发明创造名称：来自红花烟草的异丙基苹果酸合酶及其方法和用途
外观设计名称：
决定号：182299
决定日：2019-06-28
委内编号：1F240928
优先权日：2011-09-02
申请（专利）号：201280053787.7
申请日：2012-08-31
复审请求人：菲利普莫里斯产品有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李娟娟
合议组组长：彭郁葱
参审员：张丽颖
国际分类号：C12N9/10，C12N15/82，A01H5/12
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：判断发明是否具有突出的实质性特点，需要确定现有技术整体上是否存在使所属领域的技术人员在面对发明实际解决的技术问题时，有动机改进最接近的现有技术并获得要求保护的技术方案的技术启示，如果现有技术中不存在这种技术启示，则发明是非显而易见的，具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201280053787.7，名称为“来自红花烟草的异丙基苹果酸合酶及其方法和用途”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为菲利普莫里斯产品有限公司，申请日为2012年08月31日，优先权日为2011年09月02日，公开日为2014年07月30日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月06日以权利要求1-19不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由，驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年04月30日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要，摘要附图，说明书第1-2、4-15、17-24、26-77页，说明书附图第1-7页；依据专利合作条约第28条或者第41条提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-31页；2014年05月29日提交的说明书第3、16、25页；2016年06月30日提交的权利要求第1-19项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于在植物的至少部分中调节蔗糖酯的量或类型的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)调节异丙基苹果酸合酶在植物中的表达或活性，其中所述异丙基苹果酸合酶含有多核苷酸，所述多核苷酸由编码异丙基苹果酸合酶的序列所组成，并且所述异丙基苹果酸合酶如SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:14所示；或者由所述多核苷酸编码的多肽所编码；或者其中异丙基苹果酸合酶由SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15所示的多肽所编码；以及
(ii)鉴定突变、非天然存在的或转基因植物，其中所述植物中的一种或更多种蔗糖酯的量或类型与对照植物相比已经改变，所述对照植物中异丙基苹果酸合酶的表达或活性未得到调节，以及其中所述突变、非天然存在的或转基因植物的视觉外观与对照植物基本相同。
2. 根据权利要求1所述的方法，还包括在获自步骤(i)的突变、非天然存在的或转基因植物的至少部分中测量一种或更多种蔗糖酯的量或确定其类型。
3. 一种烟草制品，其包含：
(a)突变、非天然存在的或转基因植物细胞，其包含：
(i)至少一种多核苷酸，所述多核苷酸由编码异丙基苹果酸合酶的序列组成，并且所述异丙基苹果酸合酶如SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:14所示；或者
(ii)由所述多核苷酸编码的多肽；或者
(iii)SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15所示的多肽；或者
(iv)含有所述多核苷酸序列的构建体、载体或表达载体；或者
(b)通过权利要求1或2的所述方法获得的或可获得的突变、非天然存在的或转基因植物的部分；
(c)突变、非天然存在的或转基因烟草植物的部分，其中异丙基苹果酸合酶的表达或者由其所编码的蛋白的活性是得到调节的，以及所述烟草植物的至少部分在一种或更多种蔗糖酯的组合物上与对照烟草植物相比具有改变，所述对照烟草植物中异丙基苹果酸合酶的表达或活性未得到调节，以及其中所述烟草植物的视觉外观与对照烟草植物基本相同；
(d)植物材料，所述植物材料包含生物质、种子或叶，所述生物质、种子或叶含有来自(b)或(c)的植物的部分的细胞或组织。
4. 根据权利要求3所述的烟草制品，其中所述构建体、载体或表达载体还含有启动子，所述启动子由SEQ ID NO:8所示的序列、或毛状体启动子、或天然存在的异丙基苹果酸合酶启动子组成。
