发明创造名称：多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用
外观设计名称：
决定号：182817
决定日：2019-07-03
委内编号：1F250111
优先权日：
申请（专利）号：201510121430.3
申请日：2015-03-19
复审请求人：伊正君
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：杨莹跃
合议组组长：尹昕
参审员：魏聪
国际分类号：C12N15/74，C12N15/60，A61K48/00，A61K30/04，A61K38/51，A61P31/06
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点：如果发明与最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术中已经给出了将上述区别特征应用于最接近的现有技术以解决实际解决的技术问题的技术启示，且没有取得预料不到的技术效果，则本发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510121430.3，名称为“多噬菌体裂解酶基因的共表达体系、构建方法、携载体系的活疫苗、活疫苗的制备及其应用”的发明专利申请。申请人为伊正君。本申请的申请日为2015年03月19日，公开日为2015年06月03日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月10日以权利要求1-9不符合专利法第22条第3款的规定驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2017年12月07日提交的权利要求1-9，申请日2015年03月19日提交的说明书第1-106段、说明书附图1-10、说明书摘要和摘要附图。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：以真核表达质粒pZM0为表达载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系；先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，以真核表达质粒为框架质粒，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的NheⅠ酶切位点，将测序正确的LysinB-Holin基因片段插入所述框架质粒的Hind Ⅲ和XbaⅠ之间，将测序正确的LysinA基因片段插入所述框架质粒的NotⅠ和BstBⅠ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。
2. 如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将LysinA、LysinB以及Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。
3. 如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-Holin基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。
4. 如权利要求3所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：所述共表达体系是通过将获得的LysinA基因片段、LysinB-link-Holin融合基因片段定向插入含有分枝杆菌属OriM复制子的质粒框架中而获得的。
5. 如权利要求1所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于：先用PCR扩增技术分别获得OriM复制子基因片段、LysinA基因片段、LysinB基因片段与Holin基因片段，将LysinB与Holin基因片段用疏水甘氨酸接头编码序列拼接获得LysinB-link-Holin融合基因片段，将测序正确的分枝杆菌属OriM复制子插入所述框架质粒的NheⅠ酶切位点，将测序正确的LysinB-link-Holin融合基因片段插入所述框架质粒的Hind Ⅲ和XbaⅠ之间，将测序正确的LysinA基因片段插入所述框架质粒的NotⅠ和BstBⅠ之间，获得了同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系。
6. 如权利要求1或者5所述的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，其特征在于： 所述真核表达质粒含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子。
