述双重乳液。
18. 如权利要求14所述的方法，所述方法还包括基于检测步骤的结果分选所述扩增液滴的步骤。
19. 如权利要求14所述的方法，所述方法还包括基于检测步骤的结果测定含有所述一种或多种多核苷酸的细胞的数目或百分比。
20. 如权利要求14所述的方法，所述方法还包括基于检测步骤的结果鉴定是否存在循环肿瘤细胞或其数目。
21. 如权利要求14所述的方法，其中，扩增包括含有捕获序列的引物的延伸，且检测是否存在扩增产物包括在所述扩增产物中检测所述捕获序列。
22. 如权利要求1或2所述的方法，其中，在微流体控制下进行一个或多个步骤。
23. 如权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(b)包括向所述裂解液滴施加电场。
24. 如权利要求23所述的方法，所述电场由液体电极生成。
25. 如权利要求5所述的方法，所述液滴含有一个或多个细胞并在裂解所述液滴中的所述一个或多个细胞之前将含有一个或多个细胞的液滴与不含细胞的液滴分离。
26. 如权利要求2所述的方法，其中，灭活所述蛋白酶包括加热所述裂解液滴。
27. 如权利要求1或2所述的方法，所述扩增液滴在扩增期间维持在固定位置。
28. 如权利要求27所述的方法，所述固定位置是在阵列中。
29. 如权利要求27所述的方法，所述方法还包括检测是否存在步骤(d)中扩增的扩增产物，以及基于所述检测的结果分选所述扩增液滴。
30. 如权利要求14所述的方法，其中，在扩增期间检测是否存在扩增产物。”
驳回决定认为：对比文件1（Yong Zeng 等，“High-Performance Single Cell Genetic Analysis Using Microfluidic Emulsion Generator Arrays”，Anal. Chem.，第82卷，第3183-3190页，公开日期2010年12月31日）公开了一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法。权利要求2与对比文件1的区别在于：权利要求2是先形成裂解物，灭活蛋白酶，再向裂解物中加入扩增试剂，而对比文件1是将珠子和模板封装入均匀纳升体积的PCR-油混合物，即包括形成包含目标细胞和用于进行核酸扩增的试剂的液滴。然而，直接在实现PCR扩增的液滴中进行样本裂解还是在裂解后的样本中加入扩增试剂混合再实现PCR是一种常规选择，而对于蛋白酶的灭活，使用蛋白酶消化细胞裂解物中的抑制性蛋白是本领域的常规技术手段，且出于实现PCR的考虑，在进行PCR扩增之前将所述蛋白酶灭活也是常规技术手段。因此，权利要求2不具备创造性。从属权利要求3-30进一步限定的附加技术特征或被对比文件1公开、或是本领域的常规实验手段。因此，权利要求3-30也不具备创造性。其他说明部分指出：权利要求1中添加了新的步骤(b)“在第一温度下在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性并且在第二温度下孵育所述裂解物以灭活所述蛋白酶”，然而所述第一温度、第二温度在原申请中并无记载，基于原申请也不能判定该步骤一定发生在步骤(a)和(c)之间。因此，权利要求1的修改不符合专利法第33条的规定。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月01日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共3页30项）。相对于驳回决定针对的文本，所作修改在于：删除权利要求1中的“在第一温度下在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性并且在第二温度下孵育所述裂解物以”，在权利要求1中增加“并在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性”。复审请求人认为：1）对比文件1没有公开或给出使用蛋白酶的技术启示，对比文件1的方法需要所有试剂在液滴形成时即存在于液滴中，而蛋白酶会消化并破坏扩增步骤需要的酶，向对比文件1的方法中加入蛋白酶可能会降低扩增效率，而且在纳升液滴中合并蛋白酶和聚合酶可能难以确保蛋白酶孵育后在各液滴中都存在活性聚合酶。本申请的方法包括灭活蛋白酶和在蛋白酶灭活之后向液滴中添加扩增试剂，而在没有特定技术启示的情况下，不可能使用对比文件1的方法来向包封的液滴中添加流体。