发明创造名称：实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针
外观设计名称：
决定号：182674
决定日：2019-06-27
委内编号：1F237760
优先权日：
申请（专利）号：201510120660.8
申请日：2015-03-19
复审请求人：浙江省检验检疫科学技术研究院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：魏春宝
合议组组长：李康琦
参审员：周洋
国际分类号：C12Q1/70，C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果现有技术中存在将发明的区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510120660.8，名称为“实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法及其试剂盒、引物和探针”的发明专利申请。申请人为浙江省检验检疫科学技术研究院。本申请的申请日为2015年03月19日，公开日为2015年07月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年08月01日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：对比文件1（传染性软化病病毒（桐乡株）的nested RT-PCR检测及其RNA聚合酶的克隆和表达，陆奇能，《中国优秀硕士学位论文全文数据库》，D051-19；公开日为2011年12月15日）公开了通过巢式PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法，并公开了其使用的引物序列。权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征为：权利要求1中实时荧光PCR检测方法中的引物与对比文件1中巢式PCR的引物的序列不同，且权利要求1中要求保护了探针。权利要求1实际解决的技术问题是提供另一种类型的检测试剂。对于本领域技术人员来说，采用PCR技术检测病毒表达或者定量分析是本领域的常规实验手段，巢式PCR和探针法实时荧光定量PCR均是本领域常用PCR检测技术，本领域技术人员可根据实际需要进行调整，采用探针法实时荧光PCR进行病毒检测是本领域病毒检测常规技术手段的一种。针对已知基因设计合适的引物和探针序列是本领域常规实验手段，如本领域技术人员在常规设计软件的辅助下，结合引物和探针设计原则通过简单实验的尝试即可获得合适的引物和探针序列，权利要求1中的引物和探针序列属于常规选择的结果。在获得探针序列后，在5’端加上荧光基团，3’端加上淬灭基团可获得适合的Taqman 探针。Taqman探针中常用的荧光基团有FAM、JOE、HEX，TAMRA、Eclipse是常用的淬灭基团，权利要求1中的探针是常规选择结果的一种。因此，在对比文件1的基础上，结合本领的常规实验手段获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。其引物和探针不具备创造性，为了提高检测的便捷性，将引物和探针制备成试剂盒是本领域的常规实验手段，因而权利要求2也不具备创造性。
驳回决定所依据的文本为申请日2015年03月19日提交的说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2015年8月20日提交的说明书第1-49段；2017年03月07日提交的权利要求第1-2项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒(Infection Flacherie Virus )的引物和探针，其特征在于：上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的探针为FAM- TTGAGGAGAACGCCAAGGAA –Eclipse。
2. 一种用于实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括引物和探针，上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的探针为FAM- TTGAGGAGAACGCCAAGGAA –Eclipse。”
申请人浙江省检验检疫科学研究院（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月16日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）虽然实时荧光PCR技术已广泛应用于医疗诊断、食品及动植物检测等领域，但应用到家蚕传染性软化病病毒的检测还是首次，本发明创造性地改进了原有的通过“巢式PCR-两轮PCR反应检测”的方法（对比文件1）。本发明的引物序列和对比文件1完全不同，还增加了普通PCR所没有的探针；本发明用的试剂和用量以及仪器设备与比对文件1不同，反应程序的设置也和对比文件1不同。（2）本发明引物和探针序列的设计是基于家蚕传染性软化病病毒RNA序列，包括HM245295.1， HM569717.1， EU868609.1（Genbank基因序列号）等基因序列。上述序列长度为9600个碱基左右，设计的引物探针能检测到目标物种的同时，必须不能检测到非目标物种，因此引物和探针的序列必定不能是从这9600个碱基中任意选择。看似用引物设计软件即能完成的任务，实际操作时，使用软件得到的引物探针并非就能达到检测的专一性、特异性，及检测的灵敏度和稳定性的要求。引物设计软件只对合适的引物长度、GC含量、碱基的连续性、退火温度等做出选择，而并不会设计具有物种特异性的引物和探针，因此需要人为的判断和删选。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年12月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：实时荧光PCR是常用的研究基因差异表达的方法（如《医学生物化学与分子生物学实验教程》，朱月春等，聚合酶链反应技术，第50-55页，高等教育出版社，公开日为2011年4月30日；《全国临床检验操作规程》，中华人民共和国卫生部医政司，实时荧光PCR技术的基本原理和方法，第952-956页，东南大学出版社，公开日为2006年11月30日），该方法已经广泛用于医疗诊断、食品及动植物检测和科研等各个领域，因此本申请采用实时荧光PCR进行家蚕传染性软化病病毒的检测并不是对实时荧光PCR进行了创造性的改进。实时荧光PCR检测必然会使用相应的试剂和用量、仪器设备、反应程序。且权利要求1和2请求保护的是产品权利要求，复审请求人所陈述的试剂用量、仪器设备、反应程序的设置并没有体现在权利要求中。引物和探针具有特异性、高效率性是基本要求，现有技术对于PCR反应以及引物探针的设计和筛选做出了明确的指导，例如选择目标基因、引物探针的设计原则、PCR体系的优化等，本领域技术人员在现有技术的教导下，通过软件设计、正交实验等筛选得到合适的引物和探针。