7. 携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，其特征在于：以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，携载如权利要求1所述的表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因的共表达体系的重组活疫苗。
8. 制备如权利要求7所述的携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗的方法，其特征在于：以具有巨噬细胞良好靶向性的耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG为活载体，将同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因的共表达体系电转化入耻垢分枝杆菌或经过基因改造的重组BCG活载体中，然后通过体外扩增，得到所述重组治疗性结核活疫苗。
9. 如权利要求7所述的携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗在制备治疗增殖性结核杆菌、休眠性结核杆菌与耐药性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染领域的药物中的应用。”
驳回决定认为：权利要求1与对比文件1（“结核杆菌噬菌体D29 LysinB的克隆表达、纯化及活性分析”，侯丽丽，中国硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑，2010年第12期，A006-36，公开日为2010年12月15日）的区别在于（1）表达载体中还携载了LysinA和Holin这2个裂解酶基因进行多基因共表达；（2）表达载体为真核表达质粒pZM0，并限定了构建方法。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题为提供一种同时还包含LysinA和Holin的多噬菌体裂解酶基因的真核共表达体系进行巨噬细胞靶向表达。对于区别特征（1），对比文件2（“分枝杆菌噬菌体D29应用于耐药结核病治疗的探索性研究”，杨文慧，中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑，2009年第09期，E061-11，公开日为2009年09月15日）分枝杆菌噬菌体D29的裂解酶编码基因和穿孔素基因，结合对比文件1公开的为实现对宿主菌的裂解，分枝杆菌噬菌体除了需要编码能水解肽聚糖层的内溶素之外，还需要借助另外一种酶来裂解分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖连接键并释放出游离的分支菌酸，致使分枝杆菌的外膜分解，LysB在对于辅助内溶素实现对分枝杆菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面发挥着重要的作用，为了提高裂解效果，出于减少表达载体、简化实验步骤的目的，本领域技术人员有动机将将这三个基因连接到同一个表达载体中进行多基因共表达。对于区别特征（2），对比文件3公开了一种利用真核表达载体pZM03导入耻垢分枝杆菌并靶向巨噬细胞进行多基因共表达的方法，也公开了含有目的基因的pZM03重组质粒的构建方法，本领域技术人员有动机采用对比文件3公开的共表达体系构建方式来表达对比文件1和2所公开的裂解酶基因，而PCR扩增得到目的片段、在多克隆位点上的插入位置是本领域的常规技术手段，因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求2-6的附加技术特征是本领域的常规技术手段，或者已被对比文件1或3所公开，因此，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求7-9请求保护重组治疗性结核活疫苗及其制备方法和应用，在对比文件3公开内容的基础上，以耻垢分支杆菌为载体构建靶向结核杆菌的共表达体系活疫苗对于本领域技术人员而言是显而易见的，将上述疫苗用于制备针对结核杆菌感染的药物也是本领域技术人员容易想到的，基于与权利要求1的评述类似的理由，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人伊正君（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月13日向国家知识产权局提出了复审请求，但未修改申请文件。
