发明创造名称：一种芽孢杆菌发酵高效联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法
外观设计名称：
决定号：182751
决定日：2019-07-02
委内编号：1F248182
优先权日：
申请（专利）号：201310514337.X
申请日：2013-10-25
复审请求人：武汉骏安生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：韩世炜
合议组组长：魏聪
参审员：李金光
国际分类号：C12P13/02,C12P7/18,C12R1/10,C12R1/125
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征，但现有技术中给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且引入该区别技术特征后的技术方案未取得预料不到的技术效果，则权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201310514337.X，名称为“一种芽孢杆菌发酵高效联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法”的发明专利申请。申请人为武汉骏安生物科技有限公司。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年12月19日以本申请不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为申请日提交的说明书摘要、说明书第1-75段、2017年9月18日提交的权利要求第1-4项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种利用芽孢杆菌发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、采用冷冻保藏的芽孢杆菌作为生产菌种；
所述芽孢杆菌包括地衣芽孢杆菌WX-02，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M208065或枯草芽孢杆菌X-003，保藏于中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO：M202048；
b、制备种子液：
将上述冷冻保藏的菌种接种到LB固体培养基平板上，37℃恒温培养12-24h，使其活化；再将上述活化的种子转接到LB液体种子培养基中，37℃，200r/min培养8-12h；
所述LB固体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L、琼脂15g/L，pH7.0；
所述LB液体种子培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母浸出物5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；
c、分批发酵培养：
(1)配制联产发酵培养基，其组成为：葡萄糖70-170g/L，谷氨酸钠10-80g/L，硝酸钠0-15g/L，K2HPO4·3H2O 0.5-2g/L，MgSO4·7H2O 0.5-2g/L，CaCl2·2H2O 0.05-1.5g/L，ZnSO4 0.05-1.5g/L，MnSO4 0.05-0.15g/L，初始pH值为7.0-7.5；
(2)三角瓶发酵按50-100mL/500mL的装液量，装入上述培养基，115℃灭菌30min，接种量为1-3％，37℃培养30-60h；发酵罐按容积的50-80％的装液量投入上述发酵培养基，115℃灭菌30min，接入种子液；37℃培养30-60h，通气比1∶0.5-2(V/V)。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中硝酸钠浓度为5-15g/L。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中谷氨酸钠浓度为10-80g/L。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基中葡萄糖浓度为70-170g/L。”
驳回决定认为：权利要求1请求保护一种利用芽孢杆菌发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法，其中包含四个并列技术方案：（1-1）所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065），摇瓶发酵生产；（1-2）所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065），发酵罐发酵生产；（2-1）所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048），发酵罐发酵生产；（2-2）所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048），摇瓶发酵生产。
