发明创造名称：一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法
外观设计名称：
决定号：183145
决定日：2019-07-03
委内编号：1F233590
优先权日：
申请（专利）号：201510306784.5
申请日：2015-06-04
复审请求人：广东省实验动物监测所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张颖
合议组组长：钟辉
参审员：王璟
国际分类号：C12Q1/68，C12Q1/04，C12N15/11
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上给出了将区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，并且所获得发明的技术效果可以合理预期，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510306784.5，名称为“一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物和方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为广东省实验动物监测所。本申请的申请日为2015年06月04日，公开日为2015年11月11日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年04月25日发出驳回决定，以权利要求1-7不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2015年06月04日提交的说明书第1-8页（第1-50段）、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页；2015年08月28日提交的说明书附图第1-2页（图1-5）；2016年07月27日提交的权利要求第1-7项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
F1 :5'- CTATGACGGGTATCCGGC-3' （SEQ ID NO：1），
R1:5'- CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQ ID NO：2）；
F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQ ID NO：3），
R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQ ID NO：4）。
2. 一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）从样品中提取螺杆菌DNA；
2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对F1和R1进行预扩增反应获得预扩增产物；
3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对F2、R2和荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；
4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的PCR预扩增反应体系为：
PreMix rTaq 10 μL
10 μM引物F1 1 μL
10 μM引物R1 1 μL
模板 1 μL
ddH2O 7 μL。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2）中的预扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s、58℃退火35s、72℃延伸1 min 10s ，循环35次；72℃终延伸8min。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应体系为：
ddH2O 6 μL
PreMix rTaq 10 μL
染料LC Green 1 μL
10 μM引物F2 1 μL
10 μM引物R2 1 μL
DNA模板 1 μL。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3）中的PCR-HRM扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸20s ，循环35次；72℃终延伸5min；在70℃到90℃升温范围内以0.3℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述HRM分析的具体分析方法为：以啮齿螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为78.70±0.12℃，则判定为啮齿螺杆菌；
