发明创造名称：抗体或抗体组合物的制备方法
外观设计名称：
决定号：182655
决定日：2019-07-01
委内编号：1F249467
优先权日：2012-11-05
申请（专利）号：201380057876.3
申请日：2013-11-01
复审请求人：全药工业株式会社
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：唐慧
合议组组长：刘俊香
参审员：王金凤
国际分类号：C07K16/28，C12P21/08，C12N1/15，C12N1/19，C12N1/21，C12N5/10，C12N15/09
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380057876.3，名称为“抗体或抗体组合物的制备方法”的发明专利申请。申请人为全药工业株式会社。本申请的申请日为2013年11月01日，优先权日为2012年11月05日，公开日为2015年07月22日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月04日以权利要求1-18不具备创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2015年05月05日本申请进入中国国家阶段时提交的原始国际申请中文译文的说明书摘要、说明书第1-352段（即第1-48页）、说明书附图图1-图34、说明书核苷酸和氨基酸序列表，2015年05月25日提交的摘要附图，2017年09月06日提交的权利要求书第1-18项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 含有至少两个不同Fab区的抗体；或含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同；的制备方法，所述方法包括：
i)在表达所述抗体的条件下，培养含有编码所述抗体的核酸的宿主细胞的步骤，和
ii)从宿主细胞培养物回收所述抗体的步骤，
其中，所述核酸编码至少一个含有半胱氨酸残基的区域，所述半胱氨酸残基在所述Fab区的轻链与重链之间形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链126位置、轻链116位置-重链127位置、轻链116位置-重链128位置、轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链126位置、轻链118位置-重链127位置、轻链118位置-重链128位置、轻链118位置-重链134位置、轻链118位置-重链141位置、轻链121位置-重链126位置、轻链121位置-重链128位置、轻链121位置-重链134位置、轻链121位置-重链141位置、轻链124位置-重链126位置、轻链124位置-重链127位置、轻链124位置-重链128位置、轻链124位置-重链134位置或轻链124位置-重链141位置，轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。
2. 如权利要求1所述的方法，其中，所述非天然二硫键和所述二硫键是CL区与CH1区之间的二硫键。
3. 抗体的制备方法，所述抗体含有第一Fab区和第二Fab区，其中，所述第一Fab区含有第一轻链和重链，所述第二Fab区含有分别 与所述第一轻链和重链不同的第二轻链和重链，所述方法包括：
a)将所述抗体的亲本抗体的第一Fab区的CL区和CH1区中的半胱氨酸以外的至少一个氨基酸残基取代为形成二硫键的半胱氨酸残基的步骤，和
b)通过形成所述二硫键的半胱氨酸残基，在第一Fab区中形成非天然二硫键的步骤，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述第一Fab区在与所述第二Fab区不同的位置形成二硫键，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链126位置、轻链116位置-重链127位置、轻链116位置-重链128位置、轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链126位置、轻链118位置-重链127位置、轻链118位置-重链128位置、轻链118位置-重链134位置、轻链118位置-重链141位置、轻链121位置-重链126位置、轻链121位置-重链128位置、轻链121位置-重链134位置、轻链121位置-重链141位置、轻链124位置-重链126位置、轻链124位置-重链127位置、轻链124位置-重链128位置、轻链124位置-重链134位置或轻链124位置-重链141位置，轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。