对于技术方案（1-1）和（1-2），对比文件1（CN101603015A，公开日：2009年12月16日）公开了利用地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065）发酵生产聚-γ-谷氨酸的方法，包括“采用冷冻保藏的地衣芽孢杆菌作为生产菌种”、“菌种活化”、“种子液培养”、“摇瓶发酵培养”/“发酵罐发酵培养”的生产工序及其详细参数。技术方案（1-1）和（1-2）与对比文件1公开的内容相比，其区别在于：（1）技术方案（1-1）和（1-2）中的地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065）还可以同时发酵生产2,3-丁二醇；（2）生产过程中具体的条件参数有所不同。基于上述区别技术特征，本发明实际解决的技术问题是：利用地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065）生产更多的发酵产品。对于上述区别特征（1），对比文件2（CN102391970A，公开日：2012年03月28日）给出了“地衣芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示，并且公开了2,3-丁二醇是一种用途非常广泛的有机原料。因此，为了得到更多的发酵产品，本领域技术人员有动机尝试在利用地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065）发酵生产聚-γ-谷氨酸的同时，发酵生产2,3-丁二醇，并能够通过常规的实验手段加以验证。对于上述区别特征（2），为了优化生产工艺，本领域技术人员能够根据实际需要通过单因素分析或正交试验等常规实验手段对其中的某些参数进行适当地调整，如菌种活化培养基中琼脂的比例、pH值、活化时间，菌种在种子液中扩大培养的时间，摇瓶发酵培养基中氮源的比例、高压灭菌的温度、接种量。这属于本领域的常规技术手段，且该权利要求限定的上述参数均在常规范围内。综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2得出权利要求1请求保护的技术方案（1-1）和（1-2），对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案（1-1）和（1-2）不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
对于技术方案（2-1）和（2-2），对比文件3（CN1536071A，公开日：2004年10月13日）公开了利用枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048）发酵生产聚-γ-谷氨酸的方法，包括“采用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌作为生产菌种”、“菌种活化”、“种子液培养”、“发酵罐发酵培养”的生产工序及其详细参数。技术方案（2-1）和（2-2）与对比文件3公开的内容相比，其区别在于：（1）技术方案（2-1）和（2-2）中的枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048）还可以同时发酵生产2,3-丁二醇；（2）生产过程中具体的条件参数有所不同。基于上述区别技术特征，本发明实际解决的技术问题是：利用枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048）生产更多的发酵产品。对于上述区别特征（1），对比文件4（CN101851598A，公开日：2010年10月06日）给出了“枯草芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示，而且公开了2,3-丁二醇具有广泛的化工和医药用途。因此，为了得到更多的发酵产品，本领域技术人员有动机尝试在利用枯草芽孢杆菌X-003（保藏编号为CCTCC NO：M202048）发酵生产聚-γ-谷氨酸的同时，发酵生产2,3-丁二醇，并能够通过常规的实验手段加以验证。对于上述区别特征（2），本领域技术人员能够根据实际需要通过单因素分析或正交试验等常规实验手段对其中的某些参数进行适当地调整，如菌种活化培养基中琼脂的比例、活化时间，菌种在种子液中扩大培养的时间，发酵罐发酵培养基中碳源氮源的比例、发酵时间。这属于本领域的常规技术手段，且该权利要求限定的上述参数均在常规范围内，其技术效果也可以预见。综上所述，在对比文件3的基础上结合对比文件4得出权利要求1请求保护的技术方案（2-1）和（2-2），对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案（2-1）和（2-2）不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-4分别对权利要求1所述的发酵培养基中硝酸钠、谷氨酸钠、葡萄糖的浓度作了进一步限定。然而，对比文件1公开了摇瓶发酵培养基中硝酸根（0.1875mol/L）、钠离子（0.3548mol/L）、谷氨酸钠60 g/L（介于10-80g/L之间）、葡萄糖90克（介于70-170g/L之间）；发酵罐培养基中氯化铵2％、谷氨酸钠7％（介于10-80g/L之间）、葡萄糖7％（介于70-170g/L之间）。因此，本领域技术人员能够根据实际需要通过单因素分析等常规实验手段对发酵培养基中氮源的浓度进行适当地调整，其技术效果可以预期。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-4请求保护的技术方案也不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人武汉骏安生物科技有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年04月03日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。