以胆汁螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为80.51±0.09℃，则判定为胆汁螺杆菌；
以盲肠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值为81.6±0.18℃，则判定为盲肠螺杆菌；
以小家鼠螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.11±0.18℃，则判定为小家鼠螺杆菌；
以肝螺杆菌阳性标准样品为对照时，若其Tm值在82.95±0.09℃，则判定为肝螺杆菌。”
驳回决定指出：①对比文件1（Helicobacter typhlonius and Helicobacter rodentium Differentially Affect the Severity of Colon Inflammation and Inflammation-Associated Neoplasia in IL10-Deficient Mice，Maciej Chichlowski等，Comparative Medicine，第58卷，第6期，第534-541页，公开时间：2008年12月）公开了一种利用融解曲线检测盲肠螺杆菌和啮齿螺杆菌的方法。权利要求1与对比文件1的区别特征在于：权利要求1使用了改进的高分辨率融解曲线方法，且检测的螺杆菌增加为5种。基于该区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题为将对比文件1的检测方法进行改进并用于更多种啮齿动物螺杆菌的检测和鉴别。对比文件2（应用PCR方法调查实验大小鼠螺杆菌感染情况，丁聪 等，扬州大学学报(农业与生命科学版)，第33卷，第2期，第6-10页，公开时间：2012年06月）和对比文件3（啮齿动物螺杆菌研究现状，陈锡福 等，中国实验动物学报，第16卷，第3期，第238-240、S1页，公开时间：2008年06月）均公开了肝螺杆菌、胆汁螺杆菌、啮齿螺杆菌和小家鼠螺杆菌四种螺杆菌为重要的啮齿动物致病螺杆菌，能以PCR方法进行检测；对比文件4（CN103074447A，公布日：2013年05月01日）公开了PCR-HRM方法作为改进的融解曲线法能够提供更好的检测和鉴别效果。因此，本领域技术人员在对比文件2-4的启示下，有动机将对比文件4的PCR-HRM检测手段用于改进对比文件1的融解曲线法，并且将对比文件2和3记载的多种螺杆菌作为增加的检测对象同样用于这一方法。而在这5种螺杆菌基因组序列均为本领域公知的情况下，比对得到其保守区域并按照PCR-HRM的需求设计特异性引物，是本领域常规技术手段。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。②基于同样理由，本领域技术人员在对比文件2-4的启示下，能够想到将方法和检测对象用于改进对比文件1的方法。因此权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。③对比文件4公开了其PCR-HRM的反应条件和体系，从属权利要求3-6的附加技术特征属于本领域技术人员根据实际实验情形进行自由选择和调整的范围，因此权利要求3-6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。④对于结果的分析是本领域技术人员根据实验设计能够显而易见得到的，因此权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人广东省实验动物监测所（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年09月29日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1采用普通熔解曲线分析（普通仪器、不能区分基因型、使用不饱和荧光染料），本申请是高分辨率熔解曲线分析（专门仪器、分辨率高、使用饱和荧光染料），二者目的、引物设计不同。高分辨率熔解曲线分析的引物设计要求更多，难度更大，本申请的引物在一个体系中使用，是单重PCR，侧重通用引物，另一对引物是为了建立套式PCR，可以基于不同螺杆菌某个基因的微小碱基序列差异形成不同的熔解曲线，达到鉴别不同螺杆菌的目的。而对比文件1不能解决上述技术问题。