复审请求人在意见陈述书中指出，对比文件1-2与本申请是不同的表达载体，并未涉及共表达LysinA、LysinB和Holin三种基因的共表达载体。而要做到同时携载以上三种基因并能保证成功表达，对表达载体的选择、三种基因的酶切位点和选择、三种基因的排列顺序等选择是需要付出创造性劳动的，而且本申请可以实现对Mtb的多靶点高效裂解和杀灭，解决结核病防治中的胞内潜伏、多药耐药、再燃和复发等问题，具有预料不到的技术效果。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月03日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，对比文件1-2体现了三个基因的协同作用，现有技术中存在启示将三个基因进行共表达裂解结核杆菌，对比文件3公开了靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒的重组耻垢分支杆菌治疗性活疫苗，以耻垢分支杆菌为载体靶向巨噬细胞，该系统也是靶向巨噬细胞杀灭结核杆菌治疗结核病，本领域技术人员有动机选择现有技术中该真核表达系统进行结核病治疗。对于三个基因的共表达系统，将这三个基因在含有两个启动子的pZM03真核质粒中表达，有两个基因需要共用一个启动子，其组合方式只有三个，并非无限量组合，并且用疏水性甘氨酸作为linker将两个基因融合是本领域的常规手段，其能够靶向巨噬细胞裂解结核杆菌治疗结核病的效果是本领域技术人员可合理预期的。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月26日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件3相比的区别在于，权利要求1中的真核表达系统所携带的基因是噬菌体裂解酶LysinA、LysinB以及Holin基因，而对比文件3中则是GLS/IL12，且在具体构建载体的过程中所使用的酶切位点略有不同。基于上述区别特征，本申请权利要求1实际解决的技术问题是提供针对结核分枝杆菌具有抗菌活性的另外一种真核表达系统。对于上述区别特征，首先，对比文件1公开了噬菌体D29能够裂解结核分枝杆菌，其具有三个裂解酶基因，分别是内溶素lysA、穿孔素hol和lysB, 其中LysB对于辅助内溶素对分枝杆菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面发挥着重要的作用，噬菌体裂解酶在体内裂解细菌细胞壁，有时还要求第2个裂解因子——Holin蛋白。进一步指出噬菌体裂解酶在作为抗菌药物方面具有优势，使得其成为很有潜力的抗菌物质；对比文件2进一步确认了噬菌体D29的穿孔素基因能够引起宿主菌的溶菌，可见，对比文件1和2给出了上述三种基因的编码产物能够裂解结核分枝杆菌的教导。此外，对比文件1还进一步教导了LysB可辅助LysA对分枝杆菌的裂解，且上述三种裂解酶是基于不同的溶菌/裂菌机理发挥其抗菌作用，基于尽可能地提高对结核分枝杆菌的裂解效率、更广泛地针对各种类型的结核分枝杆菌的普遍需求，本领域技术人员容易想到将LysinA，LysinB和Holin组合使用。其次，对比文件3将真核表达系统导入耻垢分枝杆菌后，能够分别通过基因治疗（即表达和释放治疗性基因GLS）和免疫治疗（利用耻垢分枝杆菌与IL12的作用激发宿主特异性细胞免疫响应）发挥治疗结核病的作用，上述两方面的治疗作用是相互独立的，IL-12是作为增强免疫治疗的辅助，为充分保证多个治疗性基因的表达，本领域技术人员可以选择在对比文件3的真核表达系统中不再携带和表达IL-12，对比文件3所使用的真核表达质粒pBudCE4.1中仅有两个启动子，当要携带和表达三个基因时，需要其中两个基因共用一个启动子，将它们融合表达，而在操作时具体选择将哪两个基因（例如LysinB和Holin）进行融合则可由本领域技术人员常规选择确定。最后，对于构建过程中用于插入基因的酶切位点可以由本领域技术人员常规选择确定。综上，在对比文件3的基础上，结合对比文件1、2以及本领域的常规技术手段得到权利要求1的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，因此权利要求1不具备创造性。权利要求2-6的附加技术特征是本领域的常规技术手段，或者已被对比文件1或3所公开，因此，上述权利要求也不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