4. 含有至少两个不同Fab区的抗体，其中，至少一个Fab区含有在CL区与CH1区之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链126位置、轻链116位置-重链127位置、轻链116位置-重链128位置、轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链126位置、轻链118位置-重链127位置、轻链118 位置-重链128位置、轻链118位置-重链134位置、轻链118位置-重链141位置、轻链121位置-重链126位置、轻链121位置-重链128位置、轻链121位置-重链134位置、轻链121位置-重链141位置、轻链124位置-重链126位置、轻链124位置-重链127位置、轻链124位置-重链128位置、轻链124位置-重链134位置或轻链124位置-重链141位置，轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。
5. 如权利要求4所述的抗体，其含有两个不同Fab区。
6. 含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同，
其中，至少一个Fab区含有在轻链与重链之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链126位置、轻链116位置-重链127位置、轻链116位置-重链128位置、轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链126位置、轻链118位置-重链127位置、轻链118位置-重链128位置、轻链118位置-重链134位置、轻链118位置-重链141位置、轻链121位置-重链126位置、轻链121位置-重链128位置、轻链121位置-重链134位置、轻链121位置-重链141位置、轻链124位置-重链126位置、轻链124位置-重链127位置、轻链124位置-重链128位置、轻链124位置-重链134位置或轻链124位置-重链141位置，轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。
7. 如权利要求1至6中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中， 所述抗体为多特异性抗体。
8. 如权利要求7所述的方法、抗体或组合物，其中所述多特异性抗体为双特异性抗体。
9. 如权利要求1至8中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中，所述抗体是至少两个抗体片段通过接头连接或直接连接的抗体。
10. 如权利要求1至9中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中，所述抗体是抗体片段。
11. 如权利要求1至10中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中，所述抗体的Fc区被其它分子所取代。
12. 如权利要求1至11中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
13. 如权利要求12所述的方法、抗体或组合物，其中，通过在选自轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链121位置-重链126位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置和轻链162位置-重链173位置中的至少一组轻链-重链位置所引入的半胱氨酸残基，形成非天然二硫键。
14. 如权利要求12所述的方法、抗体或组合物，其中，通过在选自轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置和轻链162位置-重链173位置中的至少一组轻链-重链位置所引入的半胱氨酸残基，形成非天然二硫键。
15. 如权利要求12所述的方法、抗体或组合物，其中，通过在选自轻链为κ链时的轻链116位置-重链141位置、轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置，和轻链为λ链时的轻链162位置-重链171位置和轻链162位置-重链173位置中的至少一组轻链-重链位置所引入的半胱氨酸残基，形成非天然二硫键。
16. 如权利要求1至15中任一项所述的方法、抗体或组合物，其中，在至少一个Fab区的CL区与CH1区之间未形成天然二硫键。
17. 如权利要求16所述的方法、抗体或组合物，其中，一个Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置完全不同。
18. 如权利要求1或2所述的方法，其中，所述宿主细胞是真核细胞或大肠杆菌。”