申请人设计的引物和探针是基于家蚕传染性软化病病毒RNA序列，而家蚕传染性软化病病毒毒株日本株、印度株、浙江株之间具有极高的亲缘关系，通过基因序列比较后发现，家蚕传染性软化病病毒同源性高达99.5%或以上，也就是说不同地域的家蚕传染性软化病病毒的变异率低，因此针对上述三株病毒设计通用引物是容易做到的。且基于检测浙江株的目的，也可能得到可检测三株的通用引物。而本申请中引物和探针的检测灵敏度可达到10-3 ng/ul，这也仅达到现有技术中实时荧光定量PCR检测的范围。因而，坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年02 月03 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1相比，区别特征为：对比文件1为巢式PCR，而本申请权利要求1为实时荧光PCR，给出了探针序列；并且二者所用引物的核苷酸序列不同。由此可知权利要求1实际解决的技术问题是用另一种PCR检测家蚕传染性软化病病毒。巢式PCR和实时荧光定量PCR均是本领域常用的PCR检测技术，本领域技术人员知晓二者特点及检测所需试剂，在对比文件1公开了巢式PCR检测家蚕传染性软化病病毒情况下，本领域技术人员有动机换用另一常规PCR技术检测家蚕传染性软化病病毒，实时荧光PCR包含引物和探针的使用，本领域技术人员进行实时荧光PCR检测时必然会设计合成探针并在探针5’端加上荧光基团，3’端加上淬灭基团，而FAM和Eclipse本领域常用的荧光基团和猝灭基团。设计和合成引物和探针核苷酸序列的具体操作是本领域常规技术手段，在对比文件1所公开引物序列基础上，本领域技术人员很容易借助常规设计软件，按照引物和探针设计原则获得另外的引物及探针序列。因此，在对比文件1的基础上结合本领域常规实验手段获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，因而权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。为了提高检测的便捷性，将引物和探针等检测试剂制备成试剂盒是本领域的常规实验手段，权利要求2也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019 年03 月16 日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1公开的巢式PCR通过两轮PCR反应，使用两套引物，第二套引物的功能是特异性扩增位于首轮PCR产物内的DNA片段，巢式PCR要经过两轮扩增，同时也要经过两轮的凝胶检测，实时荧光PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续检测荧光信号强弱的变化及时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要PCR产物进行凝胶检测，本发明使用一组上下游引物以及探针与之前巢式PCR引物完全不一致，具有明显区别。本申请提供的具有家蚕传染性软化病毒的引物和探针，其具有特异性和灵敏度，所谓特异性即实质选择性检出家蚕传染性软化病病毒，避免其他病毒的干扰，而在灵敏度方面，是在极低的底物浓度下能扩增到目标片段。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出复审请求审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未修改申请文件，因此本复审请求审查决定针对的审查文本与驳回决定针对的审查文本相同，即申请日2015年03月19日提交的说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表；2015年08月20日提交的说明书第1-49段；2017年03月07日提交的权利要求第1-2项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果现有技术中存在将发明的区别特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的。
就本案而言，权利要求1请求保护实时荧光PCR检测家蚕传染性软化病病毒(Infection Flacherie Virus )的引物和探针，其特征在于：上游引物的序列为GGGAAAGTCGATGAATGCCC，下游引物的序列为AAGTGTGCCCAGSTATARCT，下游引物中S随机采用G或C替代，R随机采用A或G替代，所述的探针为FAM- TTGAGGAGAACGCCAAGGAA –Eclipse。与本申请属于同一技术领域的对比文件1公开了通过巢式PCR检测家蚕传染性软化病病毒的方法(参见对比文件1第33-38页)，并公开了其使用的引物序列（具体参见对比文件1表2.1）。权利要求1与对比文件1相比，其区别特征为： PCR类型不同，对比文件1为巢式PCR，而本申请权利要求1为实时荧光PCR，并给出了探针序列，且二者所用引物的核苷酸序列不同。由此可知权利要求1实际解决的技术问题是用另一种PCR检测家蚕传染性软化病病毒。巢式PCR和实时荧光定量PCR均是本领域常用的PCR检测技术，本领域技术人员知晓二者特点及检测所需试剂，在对比文件1公开了通过巢式PCR成功检测了家蚕传染性软化病病毒的技术方案情况下，本领域技术人员有动机换用另一常规PCR技术检测家蚕传染性软化病病毒，实时荧光PCR包含引物和探针的使用，本领域技术人员进行实时荧光PCR检测时必然会设计合成探针并在探针5’端加上荧光基团，3’端加上淬灭基团，而FAM和Eclipse本领域常用的荧光基团和猝灭基团。设计和合成引物和探针核苷酸序列的具体操作是本领域常规技术手段，在对比文件1所公开引物序列基础上，本领域技术人员很容易借助常规设计软件，按照引物和探针设计原则获得的引物及探针序列。因此，在对比文件1的基础上，结合本领域常规实验手段获得权利要求1的技术方案对于本领域技术人员来说是显而易见的，因而权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2请求保护的是含权利要求1所述引物和探针的试剂盒。为了提高检测的便捷性，将引物和探针等检测试剂制备成试剂盒是本领域的常规实验手段。在权利要求1请求保护的引物和探针不具有创造性的情况下，权利要求2相对于对比文件1及本领域常规技术手段的结合也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人在答复复审通知书时的意见陈述，合议组认为：巢式PCR和实时荧光PCR都是常用的PCR检测技术，本领域技术人员清楚各自的技术特点，例如巢式PCR需要两套引物，实时荧光PCR需要设计探针。对于巢式PCR和实时荧光PCR技术的检测效果，以及特异性和灵敏度的含义，本领域技术人员也是充分知晓的，复审请求人意见陈述中并未提出本申请在引物设计以及检测特异性和灵敏度上相对于对比文件1以及本领域公知的荧光实时定量PCR的普遍效果具体有何突出的实质性特点和显著的进步。因此，复审请求人认为本申请权利要求1-2具有创造性的理由和主张不成立。
基于上述事实和理由，合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017 年08 月01 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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