5. 一种用于产生含有一种或更多种蔗糖酯的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供权利要求3或4所限定的突变、非天然存在的或转基因植物的至少部分、植物材料、或者烟草制品；以及
(ii)从其中提取蔗糖酯。
6. 根据权利要求5所述的方法，还包括分离或纯化提取出的蔗糖酯。
7. 根据权利要求1、2、5或6任一项所述的方法，其中蔗糖酯的一种或更多种具有下式所示的结构：
并且其中R3是乙酰基或氢；R1、R2和R4中的一个或更多含有6碳的酰基链；以及R5是乙酰基或氢。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，
R3是乙酰基；和/或
R1、R2和R4中的一个或更多含有β-甲基戊酰基；和/或
R5是氢。
9. 根据权利要求3或4所述的烟草制品，其中蔗糖酯的一种或更多种具有下式所示的结构：
并且其中R3是乙酰基或氢；R1、R2和R4中的一个或更多含有6碳的酰基链；以及R5是乙酰基或氢。
10. 根据权利要求9所述的烟草制品，其中，
R3是乙酰基；和/或
R1、R2和R4中的一个或更多含有β-甲基戊酰基；和/或
R5是氢。
11. 一种用于调节烟草或烟草制品风味的方法，所述方法包括：
(i)将来自权利要求3或4所限定的突变、非天然存在的或转基因植物的植物的部分，或者植物材料加入至烟草或烟草制品中；或者
(ii)将含有通过权利要求5至8任一项所述的方法所获得的或可获得的蔗糖酯的组合物加入至烟草或烟草制品中。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述植物的部分包含叶。
13. 一种用于产生β-甲基戊酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供权利要求3或4所限定的突变、非天然存在的或转基因植物的至少部分、或者植物材料、或者烟草制品；以及
(ii)水解在步骤(i)中提供的材料或其提取物。
14. 根据权利要求13所述的方法，还包括分离或纯化β-甲基戊酸。
15. 一种分离的多核苷酸，其由编码异丙基苹果酸合酶的序列所组成，并且所述异丙基苹果酸合酶如SEQ ID NO:1、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:14所示。
16. 一种分离的多肽，其由权利要求15所示的多核苷酸所编码。
17. 一种分离的多肽，其如SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15所示。
18. 一种构建体、载体或表达载体，其含有权利要求15所述的分离的多核苷酸。
19. 根据权利要求18所述的构建体、载体或表达载体，其中所述构建体、载体或表达载体额外含有启动子，所述启动子由SEQ ID NO:9所示的序列、或毛状体启动子、或天然异丙基苹果酸合酶启动子所组成。”
驳回决定指出：权利要求1要求保护一种用于在植物的至少部分中调节蔗糖酯的量或类型的方法，权利要求1与对比文件2（“Pathways For Synthesis，and Possibilities for Genetic Modifications of Sugar Ester Acyl Groups Produced by Trichomes of Solanaceous Species”，Antoaneta B.Kroumova 等，《General and Applied Plant Physiology》，第35卷第3-4期，第95-110页，公开日：2009年12月31日）的区别在于：二者的核苷酸或多肽的序列不同；转基因植物的表型不同。在对比文件2公开的编码IPMSa和IPMSb的核苷酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到利用常规技术手段从与番茄相近的其他植物，例如同属茄科的烟草中克隆得到同源性基因及其编码的蛋白质，并用于调节蔗糖酯的量。而本申请说明书既未对其所述的“视觉外观与对照植物基本相同”作进一步的解释，也未记载有关保持转基因植物表型基本不变的试验和数据，即本申请实际并未解决上述问题。因此，权利要求1不具备创造性。为了确定基因的功能，本领域技术人员容易想到测量突变、非天然存在的或转基因植物的蔗糖酯的量。因此，权利要求2也不具备创造性。对比文件2公开了与SEQ ID NO：1分别具有77%和78%的同源性的来自番茄的编码IPMSa和IPMSb的核苷酸序列，本领域技术人员容易想到利用常规技术手段从与番茄相近的其他植物，例如同属茄科的烟草中克隆得到同源性基因及其编码的蛋白质，用于调节烟草中蔗糖酯的量，并制备烟草制品。因此，权利要求3也不具备创造性。为了取得较高的表达量或进行特异性表达，本领域技术人员容易想到将适合的常用启动子用于表达载体的构建中。因此，权利要求4也不具备创造性。为了获得蔗糖酯产品，本领域技术人员容易想到从突变、非天然存在的或转基因植物中提取蔗糖酯，并进行分离纯化。因此，权利要求5、6也不具备创造性。