本申请的图7和说明书第[0028]段显示在蛋白酶K处理的裂解物中可见裂解物对PCR抑制的强烈解除，但在仅具有裂解物的裂解缓冲液中并非如此。因此，添加蛋白酶如蛋白酶K代表了克服扩增技术障碍所必需的显著改善。2）对比文件1通过增加液滴生成的速度来解决灵敏度问题，生成更多的液滴通过提供更多检测到稀有事件的机会来增加灵敏度，而不是增加各检测事件的灵敏度。对比文件1没有提供任何动机来增加各液滴内的检测灵敏度，而本申请权利要求涉及增加检测各液滴的灵敏度的方法。虽然对比文件1和本申请都涉及对细胞裂解物中的核酸进行扩增，但对比文件1是针对液滴生成速度和检测速度进行了优化，并没有提供更强的扩增，而本申请权利要求涉及产生更强扩增的方法，二者思路不同。
复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：
(a)在液滴中从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物并在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；
(b)灭活所述蛋白酶；
(c)向所述裂解物加入用于进行核酸扩增反应的试剂以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及
(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；
其中，在步骤(d)之前不从所述裂解液滴或从所述扩增液滴中选择性除去试剂。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月17日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为用蛋白酶K在PCR反应前对样本进行处理会产生有益效果是本领域的常规实验手段，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月11日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1是先将样品在蛋白酶存在下形成裂解物，然后灭活蛋白酶，再向裂解物中加入扩增试剂，而对比文件1是将珠子和模板封装入均匀纳升体积的PCR-油混合物，即对比文件1将样品、裂解液和扩增试剂同时封装在一起。然而，对比文件1已经公开了将生物样本封装到微液滴中，然后裂解细胞制备模板，再进行PCR扩增。在此基础上，直接在进行PCR扩增的液滴中进行样本裂解还是在裂解后的样本中加入扩增试剂混合再进行PCR是一种常规选择，本领域技术人员可根据具体的实验情况或需求进行选择，其效果也是能够预期的。对于裂解液的选择，蛋白酶是本领域常用的裂解试剂，本领域公知可以使用蛋白酶K裂解处理样本，能除去抑制DNA聚合酶活性的抑制因子，制备模板以用于PCR扩增，而且PCR反应体系中的蛋白酶会使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃上处理反应体系使其灭活（参见公知证据1：钱爱东主编，《动物性食品卫生病原体检验》，中国农业出版社，2009年，第76页；公知证据2：王建龙，文湘华编著，《现代环境生物技术》，清华大学出版社，2008年09月，第520页；公知证据3：孙军主编，《医学生物化学与分子生物学实验》，华中科技大学出版社，2008年04月，第79页；公知证据4：刘民培主编，《现代临床实验研究技术》，清华大学出版社，2008年04月，第373页）。因此，权利要求1不具备创造性，同理，权利要求2不具备创造性。从属权利要求3-30进一步限定的附加技术特征或被对比文件1公开、或是本领域的常规实验手段。因此，权利要求3-30也不具备创造性。
复审请求人于2019年03月26日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1的方法中不会采用蛋白酶，因为如果在热启动前引入蛋白酶会破坏PCR酶，在热启动后添加蛋白酶将不再能进行单细胞分析，因此，将蛋白酶添加到对比文件1的第一步中并不是常规选择。此外，对比文件1的方法能够检测单一病原体，但与多个细胞不相容，不能用于哺乳动物细胞分析。