复审请求人认为：（1）对比文件1和对比文件2因菌种和目标产物不同，公开的发酵培养基差别较大，而且对比文件1或对比文件2中均未给出2,3-丁二醇的生成可以消耗因生产聚-γ-谷氨酸积累的大量还原力有利于聚-γ-谷氨酸产率增加的技术启示，故本领域技术人员不能从对比文件2中得到相应的技术启示并将其应用到对比文件1中；同理，本领域技术人员不能从对比文件4中得到相应的技术启示并将其应用到与对比文件3中，因此上述技术方案是非显而易见的。（2）在同一发酵体系中实现联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇，首先需要克服的就是统一聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的发酵条件。例如，增加谷氨酸钠浓度能提高聚-γ-谷氨酸的产量，且并不影响2,3-丁二醇的产量，但是谷氨酸钠用量增加会使发酵周期延长、还会降低谷氨酸的利用率。同时，葡萄糖浓度较高时，2,3-丁二醇的产率保持相当高的水平，因此提高葡萄糖浓度有利2,3-丁二醇的积累，但是在发酵后期聚-γ-谷氨酸的产率极低，且使发酵周期延长。此外，硝酸钠在本发明中不仅是一种无机氮源，为发酵生产提供NO3-和Na ，增加聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的产率，在本发明发酵后期，因发酵液粘稠硝酸钠不仅为菌体进行无氧呼吸合成聚-γ-谷氨酸提供条件，硝酸钠还做为一种电子受体，消耗还原力与2,3-丁二醇合成路径形成竞争关系，导致2,3-丁二醇的产率下降。故本发明中培养基各组分和各组分的添加量以及发酵条件的设置，均是通过平衡聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的产率而得到的最佳方案。本发明权利要求中限定的发酵参数虽然都在对比文件公开范围内，但是，对比文件1-4都为菌株发酵生产单一产物，与本发明并不相同，本领域技术人员不能从对比文件1-4中得到应用于本发明中的技术启示。因此，权利要求1-4具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月27日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）本申请利用芽孢杆菌发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇，并未取得突出的实质性特点和显著的进步。在对比文件1-2、3-4的基础上，为了得到更多的发酵产品，本领域技术人员有动机尝试在利用芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的同时，发酵生产2,3-丁二醇，并能够通过常规的实验手段加以验证，从而得到本申请相应的技术方案。而且，本申请利用芽孢杆菌发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇，两种产物的产量仍然处于本领域技术人员能够合理预期的范围之内。（2）2,3-丁二醇的生成有利于聚-γ-谷氨酸产量的增加，这一点在原始申请中没有记载，本领域技术人员也无法根据原始申请记载的内容通过合乎逻辑的推理判断得到；实施例1的培养基中的氮源仅为NH4Cl（8g/L），而实施例2-5的培养基中的氮源是在实施例1的基础上，还加入了NaNO3（10g/L），硝酸盐是一种常用的无机氮源，通过增加氮源以提高发酵产物的产量，是本领域技术人员可以合理预期的。复审请求人陈述的NaNO3的其它作用在原始申请中没有记载，本领域技术人员也无法根据原始申请记载的内容通过合乎逻辑的推理判断得到，且权利要求1概括的保护范围中包括不添加NaNO3的技术方案。因而坚持原驳回决定。
随后，专利复审委员会成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年4月10日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1公开的内容相比，其区别在于：①权利要求1的发酵菌种除地衣芽孢杆菌WX-02（保藏号为CCTCC NO：M208065）外还可以采用枯草芽孢杆菌X-003（保藏号为CCTCC NO：M202048）。②权利要求1的发酵产物除聚-γ-谷氨酸外还包括2,3-丁二醇。③生产过程中具体的条件参数有所不同，如固体培养基中琼脂的浓度、pH值、培养时间；发酵培养基中本申请添加硝酸钠，而对比文件1添加硝酸铵。基于上述区别技术特征，本发明实际解决的技术问题是：提供一种利用发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法。
对于上述区别特征①，对比文件3公开了一种利用枯草芽孢杆菌菌株X-003（保藏号CCTCC NO：M202048）生产聚-γ-谷氨酸的方法，包括“采用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌作为生产菌种”、“菌种活化”、“种子液培养”、“发酵罐发酵培养”，并公开了工序及其详细参数（参见说明书第4页第7段、实施例3），其整体步骤及参数均与对比文件1接近，本领域技术人员容易想到在用对比文件1相近的发酵步骤时，菌种除WX-02外，还可以选择X-003。
对于上述区别特征②，对比文件2公开了一种生产2,3-丁二醇的方法，其利用地衣芽孢杆菌在发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇，经检测可得到浓度为92g/L的2,3-丁二醇发酵液（参见实施例6），即对比文件2给出了“地衣芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示；对比文件4公开了一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，该枯草芽孢杆菌发酵72h后，发酵液中2,3-丁二醇含量为50g/L左右（参见实施例3），即对比文件4给出了“枯草芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示。为了得到更多的发酵产品，本领域技术人员有动机尝试在利用地衣芽孢杆菌WX-02或枯草芽孢杆菌菌株X-003发酵生产聚-γ-谷氨酸的同时，发酵生产2,3-丁二醇，并能够通过常规的实验手段加以验证。