对比文件2公开了所述蔗糖酯包括3-甲基戊酸，即β-甲基戊酸。因此，权利要求7-10不具备创造性。为了调节烟草或烟草制品的风味，本领域技术人员容易想到将突变、非天然存在的或转基因植物的部分，例如叶片，用于制备烟草或烟草制品。因此，权利要求11、12也不具备创造性。对比文件2公开了所述转基因植物相比对照的β-甲基戊酸产量有所增加，本领域技术人员容易想到从其他植物中克隆得到同样基因并用于生产β-甲基戊酸，并进行分离纯化。因此，权利要求13、14也不具备创造性。对比文件2公开了与SEQ ID NO：1分别具有77%和78%的同源性的来自番茄的编码IPMSa和IPMSb的核苷酸序列，本领域技术人员容易想到利用常规技术手段从与番茄相近的其他植物，例如同属茄科的烟草中克隆得到同源性基因及其编码的蛋白质。因此，权利要求15-17也不具备创造性。仅仅出于对基因研究的目的，本领域技术人员容易想到利用所述基因构建载体或表达载体。因此，权利要求18也不具备创造性。为了取得较高的表达量或进行特异性表达，本领域技术人员容易想到将适合的常用启动子用于表达载体的固件中。因此，权利要求19也不具备创造性。
申请人菲利普莫里斯产品有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月21日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共4页14项），相对于驳回决定针对的权利要求，修改之处在于：将权利要求1、2、3、5、11、13的植物限定为烟草植物；将权利要求1中调节酶在植物中的表达或活性改为提高酶基因在植物中的表达或活性，调整有关多核苷酸限定语句的表述方式；将权利要求3所述的“突变”修改为“包含构建体、载体或表达载体的突变植物细胞”，限定多核苷酸与毛状体特异性启动子可操作性连接，调整部分语句的表述方式；将权利要求4启动子限定为SEQ ID NO:8所示的序列；将权利要求7、9所述的“R1、R2和R4中的一个或更多含有6碳的酰基链”修改为“R1、R2和R4中的一个或更多个包含具有6个碳的酰基链”；将权利要求8“ Rl、R2和R4中的一个或更多含有p-甲基戊酰基”修改为“Rl、R2和R4中的一个或更多个含有β-甲基戊酰基”；将权利要求11中所述“可”修改为“能够”；删除权利要求15-19。复审请求人认为：（1）权利要求1使用毛状体特异性启动子在毛状体中特异性表达异丙基苹果酸合酶，而对比文件2是对该基因进行RNA干扰，且产生了叶黄病、叶片卷曲的症状，因此，本领域技术人员不可能在以叶作为其主要经济价值的烟草中尝试对比文件2所公开的方法。（2）本申请的发明人出乎意料地发现，通过在烟草植物中以毛状体特异性的方式表达SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 15所示序列的异丙基苹果酸合酶，可以实现烟草植物中蔗糖酯C2C 16:0, C2C17:0和C2C 18:0的高度积累，与之相比，通过组成型的方式表达异丙基苹果酸合酶并不能导致这些酯的高度积累。（3）如本申请的说明书第4页第4段所记载的，通过本申请的方法获得的烟草植物的视觉外观与对照烟草植物基本相同，本申请的通篇说明书中均教导了本发明制备的烟草植物的视觉外观没有变化，虽然说明书实施例部分没有通过数据来展示植物的视觉外观如何没有变化，但是，实际上说明书记载的“视觉外观没有变化”本身就是一种试验结果，正是因为植物的视觉外观没有发生变化，所以没有关于视觉外观变化的数据。本领域技术人员完全清楚视觉外观没有变化的含义是什么，无需在实施例中列举数据。提出复审请求时新修改的权利要求书如下：
“1. 一种用于在烟草植物的至少部分中调节蔗糖酯的量或类型的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提高异丙基苹果酸合酶基因在所述植物中的表达或活性，其中所述异丙基苹果酸合酶基因在重组构建体中与毛状体特异性启动子可操作连接，所述异丙基苹果酸合酶基因含有下述多核苷酸，所述多核苷酸由如SEQ ID NO:l、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:14所示的序列所组成；或者编码由所述多核苷酸编码的多肽；或者其中异丙基苹果酸合酶基因编码由SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15所示的多肽；以及
(ii)鉴定突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物，其中所述烟草植物中的一种或更多种蔗糖酯的量或类型与对照植物相比己经改变，所述对照植物中异丙基苹果酸合酶基因的表达或活性未得到调节，以及其中所述突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的视觉外观与对照植物基本相同。
2. 根据权利要求1所述的方法，还包括在获自步骤(i)的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的至少部分中测量一种或更多种蔗糖酯的量或确定其类型。