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2017年11月01日提交了权利要求书全文替换页（共3页30项），经审查，所作修改符合专利法第33条和实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定所依据的审查文本是：2015年04月10日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书第1-98页、说明书附图第1-55页、说明书摘要、摘要附图，以及2017年11月01日提交的权利要求第1-30项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护“一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，所述方法包括：(a)在液滴中从样品中裂解一种或多种含有多核苷酸的组分以在裂解液滴中形成裂解物并在蛋白酶存在下孵育所述裂解物以促进蛋白酶活性，所述裂解物包含所述一种或多种目标多核苷酸且所述裂解液滴是不混溶的载体流体；(b)灭活所述蛋白酶；(c)向所述裂解物加入用于进行核酸扩增反应的试剂以在扩增液滴中形成扩增混合物，所述扩增液滴是在所述不混溶的载体流体中；以及(d)在所述扩增液滴中扩增所述一种或多种目标多核苷酸；其中，在步骤(d)之前不从所述裂解液滴或从所述扩增液滴中选择性除去试剂。”
对比文件1公开了一种扩增一种或多种目标多核苷酸的方法，具体公开了一种结合高通量微乳液代和单细胞多重PCR的高性能单细胞基因分析（SCGA）技术，以实现对野生型和突变/致病细胞的检测和量化，在该方法中，功能化微珠与多个正向引物结合，从不同类型的细胞针对特定基因在微滴中进行固相PCR，PCR之后，液滴裂解且珠粒汇集并通过多色流式细胞仪快速分析(参见对比文件1摘要)。对比文件1还公开了图1所示的流程，包括，将珠子和模板封装入均匀纳升体积的PCR-油混合物，然后将其进入PCR循环扩增，每个珠子与能扩增所有靶标的正向引物结合，PCR混合物包含标记了不同的、特异性荧光标记了的反向引物，每个液滴中的包含单个模板的每个珠子在PCR之后都会包含一种荧光标记的扩增子，同时具有两种不同的模板或细胞的珠子将具有多色荧光标记的扩增子。破碎液滴，回收珠子并通过流式细胞仪对多色荧光标记的扩增子进行分析（参见对比文件1图1，第3184页右栏最后一段至第3185页左栏第一段）。对比文件1还公开了所述油含有0.2％（w/w）Triton X-100）（属于裂解液）（参见对比文件1“supporting information”第5页第2段）。
权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1是先将样品在蛋白酶存在下形成裂解物，然后灭活蛋白酶，再向裂解物中加入扩增试剂，而对比文件1是将珠子和模板封装入均匀纳升体积的PCR-油混合物，即对比文件1将样品、裂解液和扩增试剂同时封装在一起。基于上述区别可以确定本申请实际解决的技术问题是提供一种扩增目标多核苷酸的方法。
然而，对比文件1已经公开了将生物样本封装到微液滴中，然后裂解细胞制备模板，再进行PCR扩增(参见对比文件1图1，第3184页右栏最后一段至第3185页左栏第一段)。在此基础上，直接在进行PCR扩增的液滴中进行样本裂解还是在裂解后的样本中加入扩增试剂混合再进行PCR是一种常规选择，本领域技术人员可根据具体的实验情况或需求进行选择，其效果也是本领域技术人员能够预期的。对于裂解液的选择，蛋白酶是本领域常用的裂解试剂，本领域公知可以使用蛋白酶K裂解处理样本，能除去抑制DNA聚合酶活性的抑制因子，制备模板以用于PCR扩增，而且PCR反应体系中的蛋白酶会使聚合酶或模板及产物降解，可在95℃上处理反应体系使其灭活（参见公知证据1第76页；公知证据2第520页；公知证据3第79页；公知证据4第373页）。
因此，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识，得到权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。同理，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3-30直接或间接引用权利要求1或2，并作了进一步限定。
权利要求3具体限定了液滴体积、权利要求4具体限定了液滴直径。然而，本领域技术人员在常规实验的基础上可通过有限的试验筛选获得合适的液滴体积和直径。
权利要求5具体限定了含有多核苷酸的组分，对比文件1公开了含有多核苷酸的组分可以是大肠杆菌细胞(参见对比文件1摘要)，而且病毒或孢子也是本领域的常规检测对象。
