发明创造名称：一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒
外观设计名称：
决定号：182269
决定日：2019-06-27
委内编号：1F236185
优先权日：
申请（专利）号：201610186635.4
申请日：2016-03-29
复审请求人：扬州大学 国药集团扬州威克生物工程有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：张丽颖
合议组组长：陈中伟
参审员：马艳林
国际分类号：C12Q1/70，C12Q1/68，C12R1/93
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征,但现有技术中给出了将上述区别技术特征应用到该最接近现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且该区别技术特征的引入也未产生预料不到的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域的技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610186635.4，名称为“一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为扬州大学、国药集团扬州威克生物工程有限公司。本申请的申请日为2016年03月29日，公开日为2016年07月20日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月06日发出驳回决定，以权利要求1不具备创造性为理由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为申请日2016年03月29日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书附图第1-2页，2016年05月05日提交的说明书第1-7页，以及2017年01月09日提交的权利要求1。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒,其特征在于包括：两个抗体寡核苷酸探针、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液；所述两个抗体寡核苷酸探针是生物素标记的单克隆抗体5D3以及4F12与链霉素标记的3’和5’寡核苷酸的偶联物,所述链霉素标记的3’和5’寡核苷酸是商品化TaqMan邻位连接技术KIT中提供的标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。”
驳回决定认为：权利要求1的试剂盒与对比文件1（CN103163299A，公开日为2013年06月19日）的试剂盒相比不同之处在于：1）将标记抗体的DNA分子具体限定为由商品化TaqMan邻位连接技术KIT中提供的标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。2）该试剂盒还包括连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液。因此本发明要解决的技术问题是提供以免疫PCR技术检测禽白血病的试剂盒。对于区别特征1），对比文件2（“免疫PCR技术”，尹军霞等，《绍兴文理学院学报》，第21卷，第4期，第51-54页，公开日为2001年12月31日）具体描述了免疫PCR技术的基本原理，并且明确教导了标记抗体的DNA分子可以是任何的双链和单链DNA分子，而本发明权利要求1中使用的DNA分子是商品化的TaqMan邻位连接技术KIT提供的，基于说明书的描述以及申请人对第二次通知书的答复意见，其属于公知常识的直接应用。对于区别特征2），免疫PCR技术是一种常规技术，在检测过程中用到连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液，属于本领域技术人员根据具体情况进行的常规选择，而且其中大部分试剂都属于商品购买获得。综上所述，对于本领域技术人员而言，在对比文件1和2公开的基础上结合公知常识获得权利要求1所述的试剂盒是显而易见的，权利要求1不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人扬州大学、国药集团扬州威克生物工程有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年10月30日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的修改替换页（共1页1项）。相对于驳回决定所针对的权利要求，所作修改在于，进一步限定“所述生物素标记抗体为生物素标记的杂交瘤细胞株CGMCC No.7106及CGMCC No.7107分泌获得的抗禽白血病病毒P27蛋白特异性单克隆抗体5D3以及4F12”，并调整了权利要求1的措辞。复审请求人认为：本申请的试剂盒与现有技术中的试剂盒相比，优势在于，不用对样品进行繁琐的DNA或RNA提取，与ELISA比较，对样品只需2?L的量即可检测，且特异性强，灵敏度高。且在临床应用评估中，本申请的试剂盒与IDEXX公司的ELISA试剂盒符合率高达92.73%。邻位连接技术在现有技术中已有报道，但是应用上述抗体及制备技术制备检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒并没有报道。
提出复审请求时新修改的权利要求1如下：
“1. 一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒，其特征在于包括：两个抗体寡核苷酸探针、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液；
所述抗体寡核苷酸探针为生物素标记抗体与链霉素标记寡核苷酸的偶联物；
所述生物素标记抗体为生物素标记的杂交瘤细胞株CGMCC No.7106及CGMCC No.7107分泌获得的抗禽白血病病毒P27蛋白特异性单克隆抗体5D3以及4F12；
所述链霉素标记寡核苷酸为商品化TaqMan邻位连接技术KIT中标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月06日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019 年02 月03 日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1的技术方案与对比文件1的技术方案相比，区别在于，权利要求1中将抗体用生物素标记并与链霉素标记寡核苷酸偶联成探针，其中链霉素标记的寡核苷酸具体为由商品化TaqMan邻位连接技术KIT中提供的标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。该试剂盒还包括连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液。基于上述区别以及本申请的记载，本申请实际解决的技术问题是将抗原抗体免疫反应与PCR结合，通过连接反应产生PCR可扩增的检测信号以高通量快捷检测禽白血病病毒，即，提供另外一种检测抗原抗体免疫结合信号的方法-免疫PCR及其相关试剂。