3. 一种烟草制品，其包含：
(a)包含构建体、载体或表达载体的突变植物细胞、非天然存在的植物细胞或转基因的植物细胞，其中所述构建体、载体或表达载体包含：
(i)与毛状体特异性启动子可操作性连接的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码异丙基苹果酸合酶、由如SEQ ID NO:l、或SEQ ID NO:10、或SEQ ID NO:12、或SEQ ID NO:14所示的序列组成；或者
(ii)由(i)所述多核苷酸编码的多肽；或者
(iii)与毛状体特异性启动子可操作性连接的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸由编码SEQ ID NO:2、或SEQ ID NO:11、或SEQ ID NO:13、或SEQ ID NO:15所示的多肽的序列组成；
(b)通过权利要求1或2的所述方法获得的或能够获得的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的部分；
(c)突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的部分，其中异丙基苹果酸合酶基因的表达或者由其所编码的蛋白的活性是得到提高的，以及所述烟草植物的至少部分在一种或更多种蔗糖酯的组成上与对照烟草植物相比具有改变，所述对照烟草植物中异丙基苹果酸合酶的表达或活性未得到调节，以及其中所述烟草植物的视觉外观与对照烟草植物基本相同；
(d)植物材料，所述植物材料包含生物质、种子或叶，所述生物质、种子或叶含有来自(b)或(c)的植物的部分的细胞或组织。
4. 根据权利要求3所述的烟草制品，其中所述构建体、载体或表达载体还含有由SEQ ID NO:8所示的序列组成的启动子。
5. 一种用于产生含有一种或更多种蔗糖酯的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供权利要求3或4所限定的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的至少部分、植物材料、或者烟草制品；以及
(ii)从其中提取蔗糖酯。
6. 根据权利要求5所述的方法，还包括分离或纯化提取出的蔗糖酯。
7. 根据权利要求1、2、5或6任一项所述的方法，其中蔗糖酯的一种或更多种具有下式所示的结构：
并且其中R3是乙酰基或氢；R1、R2和R4中的一个或更多个包含具有6个碳的酰基链；以及R5是乙酰基或氢。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中，
R3是乙酰基；和/或
Rl、R2和R4中的一个或更多个含有β-甲基戊酰基；和/或
R5是氢。
9. 根据权利要求3或4所述的烟草制品，其中蔗糖酯的一种或更多种具有下式所示的结构：
并且其中R3是乙酰基或氢；R1、R2和R4中的一个或更多个包含具有6个碳的酰基链；以及R5是乙酰基或氢。
10. 根据权利要求9所述的烟草制品，其中，
R3是乙酰基；和/或
Rl、R2和R4中的一个或更多个含有β-甲基戊酰基；和/或
R5是氢。
11. 一种用于调节烟草或烟草制品风味的方法，所述方法包括：
(i)将来自权利要求3或4所限定的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的植物部分，或者烟草植物材料加入至烟草或烟草制品中；或者
(ii)将含有通过权利要求5至8任一项所述的方法所获得的或能够获得的蔗糖酯的组合物加入至烟草或烟草制品中。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述植物的部分包含叶。
13. 一种用于产生β-甲基戊酸的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供权利要求3或4所限定的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的至少部分、或者植物材料、或者烟草制品；以及
(ii)水解在步骤(i)中提供的材料或其提取物。
14. 根据权利要求13所述的方法，还包括分离或纯化β-甲基戊酸。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月08日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：本申请说明书并未记载有关视觉外观是否发生变化的相关实验证据，不足以说明技术方案的意外效果。且对比文件公开了通过调节IMPS基因的表达来调控蔗糖酯的产量，本申请所采用的也是类似的技术方案，解决了相同的技术问题，区别在于IPMS基因的来源和具体序列不同。而且，本申请实施例仅验证了序列1是蔗糖酯合成的关键酶，对其他三种序列并没有进行试验验证，也没有记载其是否能够影响烟草的视觉外观，不能认定其具备创造性。