驳回决定指出：对比文件1（CN102639561A，公开日：2012年08月15日）开了一种多价抗体（多价抗体融合蛋白），包含：重链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域（名称为VH1）、CH1 区和另外的可变结构域（名称为VH2），轻链，其在序列上从N端开始包含，可变结构域（名称为VL1）、CL结构域和可变结构域（名称为VL2），其中所述重链和轻链经匹配提供由VH1和VL1的第一可变结构域对形成的第一结合部位和由VH2和VL2的第二可变结构域对形成的第二结合部位，（从上述重链和轻链的组成可以判断，其包含了至少两个不同的Fab区）其中在形成结合部位的可变结构域对之间，例如在VH1与VL1之间和/或在VH2与VL2之间存在二硫键，并且所述融合蛋白缀合至PEG聚合物；并且在恒定区片段之间例如CH1与CL之间存在二硫键；包含CH1或CL的恒定区具有位于非天然存在的位置上的二硫键（即该非天然二硫键与至少一个其他Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键位置不同），其可通过在所需位置上将半胱氨酸引入氨基酸链来改造分子；该非天然二硫键是除了CH1与CL之间存在的天然二硫键以外的二硫键或为所述天然二硫键的替代。权利要求4要求保护的抗体与之相比，区别特征在于：对比文件1所述融合蛋白缀合至PEG聚合物，而权利要求4为无缀合的抗体；权利要求4进一步限定了Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键位置。基于该区别确定本申请实际解决的技术问题是提供一种无缀合PEG聚合物的抗体。但尽管对比文件1公开的是一种缀合至PEG聚合物的多价抗体融合蛋白，PEG聚合物的作用为延长抗体半衰期，但其仍然是一种可与抗原反应而显示与抗原的结合性的分子，因此本领域技术人员容易想到根据需要设计无缀合PEG聚合物的抗体，其技术效果是容易预期的。对于二硫键位置的限定，对比文件1已经公开了通过引入半胱氨酸残基来形成非天然二硫键的技术启示，且获得了与未突变抗体相当的抗原结合力，在此基础上，通过常规软件分析和多肽的高级结构模拟，获得所需的半胱氨酸引入位点是本领域技术人员容易完成的，且说明书中没有记载该方案获得了与现有技术相比预料不到的技术效果，因此权利要求4不具备创造性。从属权利要求5和6的附加技术特征或被对比文件1公开，或是本领域常规技术手段，因此权利要求5-6也不具备创造性。对于权利要求1要求保护的制备的方法，基于前述理由，其中的抗体或抗体组合物不具备创造性，且对比文件1进一步公开了用于生产根据所述融合蛋白分子的方法，包括在适于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体（和/或DNA）的宿主细胞，和分离所述抗体分子（即从宿主细胞培养物回收所述抗体），因此权利要求1也不具备创造性，从属权利要求2的附加技术特征已被对比文件1公开，因此权利要求2也不具备创造性。对于权利要求3要求保护的制备的方法，基于前述评述所述抗体或抗体组合物不具备创造性的理由，加之对比文件1进一步公开了权利要求中涉及的二硫键和半胱氨酸的替代方法，因此权利要求3也不具备创造性。从属权利要求7-18的附加技术特征或者被对比文件1公开或者是本领域常规技术手段，因此这些权利要求也不具备创造性。
申请人全药工业株式会社（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月19日向专利复审委员会提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共4页17项），相对于驳回决定针对的权利要求所做修改在于：删除权利要求1、3、4和6中部分引入半胱氨酸形成非天然二硫键的位置；删除原权利要求13；适应性修改其余权利要求的引用关系和编号。
复审请求人认为：权利要求4中记载了“由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置不同”。基于本申请说明书的记载，本领域技术人员能够理解，本申请涉及通过使轻链-重链（尤其CL区-CH1区）间的二硫键的位置在至少两个Fab区之间不完全一致来有效率地制备多特异性抗体的技术。而对比文件1则涉及通过使两个Fab区共有一个CH1-CL区来有效地制备双特异性抗体的技术。可变区之间的二硫键，无论是天然的还是非天然的，均是用于稳定已正确形成的双特异性抗体的结构，而在本申请中所引入的半胱氨酸是用于使轻链-重链间正确地配对。由于对比文件1中二硫键的作用不同于修改后的权利要求4中的二硫键的作用，对比文件1没有教导或启示权利要求4的技术方案，且无法预料仅仅通过引入非天然的二硫键使至少两个Fab区之间的二硫键不完全相同，轻链就能与其预期的重链正确地匹配，从而使得当存在多个轻链-重链组合时可有效率地制备正确的含轻链和重链的抗体。
提出复审请求时修改的权利要求1、3、4和6如下：
“1. 含有至少两个不同Fab区的抗体；或含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同；的制备方法，所述方法包括：
i)在表达所述抗体的条件下，培养含有编码所述抗体的核酸的宿主细胞的步骤，和
ii)从宿主细胞培养物回收所述抗体的步骤，
其中，所述核酸编码至少一个含有半胱氨酸残基的区域，所述半胱氨酸残基在所述Fab区的轻链与重链之间形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链121位置-重链126位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。”