权利要求7请求保护两个并列技术方案：方案一涉及耻垢分枝杆菌为活载体；方案二涉及经基因改造的重组BCG为活载体。对于方案一：对比文件3公开了将表达质粒入耻垢分枝杆菌中，基于与权利要求1的评述相同的理由，上述技术方案不具备创造性，对于方案二：BCG为重组卡介苗，而本领域熟知其即可作为针对结核分枝杆菌的特异性疫苗激发机体对于结核分枝杆菌的免疫响应，也可作为基因载体递送外源基因，可与耻垢分枝杆菌替换使用，因此该技术方案也不具备创造性。综上，权利要求7也不符合专利法第22条第3款的规定。构建重组疫苗的具体步骤已被对比文件3公开，将所述携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗用于制备增殖性和休眠性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染的药物也是本领域技术人员容易想到的，因此，权利要求8-9也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审请求人的意见，合议组指出：上述三种裂解酶是基于不同的溶菌/裂菌机理，针对结核分枝杆菌的不同靶点发挥其抗菌作用，基于尽可能地提高对结核分枝杆菌的裂解效率、更广泛地针对各种类型的结核分枝杆菌的普遍需求，在对比文件3公开的真核表达质粒的基础上，本领域技术人员容易想到将LysinA，LysinB和Holin组合使用，而三种基因组合后可以实现对结核分枝杆菌的多靶点高效裂解和杀灭，以解决胞内潜伏、多药耐药、再燃和复发等问题也是本领域技术人员基于上述裂解酶基因的作用机制能够合理预期的，并非预料不到的技术效果。
复审请求人于2019年05月05日、2019年05月09日两次提交了意见陈述书，但均未修改申请文件。复审请求人在意见陈述书中重申了提出复审请求时的理由，强调其说明书中明确记载了本申请所实现的对Mtb的多靶点高效裂解和杀灭，能够杀灭潜伏感染的有细胞壁Mtb和细胞壁缺陷型Mtb，还可以高效杀灭增殖型Mtb与耐药性Mtb，并且实施例部分记载了其能在小鼠巨噬细胞内表达且具有明显的杀菌效应，产生了预料不到的技术效果。此外，复审请求人还进一步指出对比文件3公开的是和权利要求1完全不同的基因表达体系，不能作为最接近的现有技术。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未修改申请文件，因此本复审通知书针对的文本同驳回决定，即申请日2015年03月19日提交的说明书摘要、说明书第1-106段、摘要附图、说明书附图1-10,以及2017年12月07日提交的权利要求第1-9项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果发明与最接近的现有技术存在区别特征，而现有技术中已经给出了将上述区别特征应用于最接近的现有技术以解决实际解决的技术问题的技术启示，且没有取得预料不到的技术效果，则本发明不具备创造性。
本申请权利要求1请求保护一种多噬菌体裂解酶基因的共表达体系，以真核表达质粒pZM0为表达载体，同时携载LysinA、LysinB以及Holin裂解酶基因，同时表达三种靶向结核杆菌的噬菌体裂解酶基因，以及构建共表达体系的步骤。根据本申请说明书的记载，构建前述共表达体系的实例即为以真核表达质粒pZM0为原始载体，首先插入LysinB-link-Holin融合基因构建了pZM0-1载体，在此基础上再插入LysinA基因构建pZM0-2载体，最后插入OriM复制子片段构建获得pZM0A共表达载体（参见实施例4），其相应的图谱参见本申请附图1。
对比文件3公开了一种携带GLS/IL-12的真核共表达穿梭质粒pZM03及其构建方法，具体步骤包括将GLS基因片段克隆入双启动子真核共表达质粒pBudCE4.1的HindIII/BamHI中，将IL-12基因亚克隆如pBudCE4.1的NotI/KpnI位点中，将分枝杆菌复制子OriM基因亚克隆入pBudCE4.1的NheI位点中，形成穿梭/共表达质粒pZM03（参见摘要第4页“研究策略与方法”一节）。其中，GLS是人体NK细胞和CTL细胞产生的一种天然抗菌肽，在穿孔素辅助下可进入巨噬细胞中并对胞内吞噬的结核杆菌（Mtb）进行直接杀伤，主要是吸附结合在细菌的细胞壁上，之后通过其带有大量正电荷的功能结构域与细菌细胞膜相互作用，通过裂解细胞膜和破坏细胞膜的稳定性等机制发挥杀菌作用。对比文件3采用上述质粒转染已感染H37Rv的RAW264.7细胞后，发现GLS对Mtb产生了直接的细胞毒性作用（参见对比文件3第19页倒数第2段，第59页第三部分）。由此可见，对比文件3利用质粒pBudCE4.1携带治疗性基因GLS构建获得了可针对结核杆菌进行基因治疗的真核表达系统。由本申请附图1中所显示的pZM0A载体的图谱来看，其与对比文件3中所使用的质粒pBudCE4.1的图谱相比仅插入了两段外源基因，二者载体中的其它元件则完全相同，也就是说对比文件3构建方法的出发表达载体pBudCE4.1与本申请构建pZM0A载体的出发载体pZM0的图谱相同，且对比文件3在pBudCE4.1载体的基础上获得的构建体（pZM03）与本申请前述载体（pZM0-1、pZM0-2）的命名方式一致，可见，对比文件3中的原始出发载体pBudCE4.1实质上即为本申请中所采用的pZM0载体。因此，权利要求1与对比文件3所公开的上述技术方案相比的区别在于：权利要求1中的真核表达系统所携带的基因是噬菌体裂解酶LysinA、LysinB以及Holin基因，而对比文件3中则是GLS/IL12，且在具体构建载体的过程中所使用的酶切位点略有不同。本申请说明书记载了所要求保护的多噬菌体裂解酶基因的共表达体系能够有效表达LysinA、LysinB、Holin裂解酶，具有明显的杀灭结核杆菌的效应，相应的重组疫苗能够有效治疗结核感染小鼠（参见本申请说明书第92-105段以及图5A-9B），因此，基于上述区别特征，本申请权利要求1实际解决的技术问题是提供针对结核分枝杆菌具有抗菌活性的另外一种真核表达系统。