本申请实际所要解决的技术问题是：首次提供了一种快速区分鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，实现了一个反应体系中通过1对通用引物同时区分出5种螺杆菌，节约了成本和简化了步骤，提高了同时区分5种不同啮齿动物螺杆菌的准确性、特异性、快速性和高通量性。对比文件2-3公开的检测方法与本申请不同，对比文件4虽然涉及HRM，但是检测对象不相关，无法从对比文件1-4中获得足够的教导而在不付出创造性劳动的情况下预知5种啮齿动物螺杆菌是否能够在一个反应体系中通过1对通用引物经PCR-HRM分析同时得到区分；即使有动机这样去做，获得满足这样要求的1对通用引物这需要付出创造性劳动。本申请的核心在于对5种螺杆菌基因组序列的创造分析和筛选，涉及到大量单个碱基的分析和筛选，以实现即能对5种螺杆菌进行高效地扩增，又能也恰到好处地对5种螺杆菌进行一次性明显区分，这不同于普通PCR检测。本申请并不是将几对引物组合出来的效果，而是通过一对引物实现5种螺杆菌的鉴别，因为这几种啮齿动物螺杆菌同属于螺杆菌属，如何从5种螺杆菌的基因组库中研究出不同螺杆菌本身具有差异的序列，同时又能通过熔解曲线将该5种差异明显体现出来，需要精力和反复的实验验证，用一对引物实现2种及以上螺杆菌鉴别检测方法的报道非常的少，能实现5种螺杆菌的鉴别是一种很有创意性的方法。本方法并不是建立在多重PCR基础上的，权利要求1中列举了两对引物是为了建立套式PCR以获得更纯的PCR产物，但实现5种螺杆菌的鉴别的只是靠1对引物。本方法的目的并不只是实现检测有无螺杆菌，主要目的在于实现对5种螺杆菌的鉴别，这也是其他研究报道所提到的方法不能办到的，本方法所涉及的引物与其他文献中提到的也没有相关性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年10月31日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定，并指出：HRM方法效果优于普通方法关键在于其体系本身，即更高精度的仪器和饱和染料，这一优点不是本申请的技术方案所带来的，而是HRM方法具备的。对比文件1-4已经证明了5种待测菌株能够适合于PCR方法检测，因此对这一方法基于公知技术体系的进一步改进并不能认为是非显而易见的。本申请序列分析、选择待扩增靶标和筛选引物的过程是基于本领域公知的原则，本领域技术人员在选择了同样技术平台之后，能够通过遵循公知的原则，得到引物，这过程中通常并不涉及创造性的步骤。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：①权利要求1与对比文件1的区别在于：二者检测对象和检测方法不同，权利要求1引物针对的是5种特定螺杆菌的特定基因，获得的是高分辨率熔解曲线（HRM），而对比文件1引物针对是啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌的其他特定基因（Ni/Fe hydrogenase、cdtB基因），获得的是熔解曲线。基于上述区别可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是通过PCR-HRM有效检测上述5种螺杆菌。对于检测对象，对比文件1-3已经给出了针对多种动物螺杆菌进行检测的启示，且从中具体选择出权利要求1涉及的5种螺杆菌，是本领域技术人员容易想到和实现的。对于检测方法，首先，PCR-HRM检测方法是本领域技术人员熟知的常规技术，例如，可见公知常识证据1（21世纪复旦大学研究生教学用书 《遗传医学进展》，左伋 等著，公开时间：2014年05月，上海：复旦大学出版社，第196页）、公知常识证据2（《医学生物侦检与防护技术概论》，潘欣 编，北京：军事医学科学出版社，公开时间：2011年07月，第50-52页）。因此，PCR-HRM在不同基因型、序列碱基变化上的检测用途，属于本领域的公知技术，其比常规熔解曲线在检测灵敏度、特异性等方面的优越性也是已知的，在此基础上，将PCR-HRM技术替换对比文件1的常规PCR-熔解曲线技术，是显而易见的。另外，对比文件4公开了通过PCR-HRM可以有效检测特定病毒血清型，其也给出了使用PCR-HRM技术提高检测分辨率的技术教导，本领域技术人员在上述对比文件的基础上有动机将常规PCR-熔解曲线技术替换为PCR-HRM技术。其次，16s rRNA在螺杆菌物种检测中也是常规和已知的，在此基础上，使用16s rRNA替换对比文件1的靶基因，是显而易见的。对于权利要求1的引物，采用通用引物和特异性引物进行PCR-HRM检测的方法是已知的，套式PCR技术也是本领域已知的螺杆菌检测技术。对比文件3-4记载，螺杆菌16s rRNA可以从本领域公知的序列数据库中获得，而且对比文件2表1的通用上游引物P7-F与本申请预扩增的上游引物SEQ ID NO：1完全相同。