“3. 抗体的制备方法，所述抗体含有第一Fab区和第二Fab区，其中，所述第一Fab区含有第一轻链和重链，所述第二Fab区含有分别与所述第一轻链和重链不同的第二轻链和重链，所述方法包括：
a)将所述抗体的亲本抗体的第一Fab区的CL区和CH1区中的半胱氨酸以外的至少一个氨基酸残基取代为形成二硫键的半胱氨酸残基的步骤，和
b)通过形成所述二硫键的半胱氨酸残基，在第一Fab区中形成非天然二硫键的步骤，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述第一Fab区在与所述第二Fab区不同的位置形成二硫键，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链121位置-重链126位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。
4. 含有至少两个不同Fab区的抗体，其中，至少一个Fab区含有在CL区与CH1区之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链134位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链121位置-重链126位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。”
“6. 含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同，
其中，至少一个Fab区含有在轻链与重链之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链116位置-重链134 位置、轻链116位置-重链141位置、轻链118位置-重链128位置、轻链121位置-重链126位置、轻链124位置-重链126位置、轻链162位置-重链170位置、轻链162位置-重链171位置，以及轻链162位置-重链173位置。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月26日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）修改后的权利要求4没有限定抗体的具体结构，与对比文件1的区别在于：二硫键位点的选择。但通过常规软件分析和多肽的高级结构模拟，获得所需的半胱氨酸引入位点是本领域技术人员容易完成的。（2）权利要求4的限定方式并不能说明在CH1和CL区引入非天然二硫键是为了解决抗体制备时的正确匹配问题，修改后的权利要求所确定的技术方案并不能解决制备抗体中的正确匹配问题。（3）对比文件1声称的稳定作用包含了在抗体制备时的正确匹配问题，本领域技术人员容易想到在多价抗体的轻、重链之间且在CH1和CL区引入非天然二硫键来解决抗体的匹配问题，本申请通过使轻链-重链（尤其CL区-CH1区）间的二硫键的位置在至少两个Fab区之间不完全一致来有效率地制备多特异性抗体的技术方案相对于对比文件1是显而易见的，因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月31日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求4要求保护的抗体与对比文件1公开的多价抗体融合蛋白的区别在于：对比文件1所述融合蛋白含有一种Fab区，而权利要求4限定的抗体含有至少两个不同的Fab；权利要求4具体限定了Fab区中的CL区与CH1区之间形成二硫键的半胱氨酸的对应位置，而对比文件1是在多价抗体的第二可变结构域通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，并限定了两个半胱氨酸残基的位置。由于本申请不能证明相对于对比文件1的多价抗体选择将非天然二硫键设置在CH1和CL区取得了更好的效果，因此基于区别特征确定权利要求1实际解决的技术问题仅是提供另一种提高具有不同Fab区的抗体组合（轻/重链）正确匹配的多价抗体。但是，多价或多特异性抗体/抗体结合片段（如Fab）是本领域的常规制备方案，对比文件1又给予了在CH1和CL区设置非天然二硫键的技术启示，至于具体位点的选择，本领域技术人员通过常规的计算机设计软件和有限的实验即可确定和验证，并不需要付出创造性的劳动。因此权利要求4要求保护的技术方案是显而易见的。此外，CH1区220位置的半胱氨酸与CL区214位置的半胱氨酸之间存在天然的二硫键，如果该天然二硫键依然存在的话，在不同的抗体片段组合时仍会出现不期望的抗体组合形式。本申请的突变抗体片段进行了C220S突变，破坏掉了该天然的二硫键配对，由此具有非天然二硫键的突变抗体才不会与野生型的抗体片段配对（参见附图9-11）进而形成需要的抗体组合形式，但权利要求4要求保护的技术方案仍然包含了该天然二硫键可正常配对的情形，相比于对比文件1的技术方案不能产生有益的技术效果。综上所述，权利要求4不具备创造性。基于同样的理由，权利要求5-6同样不具备创造性。在权利要求4-6不具备创造性的基础上，权利要求1-2要求保护的抗体制备方法也不具备创造性。