对于上述区别特征，首先，对比文件1涉及结核分枝杆菌噬菌体D29的裂解酶基因，其具体公开了噬菌体D29能够裂解结核分枝杆菌，其具有三个裂解酶基因，分别是lysA（gp10）、hol（gp11，gene11）和lysB（gp12）（即分别为本申请中的LysinA、Holin和LysinB基因），其中，LysA是内溶素，Hol是穿孔素，而LysB不仅具有分解脂肪的活性，还是一种新型的分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖酯酶。为了实现对宿主菌的裂解，分枝杆菌除了需要编码能够水解肽聚糖层的内溶素之外，还需要借助另外一种酶来裂解分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖连接键并释放出游离的分支菌酸，致使分枝杆菌的外膜分解。而LysB能裂解分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖连接键并释放出游离的分支菌酸，对于辅助内溶素对分枝杆菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面发挥着重要的作用。噬菌体裂解酶在体内裂解细菌细胞壁，有时还要求第2个裂解因子——Holin蛋白，其是一种疏水性的跨膜蛋白，在噬菌体复制晚期于细胞膜上形成非特异性的孔洞和损伤，其中该Holin（也即Holing）蛋白在噬菌体D29中是gp11。对比文件1进一步指出噬菌体裂解酶在作为抗菌药物方面具有优势，使得其成为很有潜力的抗菌物质（参见摘要第2段，正文第3页，第6页表2，倒数第2段，第9页第1段）。
对比文件2中进一步确认了噬菌体D29的穿孔素基因为gene11（即Holin），并通过构建携带其的原核表达载体验证了该基因能够引起宿主菌的溶菌（参见对比文件2第4页倒数第2段，第62页第3.3.3节，第66页第1段）。
由此可见，对比文件1和2给出了上述三种基因的编码产物能够裂解结核分枝杆菌的教导，它们与对比文件3中的GLS所起的作用和功能相同，均是作为抗菌肽以裂解结核分枝杆菌。
此外，对比文件1还进一步教导了LysB可辅助LysA对分枝杆菌的裂解，且上述三种裂解酶是基于不同的溶菌/裂菌机理发挥其抗菌作用，而基于尽可能地提高对结核分枝杆菌的裂解效率、更广泛地针对各种类型的结核分枝杆菌的普遍需求，本领域技术人员容易想到将LysinA，LysinB和Holin组合使用。因此，基于对比文件3采用的真核表达系统可携带治疗性基因以针对结核杆菌进行基因治疗，在面对上述技术问题时，本领域技术人员容易想到采用对比文件3中公开的真核表达系统来携带上述三种基因的共同组合作为治疗性基因。
其次，虽然对比文件3的真核表达系统除了携带治疗性基因GLS之外，还携带有IL-12基因，然而，对于IL-12的功能和其在真核表达系统中所起的作用，对比文件3明确记载“IL-12是一种功能强大的Th1型细胞免疫反应增强剂……”、“本部分实验……具体机制主要包括：耻垢分枝杆菌本身是较强的Th1型细胞免疫佐剂，虽然其抗原成分复杂，但由于IL-12的Th1极化作用，可确保免疫机体后获得我们所希望的免疫反应类型。利用耻垢分枝杆菌菌体抗原与IL-12共同作用于结核感染的机体后，通过分枝杆菌属共同抗原促进并激发宿主针对结核杆菌的特异性细胞免疫，纠正机体的免疫状态，间接清除体内业已感染的Mtb”（参见对比文件3正文第46页第1行、第94页第2-3段），由此可见，对比文件3将真核表达系统导入耻垢分枝杆菌后，能够分别通过基因治疗（即表达和释放治疗性基因GLS）和免疫治疗（利用耻垢分枝杆菌与IL12的作用激发宿主特异性细胞免疫响应）发挥治疗结核病的作用，上述两方面的治疗作用是相互独立的，IL-12是作为增强免疫治疗的辅助，并非表达治疗性基因所必需的，也不会对上述系统的基因治疗功效产生影响。而在需要同时表达多个治疗性基因的情况下，由于真核表达系统的启动子、终止子等基因表达所必需的元件是有限的，因此，为充分保证多个治疗性基因的表达，本领域技术人员可以选择在对比文件3的真核表达系统中不再携带和表达IL-12，这仅仅是基于临床需要对侧重于基因治疗或免疫治疗作出相应的权衡之后所进行的一种常规调整。如前所述，对比文件3所使用的真核表达质粒pBudCE4.1中仅有两个启动子，当要携带和表达三个基因时，需要其中两个基因共用一个启动子，将它们融合表达，而在操作时具体选择将哪两个基因（例如LysinB和Holin）进行融合则可由本领域技术人员常规选择确定。