由此可见，在螺杆菌16s rRNA属于已知检测靶基因、套式PCR/PCR-HRM属于已知检测技术的基础上，结合上文所述，公知常识证据1和2所述的HRM检测原理、对比文件4公开的检测方法、对比文件2公开的上游通用引物以及本领域序列数据库已知的螺杆菌16s rRNA序列，本领域技术人员基于序列比对获得本申请5种螺杆菌存在特定序列差别的16s rRNA检测靶基因片段，并设计相应的套式PCR引物（如SEQ ID NO：1-4），从而改进对比文件1的普通PCR-熔解曲线检测方法，是显而易见的。因此权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。②基于同样的理由，获得权利要求2涉及的检测对象、检测靶基因及其扩增的靶片段是显而易见的。基于对比文件3-4公开的PCR-HRM方法和巢式PCR（即套式PCR）技术，获得权利要求2的步骤2）至4）也是显而易见的。因此权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。③基于对比文件4的方法，根据本申请的引物、扩增的靶基因片段，本领域技术人员通过常规实验技术即可获得具体的PCR扩增体系和反应程序，以及相应的阳性对照样品、Tm值，以及依据其判断不同的螺杆菌类型。因此权利要求3-7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。④对于复审请求人提出复审请求时的意见陈述，合议组指出：第一，虽然对比文件1使用的确实是普通PCR-熔解曲线技术，与本申请原理、引物设计等方面都存在不同，但是对于套式PCR/PCR-HRM技术，其在不同基因型、序列碱基变化上的检测用途（尤其是对单碱基变化的检测能力），属于本领域的公知技术，其比常规熔解曲线在检测灵敏度、特异性等方面的优越性也是已知的。并且，套式PCR技术也是本领域已知的螺杆菌检测技术，其敏感度比普通PCR高也是已知的。因此，在螺杆菌16s rRNA属于已知检测靶基因、套式PCR/PCR-HRM属于已知检测技术的基础上，结合公知常识证据1和2所述的HRM检测原理、对比文件4公开的检测方法、对比文件2公开的上游通用引物以及本领域序列数据库已知的16s rRNA序列，本领域技术人员基于序列比对获得本申请5种螺杆菌存在特定序列差别的16s rRNA检测靶基因片段，并设计相应的套式PCR引物，从而改进对比文件1的普通PCR-熔解曲线检测方法，是存在启示和动机的，获得权利要求保护的技术方案是显而易见的；并且，采用套式PCR/PCR-HRM技术替换普通PCR-熔解曲线技术带来的技术效果是本领域技术人员能够合理预期的。复审请求人强调的特定仪器/设备、染料、分析软件等，其均为本领域PCR-HRM检测的已知和常规的技术，这些内容无法为本申请带来创造性。第二，对于复审请求人强调的单重PCR，侧重通用引物，另一对引物是为了建立套式PCR的问题，一方面，权利要求请求保护的引物为两对，其涉及的RCR-HRM检测方法使用的引物也为两对，因此复审请求人强调的仅一对引物进行单重PCR并非权利要求请求保护的技术方案。另一方面，分析本申请说明书的实施例1-3可知，本申请在鉴别和区分5种螺杆菌时，采用的是套式PCR，即采用了两对引物，没有证据显示一对通用引物进行单重PCR能解决鉴别/区分5种螺杆菌的技术问题。第三，复审请求人强调的解决的技术问题、取得的技术效果，是本领域技术人员基于上述现有技术，通过常规的实验即能取得或证实的，不存在预料不到的技术效果。
复审请求人于2019年04月17日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：1、由于核酸序列组成的差异及不同碱基解链温度的相互弥消，单碱基突变所引起的细微的Tm差异并不能被捕获而用于区分不同的基因型。PCR-HRM检测技术的重点及难点是在于引物的设计及其筛选，必须满足以下条件：第一，检测对象均能被扩增；第二，检测对象的扩增产物在Tm上存在足够大的差异而能够被定义为不同的种属或基因型。细菌的基因组通常都达到100万bp以上，即使借助已有的软件工具，要完成序列比对工作，该工作量也是相当庞大，且同一种属的细菌基因组高度保守（意味着碱基变异不大），试图以HRM来区分不同的细菌，则需要进行大量的引物设计、筛选及反复试验。本申请的创造性在于从庞大的细菌基因组中设计并筛选出了可用于同时区分5种螺杆菌的引物，这是无法通过受对比文件启发或公知常识获得的。2、本申请所建立的方法是套式PCR-HRM，一共使用了2对引物：外引物用于鉴别检测样品是否为螺杆菌，内引物用于鉴别5种螺杆菌。因为该检测技术所针对的检测样品成分比较复杂，通常情况下除了含有螺杆菌，还有其他的多种细菌，而长度只有几十bp的HRM引物，有可能会和其他细菌的基因组错配而出现非特异性扩增，干扰实验结果。