权利要求3要求保护抗体的制备方法，其中所述的抗体形式是本领域的通常结构，对比文件1通过非天然二硫键解决了正确匹配的问题，并且也给予了在CH1和CL区设置非天然二硫键的技术启示，而具体位点通过常规的技术手段和有限的实验即可确定和验证，因此，权利要求3也不具有创造性。从属权利要求7-10、12、17的附加技术特征均被对比文件1公开；从属权利要求11的附加技术特征为本领域的常规技术手段，因此权利要求7-12、17也不具备创造性。基于权利要求12不具备创造性和本领域技术人员通过常规的技术手段来选择具体位点，且本申请也未证明附加技术特征限定的突变位点使得权利要求要求保护的技术方案能够具有预料不到的技术效果，因此权利要求13-14也不具备创造性。从属权利要求15-16的附加技术特征是通过合乎逻辑的分析、推理就容易确定的，因此权利要求15-16不具备创造性。
复审请求人于2019年03月14日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书全文替换页（共3页15项）。相对于复审通知书针对的权利要求所做修改在于：删除权利要求1、3、4、6中部分引入半胱氨酸形成非天然二硫键的位置，仅保留了轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置；删除权利要求13-14，调整其余权利要求的编号和引用关系。复审请求人认为：本申请图29和图30证明相对于未引入突变的野生型，轻链124位置-重链126位置形成非天然二硫键的Cyslm（f）和轻链162位置-重链170位置形成非天然二硫键的Cyslm（g）在双特异性抗体中可以显著降低错配，但又具有野生型的抗原结合活性（参见图31和图32）。权利要求4的二硫键位置限定在CL区与CH1区，不同于对比文件1的非天然二硫键选择在VL和VH之间，即使对比文件1暗示了非天然二硫键可以解决正确匹配的问题，确定在CL区与CH1区形成非天然二硫键是非显而易见的，也不能预期具体的位置组合是否可以降低错配而同时保持抗原活性。随答复意见提供的附件1中的实验数据表明，经人血浆处理后，双特异性抗体Cys1m（f）和Cys1m（f）比双特异性抗体Cys1m（d）（轻链121位置-重链126位置引入非天然二流键）具有更高的抗原结合能力。因此修改后的权利要求4具有创造性。同理，权利要求1、3和6也具有创造性。在引用的权利要求具创造性的情况下，权利要求2、5和7-15也具有创造性。
修改后的权利要求1、3、4、6如下：
“1. 含有至少两个不同Fab区的抗体；或含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同；的制备方法，所述方法包括：
i)在表达所述抗体的条件下，培养含有编码所述抗体的核酸的宿主细胞的步骤，和
ii)从宿主细胞培养物回收所述抗体的步骤，
其中，所述核酸编码至少一个含有半胱氨酸残基的区域，所述半胱氨酸残基在所述Fab区的轻链与重链之间形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置。
3. 抗体的制备方法，所述抗体含有第一Fab区和第二Fab区，其中，所述第一Fab区含有第一轻链和重链，所述第二Fab区含有分别与所述第一轻链和重链不同的第二轻链和重链，所述方法包括：
a)将所述抗体的亲本抗体的第一Fab区的CL区和CH1区中的半胱氨酸以外的至少一个氨基酸残基取代为形成二硫键的半胱氨酸残基的步骤，和
b)通过形成所述二硫键的半胱氨酸残基，在第一Fab区中形成非天然二硫键的步骤，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述第一Fab区在与所述第二Fab区不同的位置形成二硫键，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链 124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置。
4. 含有至少两个不同Fab区的抗体，其中，至少一个Fab区含有在CL区与CH1区之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置。
6. 含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同，
其中，至少一个Fab区含有在轻链与重链之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，
其中，由于所述非天然二硫键的存在，所述Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的轻链与重链之间的二硫键的位置不同，并且其中所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置。”
复审请求人提交的附件如下：
附件1：“测量人血浆处理的双特异性抗体的抗原结合能力”，中文，复印件共1页。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查的文本