对于上述区别特征③，本申请虽然添加的是硝酸钠，而对比文件1中添加的是硝酸铵，但硝酸钠在溶液中电离为硝酸根和钠离子，而对比文件1中除了硝酸钠之外，还有谷氨酸钠，二者也可以提供硝酸根和钠离子；其它参数，如菌种活化培养基中琼脂的比例、pH值、活化时间，菌种在种子液中扩大培养的时间，摇瓶发酵培养基中氮源的比例、高压灭菌的温度、接种量；发酵罐发酵培养时装液量、灭菌时间、培养时间、通气量等均属于本领域的常规技术手段，且权利要求限定1的上述参数均在常规范围内，且多数与对比文件1、对比文件2公开的参数相近或重叠。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2-4得出权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-4分别对权利要求1所述的发酵培养基中硝酸钠、谷氨酸钠、葡萄糖的浓度作了进一步限定。然而，对比文件1公开了摇瓶发酵培养基中硝酸铵15克（折合硝酸根离子0.1875mol/L）、谷氨酸钠60 g/L（折合钠离子0.3548mol/L，且谷氨酸钠量介于10-80g/L之间）、葡萄糖90克（介于70-170g/L之间）；发酵罐培养基中氯化铵2％、谷氨酸钠7％（介于10-80g/L之间）、葡萄糖7％（介于70-170g/L之间）。因此，本领域技术人员能够根据实际需要通过单因素分析等常规实验手段对发酵培养基中氮源的浓度进行适当地调整，属于本领域的常规技术手段，其技术效果可以预期。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-4请求保护的技术方案也不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
对于复审意见，合议组认为：（1）对比文件1和对比文件2公开的方案虽然使用不同菌株，但所用菌株均属于地衣芽孢杆菌，在对比文件1和对比文件2分别公开了可发酵产生聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的基础上，本领域技术人员容易想到在地衣芽孢杆菌发酵产物中检测聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的产量。同样，在对比文件3和对比文件4分别公开了枯草芽孢杆菌可发酵产生聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的基础上，本领域技术人员容易想到在枯草芽孢杆菌发酵产物中检测聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的产量。另外，对比文件1和对比文件3虽然涉及地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，但其培养基、发酵条件却非常接近，本领域技术人员基于上述对比文件，容易想到以对比文件1公开的培养基、发酵条件为基础，进行适当调整，使其适于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的发酵，并在产物中得到聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇。（2）复审请求人所述“2,3-丁二醇的生成可以消耗因生产聚-γ-谷氨酸积累的大量还原力，有利于聚-γ-谷氨酸产率增加”的内容在原始申请中没有记载，也并未提供任何证据证明上述技术信息，本领域技术人员也无法根据原始申请记载的内容以及本领域公知常识确定增加硝酸盐即可提高发酵产物的产量。复审请求人陈述的NaNO3的其它作用，既不属于本领域的公知常识，在原始申请中也没有记载，而且硝酸钠在溶液中以NO3-和Na 的形式存在，对比文件1中添加的硝酸铵和谷氨酸钠同样可提供NO3-和Na ，即给出了在发酵培养基中添加上述组分的技术启示。同时，本申请的培养基各组分的成分和添加量以及发酵条件的设置均与对比文件1、对比文件2的设置接近，无实质性的改进，也无证据表明其是通过平衡聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的产率而得到的最佳方案；虽然与对比文件3、对比文件4的发酵条件差别较大，但本申请的方法可视为是在对比文件1、对比文件2发酵产生聚-γ-谷氨酸的基础上得到副发酵产物2,3-丁二醇，而得到所述产物已在对比文件3、对比文件4中给出了启示。综上，复审请求人的意见不具备说服力。