为避免类似情况，所以采用了针对螺杆菌基因组的2对引物以期提高本检测方法的特异性。虽然本申请使用了2对引物，但是使用外引物的目的仅仅只是为了最大可能地提高本方法的特异性，保证结果的准确性，与鉴别区分5种螺杆菌并无直接关系。HRM的原理是不同扩增片段的Tm值不同，实际上真正起到鉴别作用的是内引物，因为这5种螺杆菌的Tm差异是基于内引物对它们碱基序列的扩增差异而造成的，且这种由于内引物的扩增而引起的Tm差异并不会因为剔除了外引物的扩增而消除或发生改变。仅用一对内引物对螺杆菌进行扩增，通过其扩增片段的Tm值是足以鉴别其是否为胆汁螺杆菌、啮齿类螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌、盲肠螺杆菌中的某一种。本申请中所有运行HRM而获得Tm数据均证明，根据这种Tm的差异来鉴别5种螺杆菌的效果由且仅由内引物导致，与外引物无关。综上，本申请权利要求1保护的引物与对比文件1公开的引物不同，二者引物的作用原理及解决的技术问题截然不同，因此本申请具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未对申请文件进行修改，因此，本复审决定所依据的审查文本与驳回决定针对的审查文本相同，为：申请日2015年06月04日提交的说明书第1-8页（第1-50段）、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页；2015年08月28日提交的说明书附图第1-2页（图1-5）；2016年07月27日提交的权利要求第1-7项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，在请求保护的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征的情况下，如果现有技术整体上给出了将区别技术特征应用于该最接近的现有技术以解决发明实际解决的技术问题的启示，这种启示会使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，并且所获得发明的技术效果可以合理预期，则该发明不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护：一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM引物，其核苷酸序列如下所示：F1 :5'- CTATGACGGGTATCCGGC-3' （SEQ ID NO：1），R1:5'- CGATTACTAGCGATTCCAGC-3'（SEQ ID NO：2）；F2：5'-GAACCTTACCTAGGCTTGACATT-3'（SEQ ID NO：3），R2：5'-TTAACCCAACATCTCACGACAC-3'（SEQ ID NO：4）。
根据本申请说明书实施例记载，权利要求1鉴别的5种螺杆菌为：啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌。
对比文件1（参见摘要，第535-536页的“PCR detection of Helicobacter organisms”节）公开了一种检测啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌的PCR-熔解曲线方法，包括：设计扩增啮齿螺杆菌的Ni/Fe hydrogenase基因片段和盲肠螺杆菌的cdtB基因片段的引物；基于DNA样品、SYBR Green PCR Master Mix和引物，进行PCR扩增，然后获得熔解曲线。
权利要求1与对比文件1的区别在于：二者检测的螺杆菌种类和检测方法（包括引物）不同，权利要求1引物（如SEQ ID NO：1-4）针对的是上述5种螺杆菌的特定基因，获得的是高分辨率熔解曲线（HRM），而对比文件1引物针对是啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌的其他特定基因（Ni/Fe hydrogenase、cdtB基因），获得的是熔解曲线。基于上述区别可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是通过PCR-HRM鉴别检测上述5种螺杆菌。