最后，对于构建过程中用于插入基因的酶切位点，NotI/KpnI/BstBI、HindIII/BamHI/XbaI等酶切位点均是对比文件3中所使用的真核表达质粒的多克隆位点，在上述多克隆位点中插入待表达的基因是本领域的常规技术手段，而在多克隆位点上的具体插入位置（即选择哪些酶切位点）则可以由本领域技术人员根据待表达基因序列中是否存在相同的酶切位点常规选择确定，属于基因工程领域的常规技术手段。
综上所述，在对比文件3的基础上，结合对比文件1、2以及本领域的常规技术手段得到权利要求1的技术方案对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且本申请技术方案并未取得预料不到的技术效果，因此，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2-4的附加技术特征进一步限定了构建共表达体系的步骤，基于与评述权利要求1相同的理由，上述权利要求也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求5引用权利要求1，其附加技术特征进一步限定了将LysinB与Holin基因片段用疏水甘氨酸接头连接。如前所述，选择将LysinB和Holin基因进行融合表达是本领域技术人员的常规选择，而通过接头序列（linker）将两个不同的目的基因连接起来使其两种表达蛋白在互不干扰的情况下充分折叠成各自的天然构象是本领域构建载体的常规技术手段，且用疏水甘氨酸作为Linker是本领域的常规手段（例如，参见居乃琥主编，《酶工程手册》，第904页第1行，2011年08月）。综上，将LysinB和Holin基因片段使用疏水甘氨酸接头编码序列拼接在一起形成LysinB-link-Holin融合基因是本领域技术人员容易想到的。因此，在其引用的在前权利要求不具备创造性的情况下，权利要求5也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求6进一步限定了所述真核表达质粒含有2个多克隆酶切位点区域，两个独立的启动子。如前所述，对比文件3中所使用的质粒为pBudCE4.1，该质粒作为本领域中常见的真核表达载体，其具有两个独立的启动子和两个多克隆酶切位点区域是本领域技术人员所熟知的。对此，对比文件3的文字也明确记载了“该质粒是一种真核共表达质粒，人GLS和小鼠单链IL-12分别处于强效真核启动子Pcwv和PEF1-a的控制下，能够在真核细胞宿主中实现共表达”（参见对比文件3第46页第14-15行）。因此，在其引用的在前权利要求不具备创造性的情况下，权利要求6也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求7请求保护携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗，其由两个并列技术方案组成：方案一涉及耻垢分枝杆菌为活载体；方案二涉及经基因改造的重组BCG为活载体。
对于方案一，对比文件3除了公开携带GLS/IL-12的真核共表达穿梭质粒pZM03之外，也进一步公开其将上述表达质粒导入耻垢分枝杆菌ATCC607中，构建可靶向递送pZM03质粒进入巨噬细胞（MΦ）中进行表达的重组治疗性活疫苗pZ607（参见对比文件3第78页第2段，第94页第2-3段，第96页小结部分第1点），由此可见，权利要求7与对比文件3公开的上述活疫苗pZ607相比的区别特征仍在于：权利要求7中的真核表达系统所携带的基因是噬菌体裂解酶LysinA、LysinB以及Holin基因，而对比文件3中则是GLS/IL12，且在具体构建载体的过程中所使用的酶切位点略有不同。根据上述区别特征，权利要求7的方案一实际解决的技术问题是提供针对结核分枝杆菌具有抗菌活性的另外一种活疫苗。基于与权利要求1的评述相同的理由，上述技术方案不具备创造性。
对于方案二，其与对比文件3相比的区别除了上述区别特征之外，还在于选择经基因改造的重组BCG作为活载体。其中，BCG为重组卡介苗，而本领域熟知其即可作为针对结核分枝杆菌的特异性疫苗激发机体对于结核分枝杆菌的免疫响应，也可作为基因载体递送外源基因（例如，参见韩瑞发、畅继武主编，《浅表膀胱肿瘤的基础与临床》，天津：天津科学技术出版社，2004年03月，第123-124页），与对比文件3和本申请中的耻垢分枝杆菌的作用和功能类似，可替换使用，对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此，该技术方案不具备创造性。综上所述，权利要求7也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求8请求保护制备如权利要求7所述的携带多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗的方法。