复审请求人于2019年05月15日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1、3公开的地衣芽孢杆菌发酵生产聚-γ-谷氨酸的培养基组分以及发酵条件与对比文件2、4给出的地衣芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇的培养基组分以及发酵条件并不相同。故，虽然聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇都是芽孢杆菌的发酵产物，但积累不同发酵产物所需的培养条件不同，芽孢杆菌可以生产各种酶、抗生素、乙偶姻、2,3-丁二醇和聚-γ-谷氨酸，但并不意味着其可以同时发酵生产上述所有物质。本申请提出了聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇高效联产的方法，同时生产的聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇最高浓度分别可达52.2g/l和73.68g／1，葡萄糖表观转化率达83.9％，克服了现有技术偏见，具有显著的进步。（2）发酵过程中参数的设置对于发酵产物积累总量、细胞生物量、底物转化率和产物生成的速率均会产生一定的影响。对于生物发酵领域来说，培养基成分、发酵时间、发酵温度这些参数应该作为一个整体考虑，各参数之间相互影响，参数的微小变化都会使最后的发酵结果产生变化，且对于本领域技术人员来说是未知的。本申请记载“向发酵培养基中添加10g/l的硝酸钠，聚-γ-谷氨酸产量增加225％，聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇产量和增加28％”，“葡萄糖浓度增加为150g／l，使聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇总产量增加75％，葡萄糖表观转化率达83.9％”。综上所述，权利要求1具有创造性。在此基础上，权利要求2-4同样具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
决定的理由
1、关于审查文本
复审请求人在复审阶段未对申请文件进行修改，本复审通知书所依据的文本同驳回决定所针对的文本，即申请日提交的说明书摘要、说明书第1-75段、2017年09月18日提交的权利要求第1-4项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
根据该款的规定，如果权利要求的技术方案与最接近的现有技术存在区别技术特征，但现有技术中给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且引入该区别技术特征后的技术方案未取得预料不到的技术效果，则权利要求不具备创造性。
权利要求1请求保护一种利用芽孢杆菌发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法，并限定了其具体步骤。
对比文件1公开了一种利用地衣芽孢杆菌生产聚-γ-谷氨酸的方法，并具体公开了如下内容：采用地衣芽孢杆菌WX-02、保藏编号为CCTCC NO：M208065的菌株作为生产菌株（参见说明书第2页倒数第3段）。聚-γ-谷氨酸的发酵生产：a、用冷冻保藏的本发明菌种为原始菌种；b、斜面菌种活化。将冷冻保藏的菌种(本发明菌株WX-02)，接种到LB固体斜面(含蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、琼脂20克/升、pH6.5)，30℃-37℃培养30小时。c、种子液培养：将上述冷冻保藏的菌种子转接到LB固体培养基平板上，30℃-37℃培养24-36小时，使其活化；将活化的种子转接到三角瓶液体种子培养基中(蛋白胨10克/升、酵母浸出物5克/升、NaCl 10克/升、pH 7.0)，30℃-37℃，200rpm培养14-16小时至对数生长中期。d、摇瓶发酵培养或发酵罐发酵培养。摇瓶发酵培养：按照每1升培养基的加入量配置发酵培养基：谷氨酸钠60克；葡萄糖90克；硝酸铵15克；K2HPO4?3H2O 1.5克；MgSO4?7H2O 1.5克；FeCl3?6H2O 0.08克；CaCl2?2H2O 1.5克；MnSO4 0.1克；ZnSO4 1.5克，补充蒸馏水至1000mL，pH 7.5，配置210mL发酵液分装500mL三角瓶，每瓶装液量70mL，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，冷却至37℃按照4％的接种量接入种子液，摇床转速180rpm，发酵温度37℃，发酵至32小时结束发酵；发酵罐发酵培养：谷氨酸钠7％；葡萄糖7％；氯化铵2％；K2HPO4?3H2O 0.01％；MgSO4?7H2O 0.01％；FeCl3?6H2O 0.001％；CaCl2?2H2O 0.01％；MnSO4 0.001％；ZnSO4 0.01％，装液量1.5L/3L（即相当于50%）发酵罐，以121℃高压蒸汽灭菌维持30分钟，接入上述种子液，接种量3％，pH 7.0，通气量1∶1(v/v)，转速400rpm，温度37℃，发酵至36小时结束发酵。e、提取：将上述发酵液离心除去菌体、收集上清液，用95%的乙醇沉淀、回收聚-γ-谷氨酸（参见实施例7、实施例9、实施例4）。可见，对比文件1公开了利用地衣芽孢杆菌WX-02（保藏编号为CCTCC NO：M208065）发酵生产聚-γ-谷氨酸的方法，包括“采用冷冻保藏的地衣芽孢杆菌作为生产菌种”、“菌种活化”、“种子液培养”、“摇瓶发酵培养”或“发酵罐发酵培养”的生产工序及其详细参数。
权利要求1与对比文件1公开的内容相比，其区别在于：①权利要求1的发酵菌种除地衣芽孢杆菌WX-02（保藏号为CCTCC NO：M208065）外还可以采用枯草芽孢杆菌X-003（保藏号为CCTCC NO：M202048）。②权利要求1的发酵产物除聚-γ-谷氨酸外还包括2,3-丁二醇。③生产过程中具体的条件参数有所不同，如固体培养基中琼脂的浓度、pH值、培养时间；发酵培养基中本申请添加硝酸钠，而对比文件1添加硝酸铵。基于上述区别技术特征，本发明实际解决的技术问题是：提供一种利用发酵联产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的方法。