对于权利要求1涉及的检测对象，对比文件1（参见摘要，第534页左栏第1段至第535页左栏第3段）还记载，螺杆菌一方面可用于诱导实验动物（如鼠）的肠道感染模型，另一方面，其感染也可见于实验模型动物，且可能改变IBD病的表型；涉及的螺杆菌例如啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌等。另外，对比文件2（参见摘要，第6-7页）也公开鼠易感染啮齿螺杆菌，国际实验动物理事会等已将螺杆菌列为实验动物必须排除的病原菌，且对比文件2通过PCR对啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌进行了检测。对比文件3（参见摘要，第238页左栏）也公开从啮齿动物中至少分离出13种动物螺杆菌，其中重要的有胆汁螺杆菌、鼠类螺杆菌（即小家鼠螺杆菌）、肝螺杆菌，实验动物企业和国际实验动物理事会已针对其在实验动物中进行检测。由此可见，对比文件1-3已经给出了针对多种动物螺杆菌进行鉴别检测的启示，且从中具体选择出对权利要求1涉及的5种螺杆菌（啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌）进行鉴别检测也是本领域技术人员容易想到和实现的。
对于权利要求1涉及的检测方法，
首先，PCR-HRM检测方法是本领域技术人员熟知的常规技术，例如，公知常识证据1（参见第196页）公开：高分辨率熔解曲线（HRM）利用PCR后扩增子的核苷酸序列和长度不同而引起的各碱基含量的差异，通过不同温度下实时检测升温过程的熔解曲线，来反映DNA链中单个或多个位点的基因变化，HRM分析能从荧光强度、时间曲线、熔解曲线的形状，判断是否存在突变位点和不同的基因型，该基因分析技术，具有极高的敏感性，可以检测出单个碱基的差异，并且成本低、通量高、速度快、结果准确、不受检测位点的局限，实现闭管操作，减少样本DNA污染的可能性；与传统的熔解曲线不用，HRM能在相同的温度变化范围内获得更多的数据点，由此体现HRM的“高分辨率”。公知常识证据2（参见第50-52页）还记载：利用SYBR Green I对DNA分子的结合，可以对PCR产物进行熔解曲线检测，由于SYBR Green I是一种大分子不饱和染料，不能保证PCR产物全部嵌合SYBR Green I，且嵌合后的染料在扩增中如不能及时脱落，会抑制PCR反应，高温时染料发生迁移，可能会造成特异性下降；而饱和染料，例如LC Green，对PCR反应没有抑制作用，且结合稳定，熔解曲线分析时，温度上升，扩增子逐渐解链，荧光强度降低，呈线性变化，能准确反映DNA解链，使熔解曲线具有更高的分辨率，高分辨率熔解曲线能实时检测记录升温过程中饱和荧光染料与扩增子结合的情况，通过荧光强度-温度做图产生的熔解曲线，DNA序列中若有一个碱基不同，都会改变DNA解链温度，形成不同形状的熔解曲线。由此可见，PCR-HRM在不同基因型、序列碱基变化上的检测用途，属于本领域的公知技术，其比常规熔解曲线（使用不饱和荧光染料SYBR Green）在检测灵敏度、特异性等方面的优越性也是已知的，在此基础上，本领域技术人员容易想到将PCR-HRM技术替换对比文件1的常规PCR-熔解曲线技术，以提高灵敏度、特异性。另外，对比文件4（参见“具体实施方式”）公开了在检测特定病毒血清型时，设计了针对特定基因片段的一组引物，并通过使用饱和荧光染料LC Green获得了扩增产物的HRM，通过图2-8可以看出，该方法可以有效的区分不同基因型。HRM在对比文件4和本申请中作用相同，都是用于对PCR扩增产物进行分析提高检测分辨率，因此对比文件4也给出了使用PCR-HRM技术提高检测分辨率的技术教导，本领域技术人员在上述对比文件的基础上有动机将常规PCR-熔解曲线技术替换为PCR-HRM技术以提高检测分辨率。
其次，针对螺杆菌的16s rRNA序列进行鉴别检测螺杆菌的具体种类是本领域常规和已知的。经本领域熟知的序列比对可知，权利要求1引物扩增的基因片段属于16s rRNA，对于螺杆菌16s rRNA的检测，对比文件2（参见摘要，第7页的“材料与方法”）已经公开根据GenBank中已发表的螺杆菌属、啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌的16s rRNA，设计通用和区分引物通过PCR对进行检测，对比文件3（参见第240页的“PCR检测方法”）还公开了PCR检测螺杆菌时，16s rRNA与各螺杆菌特有蛋白基因已经成为两类主要的引物设计依据。由此可见，对比文件2-3教导了针对16s rRNA设计引物对各种螺杆菌进行检测。在此基础上，以16s rRNA替换对比文件1中的靶基因用于鉴别检测螺杆菌的具体种类，是显而易见的。