如权利要求7的评述所述，构建重组疫苗的具体步骤已被对比文件3公开（参见对比文件3摘要第4页“研究策略与方法”一节），且上述步骤也是本领域中构建重组基因表达载体和重组活疫苗的常规步骤，因此，在其所引用的权利要求7不具备创造性的情况下，权利要求8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求9请求保护如权利要求7所述的重组治疗性结核活疫苗的制药用途。如前所述，对比文件3公开了重组治疗性活疫苗pZ607，并进一步指出上述治疗性活疫苗能够用于结核病的预防和治疗，而且可以直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，阻断结核杆菌在巨噬细胞内的潜伏（参见对比文件3第110页第1段，第94页第3段最后一句，第20页倒数第2段）；对比文件1中也指出噬菌体裂解酶不仅具有高效专一的灭菌活性，对耐药性菌株有很好的作用，细菌不会对其产生抗性，其是具有潜力的抗菌物质（参见对比文件1正文第4页最后一段，第5页第1段，第8页第1.5节）。在此基础上，将所述携载多噬菌体裂解酶基因共表达体系的重组治疗性结核活疫苗用于制备增殖性和休眠性结核杆菌引起的活动性结核或潜伏结核感染的药物也是本领域技术人员容易想到的。因此，权利要求9不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
3、关于复审请求人的意见
对于复审请求人的意见，合议组认为，
（1）最接近的现有技术的确定，应从现有技术所属的技术领域、所涉及的技术问题、产生的技术效果、实现的功能、用途及其公开的技术特征等多个角度综合考量。本案中，对比文件3涉及靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒及重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗的构建，直接针对的是结核病的治疗，该对比文件进一步从体外细胞水平、体内活体水平方面研究了该共表达质粒在小鼠细胞内表达天然抗菌肽GLS以及该治疗性活疫苗杀灭小鼠体内结核杆菌的效果，其结果表明该共表达质粒具有细胞内直接杀菌活性，而以耻垢分枝杆菌为载体构建的该治疗性活疫苗具有良好的靶向性，其表达的GLS能够直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，而且能够激发小鼠针对结核杆菌的特异性Th1型细胞免疫（参见对比文件3的摘要），由此可见，对比文件3的技术领域、所要解决的技术问题、产生的技术效果及其用途与本申请均高度相关。同时，如前所述，对比文件3中公开了权利要求1中的大部分技术特征，例如所使用的共表达载体与本申请实质上相同，构建载体的具体步骤也非常类似，区别仅在于真核表达系统所携带的抗菌肽基因及构建过程中酶切位点的选择不同。综上可见，对比文件3能够作为本申请的最接近现有技术。
（2）对比文件1中说明了D29噬菌体的裂解酶编码基因（lysinA、lysinB、holin）是临近相连的一个基因簇（参见对比文件1表2，第6页第2段），而且还明确指出LysB能裂解分支菌酸酰基阿拉伯半乳糖连接键并释放出游离的分支菌酸，对于辅助内溶素对分枝杆菌的裂解以及提高宿主菌的裂解效率方面发挥着重要的作用（参见对比文件1正文第9页第1段），对比文件2中表明Holin是噬菌体的第二裂解因子，其功能是在细胞膜上形成“孔洞”，将该基因导入细菌后能够产生溶菌作用（参见对比文件2第66页第1段）。可见，上述三种裂解酶是基于不同的溶菌/裂菌机理，针对结核分枝杆菌的不同靶点发挥其抗菌作用，基于尽可能地提高对结核分枝杆菌的裂解效率、更广泛地针对各种类型的结核分枝杆菌的普遍需求，由此在对比文件3公开的真核表达质粒的基础上，本领域技术人员容易想到将LysinA，LysinB和Holin组合使用并将真核共表达质粒导入耻垢分枝杆菌中。同时，对比文件3还指出耻垢分枝杆菌作为基因治疗的生物体载体，将治疗性基因自然带入巨噬细胞后可在巨噬细胞内高效转录和表达，直接杀灭胞内潜伏的结核杆菌，阻断结核杆菌在巨噬细胞内的潜伏（参见对比文件3第94页倒数第3段）。基于上述内容，本申请的技术方案能够实现对结核分枝杆菌的多靶点高效裂解和杀灭，杀灭各种类型的结核杆菌，解决胞内潜伏、多药耐药、再燃和复发等问题的效果均是本领域技术人员基于上述裂解酶基因及其载体的作用机制能够合理预期的，并非预料不到的技术效果。至于构建表达系统时对酶切位点的选择则是由本领域技术人员根据待表达基因序列中是否存在相同的酶切位点常规选择确定的，这属于基因工程领域的常规技术手段；三种基因的排列顺序也可由本领域技术人员常规选择确定，且上述选择并未取得预料不到的技术效果。
综上，复审请求人陈述的理由并不成立。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月10日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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