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年11月05日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件2的区别在于：权利要求1限定（1）提高异丙基苹果酸合酶的表达或活性，对比文件2为降低其表达，并且异丙基苹果酸合酶基因及多肽的序列不同；（2）使用毛状体特异性启动子来启动异丙基苹果酸合酶基因表达；（3）所述突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的视觉外观与对照植物基本相同。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1技术方案所要解决的技术问题是：提供另一种调节烟草中蔗糖酯含量或类型的方法。针对区别技术特征（1），由对比文件2可知，异丙基苹果酸合酶是烟草蔗糖酯合成以及碳延伸中一种重要的酶，其表达量的改变会影响相应蔗糖酯的形成和含量，在对比文件2的综合教导下，本领域技术人员有动机采用过表达或抑制表达两种手段来验证异丙基苹果酸合酶对蔗糖酯的影响；权利要求1所述的异丙基苹果酸合酶基因及其多肽序列均为本领域的常规选择。针对区别技术特征（2），对比文件2公开了糖酯是茄科中常见的毛状体产物，可见，糖酯合成具有组织特异性，因此，当在烟草中研究过表达异丙基苹果酸合酶基因对糖酯合成的影响时，选择毛状体特异性启动子来提高该基因在毛状体中的表达量属于本领域的常规选择。针对区别技术特征（3），在对植物进行过表达转基因培育时，从中选择所期望的表型属于本领域的常规操作。且本申请在说明书中仅笼统记载了本申请的方法获得的烟草植物的视觉外观与对照烟草基本相同，基于本申请的记载，本领域技术人员无法确定权利要求1所涵盖的技术方案均能够实现“视觉外观与对照烟草基本相同”这一效果。因此，权利要求1不具备创造性。同理，权利要求2也不具备创造性。权利要求3、5、11、13与对比文件2的区别技术特征以及权利要求4、6-10、12、14的附加技术特征均属于本领域的常规技术或已经被对比文件2公开。因此，权利要求3-14也不具备创造性。
复审请求人于2019年02月15日提交了意见陈述书，并提交了权利要求书的全文替换页（共4页14项），相对于复审通知书所针对的权利要求，修改之处在于：删除权利要求1、3中有关SEQ ID NO:10、12、14以及SEQ ID NO:11、13、15的技术方案。复审请求人认为：（1）对比文件2公开了对异丙基苹果酸合酶基因进行抑制，由此，没有动机在烟草中对该基因进行过表达；（2）对比文件2没有教导使用毛状体特异性启动子，本领域技术人员也没有动机使用该启动子来过表达异丙基苹果酸合酶基因；（3）说明书记载了调节来自红花烟草的异丙基苹果酸合酶基因的活性和表达，对所述植物的整体代谢具有更少的不期望作用，这些作用主要集中在植物的毛状体和次级代谢上，因此不会导致相应植物的视觉外观改变，根据说明书的明显教导，权利要求1的技术方案实现了上述技术效果。
修改后的权利要求1、3如下：
“1. 一种用于在烟草植物的至少部分中调节蔗糖酯的量或类型的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提高异丙基苹果酸合酶基因在所述植物中的表达或活性，其中所述异丙基苹果酸合酶基因在重组构建体中与毛状体特异性启动子可操作连接，所述异丙基苹果酸合酶基因含有下述多核苷酸，所述多核苷酸由如SEQ ID NO:l所示的序列所组成；或者编码由所述多核苷酸编码的多肽；或者其中异丙基苹果酸合酶基因编码由SEQ ID NO:2所示的多肽；以及
(ii)鉴定突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物，其中所述烟草植物中的一种或更多种蔗糖酯的量或类型与对照植物相比己经改变，所述对照植物中异丙基苹果酸合酶基因的表达或活性未得到调节，以及其中所述突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的视觉外观与对照植物基本相同。”
“ 3. 一种烟草制品，其包含：
(a)包含构建体、载体或表达载体的突变植物细胞、非天然存在的植物细胞或转基因的植物细胞，其中所述构建体、载体或表达载体包含：
(i)与毛状体特异性启动子可操作性连接的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸编码异丙基苹果酸合酶、由如SEQ ID NO:l所示的序列组成；或者
(ii)由(i)所述多核苷酸编码的多肽；或者
(iii)与毛状体特异性启动子可操作性连接的至少一种多核苷酸，所述多核苷酸由编码SEQ ID NO:2所示的多肽的序列组成；
(b)通过权利要求1或2的所述方法获得的或能够获得的突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的部分；
(c)突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的部分，其中异丙基苹果酸合酶基因的表达或者由其所编码的蛋白的活性是得到提高的，以及所述烟草植物的至少部分在一种或更多种蔗糖酯的组成上与对照烟草植物相比具有改变，所述对照烟草植物中异丙基苹果酸合酶的表达或活性未得到调节，以及其中所述烟草植物的视觉外观与对照烟草植物基本相同；