对于上述区别特征①，对比文件3公开了一种利用枯草芽孢杆菌菌株X-003（保藏号CCTCC NO：M202048）生产聚-γ-谷氨酸的方法，包括“采用冷冻保藏的枯草芽孢杆菌作为生产菌种”、“菌种活化”、“种子液培养”、“发酵罐发酵培养”，并公开了工序及其详细参数（参见说明书第4页第7段、实施例3），其整体步骤及参数均与对比文件1接近，本领域技术人员容易想到在用对比文件1相近的发酵步骤时，菌种除WX-02外，还可以选择X-003。
对于上述区别特征②，对比文件2公开了一种生产2,3-丁二醇的方法，其利用地衣芽孢杆菌在发酵罐中发酵生产2,3-丁二醇，经检测可得到浓度为92g/L的2,3-丁二醇发酵液（参见实施例6），即对比文件2给出了“地衣芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示；对比文件4公开了一株环境安全的以葡萄糖为底物发酵产2,3-丁二醇枯草芽孢杆菌的选育，该枯草芽孢杆菌发酵72h后，发酵液中2,3-丁二醇含量为50g/L左右（参见实施例3），即对比文件4给出了“枯草芽孢杆菌能够发酵生产2,3-丁二醇”的技术启示。为了得到更多的发酵产品，本领域技术人员有动机尝试在利用地衣芽孢杆菌WX-02或枯草芽孢杆菌菌株X-003发酵生产聚-γ-谷氨酸的同时，发酵生产2,3-丁二醇，并能够通过常规的实验手段加以验证。
对于上述区别特征③，本申请虽然添加的是硝酸钠，而对比文件1中添加的是硝酸铵，但硝酸钠在溶液中电离为硝酸根和钠离子，而对比文件1中除了硝酸钠之外，还有谷氨酸钠，二者也可以提供硝酸根和钠离子；其它参数，如菌种活化培养基中琼脂的比例、pH值、活化时间，菌种在种子液中扩大培养的时间，摇瓶发酵培养基中氮源的比例、高压灭菌的温度、接种量；发酵罐发酵培养时装液量、灭菌时间、培养时间、通气量等均属于本领域的常规技术手段，且权利要求1中限定的上述参数均在常规选择范围内，多数与对比文件1、对比文件2公开的参数相近或重叠。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2-4得出权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-4分别对权利要求1所述的发酵培养基中硝酸钠、谷氨酸钠、葡萄糖的浓度作了进一步限定。然而，对比文件1公开了摇瓶发酵培养基中硝酸铵15克（折合硝酸根离子0.1875mol/L）、谷氨酸钠60 g/L（折合钠离子0.3548mol/L，且谷氨酸钠量介于10-80g/L之间）、葡萄糖90克（介于70-170g/L之间）；发酵罐培养基中氯化铵2％、谷氨酸钠7％（介于10-80g/L之间）、葡萄糖7％（介于70-170g/L之间）。因此，本领域技术人员能够根据实际需要通过单因素分析等常规实验手段对发酵培养基中氮源的浓度进行适当地调整，属于本领域的常规技术手段，其技术效果可以预期。因此，在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2-4请求保护的技术方案也不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
3、关于复审请求人意见
合议组认为：（1）正如复审请求人所述，聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇都是芽孢杆菌的发酵产物，2,3-丁二醇为发酵生产聚-γ-谷氨酸过程中的代谢副产物。因此，本领域技术人员有动机在生产聚-γ-谷氨酸的过程中同时生产2,3-丁二醇。本申请是否具备创造性关键是看是否针对同时生产聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇在发酵条件、参数等方面作出了实质性的调整，以达到兼顾聚-γ-谷氨酸和2,3-丁二醇的目的并取得显著的进步。（2）在发酵条件以及参数设置方面，权利要求1对于菌种活化培养基中琼脂的比例、pH值、活化时间，菌种在种子液中扩大培养的时间，摇瓶发酵培养基中氮源的比例、高压灭菌的温度、接种量；发酵罐发酵培养时装液量、灭菌时间、培养时间、通气量均在常规范围内，且多数与对比文件1、对比文件2公开的参数相近或重叠。对于复审请求人强调的硝酸钠的含量，对比文件1公开了摇瓶发酵培养基中硝酸铵15克（折合硝酸根离子0.1875mol/L）、谷氨酸钠60 g/L（折合钠离子0.3548mol/L，且谷氨酸钠量介于10-80g/L之间），即对比文件1相当于已经在发酵培养基中添加硝酸钠；对于葡萄糖，对比文件2中也公开了发酵培养基中葡萄糖的浓度可达140克/升（参见对比文件2实施例4、实施例6）。复审请求人所提及的发酵产物的产量增加，均是与未添加硝酸钠或低浓度葡萄糖的发酵条件相比，不能说明相对于对比文件1-4具备创造性。而且，本申请权利要求中所限定的各成分的浓度均是比较宽泛的范围，硝酸钠浓度甚至可以为0，不能对应特定的发酵条件以及相应的产量。综上，权利要求1-4的方法仅仅是兼顾了对比文件1和对比文件2中公开的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的生产聚-γ-谷氨酸的发酵条件，在对比文件3和对比文件4已经公开了地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌还可以生产2,3-丁二醇的情况下，本领域技术人员容易将其作为副产物同时生产，本申请也无证据表明其具备突出的实质性特点并取得显著的进步，复审请求人的意见不具备说服力。
基于以上事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年12月19日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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