复审阶段，复审请求人于2019年03月14日提交了权利要求书全文替换页（共3页15项）。经审查，所做修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此本复审请求审查决定针对的文本为：2015年05月05日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请中文译文的说明书摘要、说明书第1-352段（即第1-48页）、说明书附图图1-图34、说明书核苷酸和氨基酸序列表，2015年05月25日提交的摘要附图，2019年03月14日提交的权利要求第1-15项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
判断一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
具体到本申请，权利要求4要求保护含有至少两个不同Fab区的抗体，其中至少一个Fab区含有在CL区与CH1区之间形成非天然二硫键的半胱氨酸残基，从而形成非天然二硫键，该二硫键的位置与至少一个其它Fab区中的CL区与CH1区之间的二硫键的位置不同，所述非天然二硫键由在选自以下的至少一组轻链-重链位置引入的半胱氨酸残基形成：轻链124位置-重链126位置和轻链162位置-重链170位置。对比文件1作为最接近的现有技术，公开了一种多价抗体的融合蛋白，该蛋白包含：重链，其在序列上从N端开始包含名称为VH1可变结构域、CH1 区和名称为VH2的另外的可变结构域；轻链，其在序列上从N端开始包含名称为VL1的可变结构域、CL结构域和名称为VL2的可变结构域，其中所述重链和轻链经匹配提供由VH1和VL1的第一可变结构域对形成的第一结合部位和由VH2和VL2的第二可变结构域对形成的第二结合部位，其中在形成结合部位的可变结构域对之间，例如在VH1与VL1之间和/或在VH2与VL2之间存在二硫键，以及VL2与VH2之间形成二硫键时相应的半胱氨酸残基的位置。此外，在恒定区片段之间例如CH1与CL之间存在二硫键；包含CH1或CL的恒定区具有位于非天然存在的位置上的二硫键，其可通过在所需位置上将半胱氨酸引入氨基酸链来改造分子；该非天然二硫键是除了CH1与CL之间存在的天然二硫键以外的二硫键或为所述天然二硫键的替代（参见权利要求1-3、22；说明书第8-13、112、119段；实施例第425-440段）。权利要求4所要求保护的技术方案与对比文件1公开的技术内容相比，区别特征在于：对比文件1所述融合蛋白含有一种Fab区，而权利要求4限定的抗体含有至少两个不同的Fab；权利要求4具体限定了Fab区中的CL区与CH1区之间形成二硫键的半胱氨酸的对应位置，而对比文件1是在多价抗体的第二可变结构域通过两个半胱氨酸残基之间的二硫键连接，并限定了两个半胱氨酸残基的位置。根据本申请说明书的记载，本申请通过使用非天然二硫键来解决至少两种抗体间不同组合的效率（参见说明书第12段）。尽管对比文件1公开的多价抗体与权利要求4所述的抗体结构不同，且非天然二硫键位置选择在VL与VH之间（参见对比文件1附图1，权利要求22-23，说明书第0139-0147段），但其中通过非天然二硫键同样解决了正确匹配或匹配效率的问题。而相对于对比文件1的多价抗体，本申请并未证明选择将非天然二硫键设置在CH1和CL区取得了更好的效果。因此，本发明实际解决的技术问题仅是提供另一种提高具有不同Fab区的抗体组合（轻/重链）正确匹配的多价抗体。但首先，多价或多特异性抗体/抗体结合片段（如Fab）是本领域的常规制备方案。其次，对比文件1给出了通过非天然二硫键来解决正确匹配或匹配效率的启示，同时也公开了CH1或CL的恒定区具有非天然存在的二硫键，该非天然二硫键是除了CH1与CL之间存在的天然二硫键以外的二硫键，即对比文件1给予了在CH1和CL区设置非天然二硫键的技术启示（参见对比文件1的说明书第119段），而对于具体位点的选择，本领域技术人员通过常规的技术手段，如计算机设计软件等即可确定，并通过有限的实验进行验证，并不需要付出创造性的劳动。因此本领域技术人员在对比文件1的基础上，结合常规技术手段得到权利要求4要求保护的技术方案是显而易见的。此外，CH1区220位置的半胱氨酸与CL区214位置的半胱氨酸之间存在天然的二硫键，如果该天然二硫键依然存在的话，在不同的抗体片段组合时仍会出现不期望的抗体组合形式。根据本申请特别是实施例的记载，本申请的突变抗体片段均进行了C220S突变，即破坏掉了该天然的二硫键配对，由此具有非天然二硫键的突变抗体才不会与野生型的抗体片段配对（参见附图9-11）进而形成需要的抗体组合形式，但权利要求4要求保护的技术方案仍然包含了该天然二硫键可正常配对的情形，相比于对比文件1这样的技术方案不能产生有益的技术效果。综上所述，权利要求4不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。基于同样的理由，权利要求4的从属权利要求5，以及独立权利要求6要求保护的组合物同样不具备创造性。