(d)植物材料，所述植物材料包含生物质、种子或叶，所述生物质、种子或叶含有来自(b)或(c)的植物的部分的细胞或组织。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在答复复审通知书时，提交了权利要求书全文替换页(共4页14项)。经审查，其修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审决定所针对的文本为：2014年04月30日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要，摘要附图，说明书第1-2、4-15、17-24、26-77页，说明书附图第1-7页；依据专利合作条约第28条或者第41条提交的说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-31页；2014年05月29日提交的说明书第3、16、25页；2019年02月15日提交的权利要求第1-14项。
有关专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明有突出的实质性特点和显著的进步。
判断发明是否具有突出的实质性特点，需要确定现有技术整体上是否存在使所属领域的技术人员在面对发明实际解决的技术问题时，有动机改进最接近的现有技术并获得要求保护的技术方案的技术启示，如果现有技术中不存在这种技术启示，则发明是非显而易见的，具有突出的实质性特点。
本案中，权利要求1请求保护“一种用于在烟草植物的至少部分中调节蔗糖酯的量或类型的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提高异丙基苹果酸合酶基因在所述植物中的表达或活性，其中所述异丙基苹果酸合酶基因在重组构建体中与毛状体特异性启动子可操作连接，所述异丙基苹果酸合酶基因含有下述多核苷酸，所述多核苷酸由如SEQ ID NO:l所示的序列所组成；或者编码由所述多核苷酸编码的多肽；或者其中异丙基苹果酸合酶基因编码由SEQ ID NO:2所示的多肽；以及
(ii)鉴定突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物，其中所述烟草植物中的一种或更多种蔗糖酯的量或类型与对照植物相比己经改变，所述对照植物中异丙基苹果酸合酶基因的表达或活性未得到调节，以及其中所述突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的视觉外观与对照植物基本相同。”
本申请实施例记载了在K326烤烟品种中，使用毛状体特异性启动子和病毒启动子过表达SEQ ID NO:1所示的异丙基苹果酸合酶基因，发现毛状体特异性启动子相对于病毒启动子，能够明显提高C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的含量，K326烤烟品种对照组的C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的含量几乎为零（参见实施例4、图4）。
对比文件2公开了对茄科植物毛状体产生的糖酯酰基合成途径进行了研究，并具体公开了糖酯是茄科中常见的毛状体产物，它们的丰度在不同烟草中的差异很大，糖酯是由葡萄糖或蔗糖酯化产生；茄科包括烟草、番茄等，都合成糖酯。为了研究糖酯合成的相关因子及通路，该研究针对潘那利番茄来源的异丙基苹果酸合酶基因IPMSa以及IPMSb的序列，设计干扰RNA载体，通过该干扰RNA来调节红花烟草T.I.1068、粘毛烟草cv24中相关基因的表达，通过检测发现在红花烟草中，糖酯中的相对酰基丰度发生改变，2-甲基丁酰的含量升高，3-甲基戊酰的含量降低，同时发现出现萎黄病，一些植株出现卷曲叶，但生育能力正常；褪绿表型可能是光合蛋白合成受到干扰或光合基因非特异性敲除的结果；粘毛烟草中糖酯酰基的丰度也发生了改变，5-甲基己酸（5-MeHexanoate）含量降低，同时20%的再生体出现异常的叶片形态。异丙基苹果酸合酶是一种关键酶，其损害可能会导致不健康的植物（参见对比文件2摘要，第96页左栏第15-18行以及右栏第1-5行，第103页右栏最后1段至第105页最后1段，第106页左栏第1段及右栏第38-41行，表3）。由于糖酯酰基含量的变化直接体现了相关糖酯含量的改变，因此，对比文件2实质上已经公开了一种通过改变异丙基苹果酸合酶基因表达在红花烟草以及粘毛烟草中调节包含蔗糖酯在内的糖酯含量的方法。对比文件2还公开了在烟草中糖酯酰基通过αKAE途径实现碳延伸，2-异丙基苹果酸合酶参与α-酮延伸的催化反应（参见第96页右栏第30-33行，第101页左栏第24-27行，图1-2）。