最后，对于权利要求1的引物（SEQ ID NO：1-4），第一，采用通用引物和特异性引物进行PCR-HRM检测的方法是已知的，例如，对比文件4（参见说明书第0011-0018段、“具体实施方式”）公开了采用一对通用引物和一对特异引物，进行PCR扩增，然后进行HRM检测，第二，套式PCR技术也是本领域已知的螺杆菌检测技术，例如，对比文件3（参见第240页的“PCR检测方法”）公开了巢式PCR（即套式PCR）为螺杆菌检测的主要方法之一，其敏感度比普通PCR高约100倍。第三，本领域技术人员知晓，螺杆菌（如本申请涉及的5种）的16s rRNA可以从本领域公知的序列数据库中获得，对多种微生物的检测靶基因进行序列比对分析是本领域常规技术。参见上文所述，对比文件2也公开了该内容，而且对比文件2表1的通用上游引物P7-F与本申请预扩增的上游引物SEQ ID NO：1完全相同。由此可见，在螺杆菌16s rRNA属于已知检测靶基因、套式PCR/PCR-HRM属于已知检测技术的基础上，结合上文所述，公知常识证据1和2所述的HRM检测原理、对比文件4公开的检测方法、对比文件2公开的上游通用引物以及本领域序列数据库已知的螺杆菌16s rRNA序列，本领域技术人员基于序列比对获得本申请5种螺杆菌存在特定序列差别的16s rRNA检测靶基因片段，并设计相应的套式PCR引物（如SEQ ID NO：1-4），从而改进对比文件1的普通PCR-熔解曲线检测方法，是显而易见的。
综上所述，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及公知常识、常规技术手段，获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护：一种鉴别5种啮齿动物螺杆菌的PCR-HRM方法，其特征在于：包括以下步骤：1）从样品中提取螺杆菌DNA；2）以DNA为模板，用权利要求1所述的引物对F1和R1进行预扩增反应获得预扩增产物；3）以预扩增产物作为DNA模板，用权利要求1所述的引物对F2、R2和荧光饱和染料进行PCR-HRM扩增反应获得扩增产物；4）对扩增产物进行HRM分析，确定螺杆菌类型；上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
对比文件1（参见摘要，第535-536页的“PCR detection of Helicobacter organisms”节）公开了一种检测啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌的PCR-熔解曲线方法，具体内容参见上文对权利要求1的评述，相应段落还公开了从组织样品中提取DNA。
因此，权利要求2与对比文件1的区别在于：①二者检测对象和检测方法（包括引物）不同，权利要求2引物（如SEQ ID NO：1-4，即权利要求1的引物）针对的是上述5种螺杆菌的特定基因，获得的是高分辨率熔解曲线（HRM），而对比文件1引物针对是啮齿螺杆菌和盲肠螺杆菌的其他特定基因（Ni/Fe hydrogenase、cdtB基因），获得的是熔解曲线。②权利要求2还限定采用套式PCR-HRM技术，相应的限定了步骤2）至4）。基于上述区别可以确定，权利要求2实际解决的技术问题是通过PCR-HRM有效检测上述5种螺杆菌。
对于区别①，参见上文对权利要求1的评述，基于同样的理由，其是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及公知常识、常规技术手段，能够容易地获得的。
对于区别②，参见上文对权利要求1的评述，基于同样的理由，获得权利要求2涉及的检测对象（啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌）、检测靶基因（16s rRNA）及其扩增的靶片段是显而易见的。对于权利要求2的步骤2）至4），参见上文对权利要求1的评述，对比文件4（参见说明书第0011-0018段、“具体实施方式”）公开了采用一对通用引物和一对特异引物，进行PCR扩增，然后进行HRM检测以确定不同基因型，其中PCR-HRM中采用了荧光饱和染料LC Green。在此基础上，结合对比文件3（参见第240页的“PCR检测方法”）公开的巢式PCR（即套式PCR）螺杆菌检测方法，能够设计并确定权利要求2的步骤2）至4）。
综上所述，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合对比文件2-4以及公知常识、常规技术手段，获得权利要求2请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求2不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3-6进一步限定了步骤2）至3）PCR扩增的体系和反应程序。
参见上文对权利要求2的评述，对比文件4（参见说明书第0011-0018段、“具体实施方式”）公开了PCR扩增的方法，其中反应体系中使用了Premix Taq、ddH2O、模板等试剂，在进行PCR-HRM时使用了LC Green，另外，还公开了PCR的具体反应程序，在此基础上，本领域技术人员根据本申请的引物、扩增的靶基因片段，通过常规实验技术即可获得具体的PCR扩增体系和反应程序（如权利要求3-6的限定），这是容易想到和实现的。因此，在引用的权利要求2不具备创造性时，权利要求3-6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求7进一步限定了步骤4）的HRM具体分析方法。