权利要求1请求保护含有至少两个不同Fab区的抗体；或含有至少两种含Fab区的抗体的组合物，所述Fab区在至少两种抗体之间不同；的制备方法。基于上文描述，其中表征的抗体或抗体的组合物不具备创造性，结合对比文件1公开的用于生产融合蛋白分子的方法，其包括在适于导致从编码本发明的抗体分子的DNA表达蛋白质的条件下培养包含本发明的载体（和/或DNA）的宿主细胞，和分离所述抗体分子（即从宿主细胞培养物回收所述抗体）（参见说明书第8-13、112、119、376、381段）。因此权利要求1也不具备创造性。基于同样的理由，从属权利要求2也不具备创造性。
权利要求3要求保护抗体的制备方法，所述抗体含有第一Fab区和第二Fab区，其中，所述第一Fab区含有第一轻链和重链，所述第二Fab区含有分别与所述第一轻链和重链不同的第二轻链和重链。基于评述权利要求1、4类似的理由，尽管对比文件1公开的多价抗体与权利要求3所述的抗体结构不同，但权利要求3所述的抗体形式是本领域的通常结构，对比文件1通过非天然二硫键解决了正确匹配的问题，并且也给予了在CH1和CL区设置非天然二硫键的技术启示，而对于具体位点的选择，本领域技术人员通过常规的技术手段，如计算机设计软件等即可确定，并通过有限的实验进行验证，并不需要付出创造性的劳动。就最终的组合效果（或者说生产和纯化效率）而言，本申请并未证明权利要求3要求保护的技术方案具有何种预料不到的技术效果。其次，权利要求3要求保护的技术方案仍然包含了原天然二硫键可正常配对的情形，因此不能产生有益的技术效果，权利要求3不具有突出的实质性特点和显著进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求7-10、12、15分别进一步限定的附加技术特征：所述抗体为多特异性抗体、双特异性抗体、抗体片段通过接头或直接连接、抗体是抗体片段，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体，宿主细胞时真核细胞或大肠杆菌；这些特征均被对比文件1公开（参见说明书第24、47、81、120、333、339、375段）；从属权利要求11的附加技术特征，即所述抗体的Fc区被其它分子所取代，为本领域的常规技术手段，因此在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求7-12、15也不具备创造性。
从属权利要求13-14的附加技术特征进一步限定了不同的Fab区的CL区与CH1区之间天然或非天然二硫键的设计，但所述附加技术特征是本领域技术人员为解决技术问题可以通过合乎逻辑的分析、推理容易确定的。因此，在引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求13-14也不符合专利法第22条第3款的规定。
对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见，合议组认为：尽管本申请图29、30证明相对于野生型的双特异性抗体组合，在权利要求所限定的位置引入非天然二硫键的双特异性抗体能减少错配，但是不能证明相对于对比文件1公开的减少错配的技术方案，将非天然二硫键设置在CH1和CL区取得了更好的效果。因此，本发明实际解决的技术问题仅是提供另一种提高具有不同Fab区的抗体组合（轻/重链）正确匹配的多价抗体。而对比文件1在公开引入非天然二硫键以解决抗体错配问题的同时也公开了CH1或CL的恒定区具有非天然存在的二硫键，该非天然二硫键是除了CH1与CL之间存在的天然二硫键以外的二硫键。本领域技术人员为了解决上述实际解决的技术问题，有动机在CH1与CL区之间引入半胱氨酸，具体引入位点是本领域技术人员通过常规的预测和分析手段和有限的实验即可确定的，并不需要付出创造性的劳动。至于最终的抗原结合能力，本领域技术人员同样可以通过常规检测手段进行验证。此外，复审通知书中曾指出，“CH1区220位置的半胱氨酸与CL区214位置的半胱氨酸之间存在天然的二硫键，如果该天然二硫键依然存在的话，在不同的抗体片段组合时仍会出现不期望的抗体组合形式。根据本申请特别是实施例的记载，本申请的突变抗体片段均进行了C220S突变，即破坏掉了该天然的二硫键配对，由此具有非天然二硫键的突变抗体才不会与野生型的抗体片段配对（参见附图9-11）进而形成需要的抗体组合形式，但权利要求4要求保护的技术方案仍然包含了该天然二硫键可正常配对的情形，相比于对比文件1这样的技术方案不能产生有益的技术效果”，对此复审请求人未予以答复，修改后的权利要求4仍包括了上述不能产生有益效果的技术方案，依旧不符合有关创造性的规定。附件1提供的血浆处理的实验数据不能克服上文提出的存在天然二硫键带来的错配缺陷，因此不能证明本申请的创造性。此外，虽然该实验证明了不同位置引入非天然二流键对抗原结合能力会有不同影响，但是如前文所述，在对比文件1给予了在CH1或CL的恒定区具有非天然存在的二硫键的启示下，本领域技术人员通过常规的抗体分析和预测软件可以设计合适的半胱氨酸引入位点，并通过有限的实验验证抗体的降低错配的效果和抗原结合能力，进行这些实验并不需要付出创造性的劳动。综上所述，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月04日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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