权利要求1所请求保护的技术方案与对比文件2公开的内容相比，区别技术特征在于：权利要求1限定（1）提高异丙基苹果酸合酶的表达或活性，对比文件2为降低其表达，并且异丙基苹果酸合酶基因及多肽的序列不同；（2）使用毛状体特异性启动子来启动异丙基苹果酸合酶基因表达；（3）所述突变的烟草植物、非天然存在的烟草植物或转基因的烟草植物的视觉外观与对照植物基本相同。基于上述区别技术特征以及本申请的相关记载（本申请实施例4以及图4）可以确定，权利要求1技术方案所要解决的技术问题是：提供一种在烟草中增加C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的方法。
对比文件2仅公开了针对潘那利番茄来源的异丙基苹果酸合酶基因IPMSa以及IPMSb的序列，设计干扰RNA载体，通过该干扰RNA来调节红花烟草T.I.1068、粘毛烟草cv24中相关基因的表达，通过检测发现在红花烟草中，糖酯中的相对酰基丰度发生改变，2-甲基丁酰的含量升高，3-甲基戊酰的含量降低；粘毛烟草中糖酯酰基的丰度也发生了改变，5-甲基己酸（5-MeHexanoate）含量降低；在烟草中糖酯酰基通过αKAE途径实现碳延伸，2-异丙基苹果酸合酶参与α-酮延伸的催化反应。但是，基于本领域技术人员公知常识以及本申请图3的记载可知，蔗糖酯的合成以及碳链的延伸涉及多个酶的参与，对比文件2仅教导了异丙基苹果酸合酶的抑制，会影响2-甲基丁酰、3-甲基戊酰、5-甲基己酸的含量，但是无法确定其是否与C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯含量之间的关系，即无法确定在烟草中过表达异丙基苹果酸合酶是否会影响到C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的含量，更无法预期在病毒启动子过表达异丙基苹果酸合酶基因对C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯含量影响很小以及基本没有影响的情况下，选择毛状体特异启动子来过表达异丙基苹果酸合酶基因能够实现明显的增加C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯含量。而本申请实施例通过在K326烤烟品种中，使用毛状体特异性启动子过表达SEQ ID NO:1所示的异丙基苹果酸合酶基因的技术手段，实现了明显提高C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的含量的技术效果。因此，权利要求1相对于对比文件2是非显而易见的，其具备突出的实质性和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相同的理由，权利要求2-14也具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定指出：在对比文件2公开的编码IPMSa和IPMSb的核苷酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到利用常规技术手段从与番茄相近的其他植物，例如同属茄科的烟草中克隆得到同源性基因及其编码的蛋白质，并用于调节蔗糖酯的量。而本申请说明书既未对其所述的“视觉外观与对照植物基本相同”作进一步的解释，也未记载有关保持转基因植物表型基本不变的试验和数据，因此本申请实际并未解决上述问题。前置意见中进一步指出：本申请实施例仅验证了序列1是蔗糖酯合成的关键酶，对其他三种序列并没有进行试验验证，也没有记载其是否能够影响烟草的视觉外观，不能认定其具备创造性。复审通知书指出：由对比文件2可知，异丙基苹果酸合酶表达量的改变会影响相应蔗糖酯的形成和含量，在对比文件2的综合教导下，本领域技术人员有动机采用过表达或抑制表达两种手段来验证异丙基苹果酸合酶对蔗糖酯的影响，并常规选择异丙基苹果酸合酶基因及其多肽序列，并且选择毛状体特异性启动子来提高基因在毛状体中的表达量，同时根据需要选择希望的表型，基于本申请的记载，无法确定权利要求1所涵盖的技术方案均能够实现“视觉外观与对照烟草基本相同”这一效果。因此，权利要求1不具备创造性。
如上所述，复审请求人提交修改的权利要求书中删除了有关SEQ ID NO:10、12、14以及SEQ ID NO:11、13、15的技术方案。而本申请实施例通过在K326烤烟品种中，使用毛状体特异性启动子和病毒启动子过表达SEQ ID NO:1所示的异丙基苹果酸合酶基因的技术手段，实现了相对于病毒启动子，能够明显提高C2C16:0、C2C17:0、C2C18:0相应蔗糖酯的含量的技术效果。这一技术方案及其产生的相应技术效果根据对比文件2无法预期。
驳回决定、前置意见以及复审通知书中所指出的所有权利要求不具备创造性的缺陷已经被克服。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年09月06日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定针对的审查文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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