参见上文对权利要求2的评述，获得权利要求涉及的检测对象（啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、盲肠螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌）、检测靶基因（16s rRNA）、PCR引物及其扩增的靶片段是显而易见的，并且对比文件4（参见说明书第0011-0018段、“具体实施方式”，图2-8）也公开了获得HRM及对检测结果进行分析的方法，包括可区分基因型的HRM图以及其上显示的不同Tm值，由此可见，基于上述内容，本领域技术人员根据具体的靶基因片段，获得相应的阳性对照样品、Tm值，以及依据其判断不同的螺杆菌类型，例如步骤4）的HRM具体分析方法，是显而易见的。因此，在引用的权利要求2不具备创造性时，权利要求7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人的相关意见，合议组认为：
参见上文对权利要求1的评述可知，PCR-HRM技术在不同基因型、序列碱基变化上的检测用途（尤其是对单碱基变化的检测能力），属于本领域的公知技术（如公知常识证据1-2，对比文件4所述），其比常规熔解曲线（如对比文件1）在检测灵敏度、特异性等方面的优越性是已知的，对于复审请求人强调的引物设计问题，一方面，如上所述，检测对象均可扩增、扩增产物Tm有可检测的差异是HRM技术的基本要求，这是熟知的，另一方面，16s rRNA是本领域公知的细菌种属鉴定指标，本领域技术人员能够常规选择16s rRNA作为检测靶标鉴定检测螺杆菌，例如对比文件2公开根据GenBank中已发表的螺杆菌属、啮齿螺杆菌、胆汁螺杆菌、小家鼠螺杆菌、肝螺杆菌的16s rRNA，设计通用和区分引物通过PCR对进行鉴别检测，对比文件3公开了PCR检测螺杆菌时，16s rRNA与各螺杆菌特有蛋白基因已经成为两类主要的引物设计依据。由此可见，针对16s rRNA对不同螺杆菌进行鉴别检测，属于本领域常规选择，在此基础上，将16s rRNA替换对比文件1的特定蛋白检测靶基因，是显而易见的，在对比文件2-3公开了以16s rDNA为各螺杆菌检测靶标的情况下，本领域技术人员有动机比对分析各螺杆菌的16s rDNA序列从而设计引物，而不会毫无目的的比对分析各螺杆菌的全基因组。此外，正如上文对权利要求1的评述，在螺杆菌16s rRNA属于已知检测靶基因、套式PCR/PCR-HRM属于已知检测技术的基础上，结合公知常识证据1和2的HRM检测原理、对比文件4公开的检测方法、对比文件2公开的上游通用引物以及本领域序列数据库已知的螺杆菌16s rRNA序列，基于序列比对获得本申请5种螺杆菌存在特定序列差别的16s rRNA检测靶基因片段，并设计相应的套式PCR引物（如SEQ ID NO：1-4的内外引物），从而改进对比文件1的普通PCR-熔解曲线检测方法，是显而易见的。在上述分析基础上，没有证据表明本申请对检测引物序列的具体选择需要付出创造性的劳动。虽然复审请求人还强调了仅内引物即可鉴定出5种螺杆菌的问题，但是，权利要求请求保护的引物为两对，其涉及的RCR-HRM检测方法使用的引物也为两对，本申请说明书实施例1-3在鉴别和区分5种螺杆菌时，采用的也均是两对引物的套式PCR技术，并未记载实验数据以证明仅一对引物进行PCR即可达到怎样的效果。并且，参见上文评述的理由，也无法认可本申请的内引物相对于上述现有技术教导的HRM检测（例如内引物），能达到怎样更优的，甚至预料不到的检测效果。因此无法基于复审请求人强调的外、内引物问题认可本申请的创造性。
对于复审请求人强调的解决的技术问题、取得的技术效果等，参见上文所述以及对权利要求1的评述可知，公知常识证据1-2、对比文件4已经公开了PCR-HRM检测原理、及其在单碱基变化/基因分型区分能力、单体系检测、高通量性、高特异性/灵敏度等方面的技术效果，因此本申请要求保护的技术方案所能解决的技术问题、取得的技术效果，是本领域技术人员基于上述现有技术，通过常规的实验即能取得或证实的，不构成预料不到的技术效果。
综上所述，复审请求人意见陈述的理由不成立。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年04月25日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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