权利要求6具体限定了步骤（c），对比文件1已经公开了将生物样本封装到微液滴中，然后裂解细胞制备模板，再进行PCR扩增。在此基础上，直接在实现PCR扩增的液滴中进行样本裂解还是在裂解后的样本中加入扩增试剂混合再实现PCR是一种常规选择，本领域技术人员可根据具体的实验情况或需求进行选择；
权利要求7限定了将核酸扩增反应的试剂添加到裂解液滴的方式。然而，液滴聚结和皮可注射都是本领域常用的混合微液滴的方式。
权利要求8限定了裂解液滴含有单细胞裂解物，对比文件1公开了检测物是细胞裂解液(参见对比文件1摘要)，还公开了每个液滴为2.5nl，含有0.2个细胞（参见对比文件1第3186页图3），而且本领域技术人员可根据需要具体选择合适量的裂解液；
权利要求9-11具体限定了目标多核苷酸。对比文件1公开了目标多核苷酸是DNA（参见对比文件1第3186页左栏第1段，“supporting information”第7页表S-1），而且RNA也是本领域常规的检测目标多核苷酸，而对于RNA，在检测前进行逆转录是本领域的常规实验手段。
权利要求12具体限定了扩增多个不同目标多核苷酸；权利要求14-21、29-30具体限定了检测步骤；权利要求22具体限定了微流体控制。对比文件1公开了使用多色荧光标记实现对不同目标多核苷酸的检测，检测方法是流式细胞仪进行分选和检测（参见对比文件1摘要），本领域技术人员在常规实验的基础上可以对上述检测方法的步骤和应用进行调整，在扩增期间实现检测是可选的方式，而且测序也是本领域常用的扩增产物检测方法。
权利要求13具体限定了目标多核苷酸对应于癌基因。对比文件1公开了所述方法可用于分析癌症的进展、检测循环肿瘤细胞（参见对比文件1第3190页左栏第2段），本领域技术人员在常规实验的基础上可选择合适的癌基因进行检测。
权利要求23-24具体限定了施加电场。然而，通过施加电场改变液滴界面张力，驱动微流体运动、分裂或合并微液滴是本领域的常规实验手段。
权利要求25具体限定了液滴裂解及分离。为了使实验结果更精确，本领域技术人员容易想到在液滴裂解前将含有一个或多个细胞的液滴与不含细胞的液滴分离以减少干扰。
权利要求26具体限定了加热灭活蛋白酶。公知证据1，4都公开了加热灭活蛋白酶（参见公知证据1第76页；公知证据4第373页）。
权利要求27-28具体限定了扩增发生在固定位置或阵列。对比文件1公开了阵列(参见对比文件1摘要，附图2)。
因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求3-30也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人的陈述意见，合议组认为：1）对比文件1与本申请具有相同的思路，都是在实现样本裂解的基础上进一步实现PCR扩增。在此基础上，直接在实现PCR扩增的液滴中进行样本裂解还是在裂解后的样本中加入扩增试剂混合再实现PCR是一种常规选择，可根据具体的实验情况或需求进行选择，例如在某些情况下，需要在细胞裂解后加入某些试剂再行PCR扩增，这时本领域技术人员有动机对对比文件1的方法进行改进或调整，容易想到的方式包括先行细胞裂解，加入目标试剂后，再与扩增试剂混合。对于这种改进或调整，本领域技术人员是能够合理预期其效果的。而且用蛋白酶K处理细胞，再灭活蛋白酶K，然后直接作为模板用于PCR扩增是本领域的公知常识，蛋白酶K可除去抑制PCR体系的蛋白质成分，提高模板质量，但蛋白酶K的存在又可能会使聚合酶及产物降解，因而需在95℃以上处理使其失活（参见公知证据1第76页；公知证据2第520页；公知证据3第79页；公知证据4第373页）。可见，用蛋白酶K处理细胞制备模板，然后灭活蛋白酶K以不影响后续的PCR反应是本领域的常规操作，而且先制备模板再加入PCR扩增试剂进行PCR反应也是本领域的常规方法，因而本领域技术人员有动机对该常规方法加以使用，将其用于对比文件1的微液滴的PCR反应。2）对比文件1与本申请都是单细胞分析方法，都是通过PCR对单细胞的基因组靶标进行扩增，然后对荧光标记的扩增子进行分析，因而并不存在请求人所述的对比文件1的方法不能用于哺乳动物细胞分析的情形。因此，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07月17日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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