对于上述区别，对比文件2公开：基于酶标记的抗体技术在检测微量抗原的应用中还缺乏足够的灵敏度，免疫PCR的高灵敏度使得免疫检测技术达到了一个新的高度；免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分是类似于普通ELISA的抗原抗体反应，第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测，免疫PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应阴性或阳性的结果，而免疫PCR是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA并进行电泳检测，由此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量（参见对比文件2第51页第1-2段）。对比文件2进一步公开抗体采用生物素标记，应用链亲和素（也称链霉亲和素）与DNA结合，免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，免疫PCR扩增系统包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶（参见对比文件2第52页第2、3、6段）。由此可见对比文件2给出了使用寡核苷酸来标记抗体并用PCR扩增DNA从而检测抗原的量的技术启示。而对于邻位连接试剂盒以及相关试剂的限定，本领域技术人员知晓，邻位连接技术是本领域公知的，其是用于将免疫PCR中针对不同表位抗体-寡核苷酸探针进行连接的方法（参见公知常识性证据1：《PCR Technology Current Innovations》，Tania Nolan等编著，CRC Press，2013年，第394页、图27.1），该方法涉及使用的试剂也属于可商业购买的，如链霉素标记寡核苷酸、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液都属于Thermo Fisher Scientific公司出售的TaqMan?Protein Assays试剂盒中的试剂，因此也都属于本领域技术人员的常规选择。综上所述，对本领域技术人员而言，获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019 年02 月27 日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1及对比文件2缺乏结合的动机，在对比文件1公开ELISA技术优于RT-PCR技术上，本领域技术人员难于显而易见地得出采用免疫PCR基础替代ELISA技术，并能达到高灵敏度的效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2017年10月30日提交了权利要求书的全文替换页（共1页1项），经合议组审查，所作修改符合专利法第33条以及实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定所针对的文本为：申请日2016年03月29日提交的说明书摘要、摘要附图、说明书附图第1-2页，2016年05月05日提交的说明书第1-7页，以及2017年10月30日提交的权利要求1。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征,但现有技术中给出了将上述区别技术特征应用到该最接近现有技术以解决其存在的技术问题的启示，并且该区别技术特征的引入也未产生预料不到的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案对本领域的技术人员来说是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
对于本案，权利要求1请求保护“一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒，其特征在于包括：两个抗体寡核苷酸探针、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液；
所述抗体寡核苷酸探针为生物素标记抗体与链霉素标记寡核苷酸的偶联物；
所述生物素标记抗体为生物素标记的杂交瘤细胞株CGMCC No.7106及CGMCC No.7107分泌获得的抗禽白血病病毒P27蛋白特异性单克隆抗体5D3以及4F12；
所述链霉素标记寡核苷酸为商品化TaqMan邻位连接技术KIT中标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。”
根据本申请说明书中的记载，使用本申请试剂盒检测禽白血病病毒的原理在于，将针对于禽白血病病毒的两个特异性单抗生物素酶标，用生物素酶标单抗与5’、3’寡核苷酸分别制备探针，用制备的探针检测样品并进行连接反应，qPCR定量分析连接的寡核苷酸从而获知样品中靶抗原的含量（参见本申请说明书第12段）。
对比文件1公开了一种检测禽白血病病毒的双抗夹心ELISA试剂盒，其包括了包被在酶标板的抗ALV（即禽白血病病毒）单克隆抗体与酶标记抗ALV蛋白单克隆抗体，分别针对ALV p27蛋白不同的抗原决定簇。所述的单克隆抗体分别由保藏号CGMCC No.7106的杂交瘤细胞株ALV P27-5D3以及保藏号为CGMCC No.7107的杂交瘤细胞株ALV P27-4F12分泌获得(参见对比文件1权利要求1)。权利要求1的技术方案与对比文件1的技术方案相比，区别在于，权利要求1中将抗体用生物素标记并与链霉素标记寡核苷酸偶联成探针，其中链霉素标记的寡核苷酸具体为由商品化TaqMan邻位连接技术KIT中提供的标有链霉素的3’和5’寡核苷酸。该试剂盒还包括连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液。基于上述区别以及本申请的记载，本申请实际解决的技术问题是将抗原抗体免疫反应与PCR结合，通过连接反应产生PCR可扩增的检测信号以高通量快捷检测禽白血病病毒，即，提供另外一种检测抗原抗体免疫结合信号的方法-免疫PCR及其相关试剂。对于上述区别，对比文件2公开：基于酶标记的抗体技术在检测微量抗原的应用中还缺乏足够的灵敏度，免疫PCR的高灵敏度使得免疫检测技术达到了一个新的高度；免疫PCR主要由两个部分组成，第一部分是类似于普通ELISA的抗原抗体反应，第二部分即常规的PCR扩增和电泳检测，免疫PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应阴性或阳性的结果，而免疫PCR是以一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，用PCR扩增抗体所连接的DNA并进行电泳检测，由此可由PCR产物的量来反映抗原分子的量（参见对比文件2第51页第1-2段）。对比文件2进一步公开抗体采用生物素标记，应用链亲和素（也称链霉亲和素）与DNA结合，免疫PCR中的DNA分子可以选择任何DNA，免疫PCR扩增系统包括引物、缓冲液和耐热DNA聚合酶（参见对比文件2第52页第2、3、6段）。由此可见对比文件2给出了使用寡核苷酸来标记抗体并用PCR扩增DNA从而检测抗原的量的技术启示，在对比文件2的启示下，本领域技术人员能够意识到免疫PCR的灵敏度优于本申请中的ELISA反应，从而也有动机使用免疫PCR的方法来检测禽白血病病毒。而对于邻位连接试剂盒以及相关试剂的限定，本领域技术人员知晓，邻位连接技术是本领域公知的，其是用于将免疫PCR中针对不同表位抗体-寡核苷酸探针进行连接的方法（参见公知常识性证据1第394页、图27.1），该方法涉及使用的试剂也属于可商业购买的，如链霉素标记寡核苷酸、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液都属于Thermo Fisher Scientific公司出售的TaqMan?Protein Assays试剂盒中的试剂，因此也都属于本领域技术人员的常规选择。综上所述，对本领域技术人员而言，获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人的意见，合议组认为：对比文件1中的ELISA和本申请中的免疫PCR在技术上并非是毫无关联的，其都是基于免疫学的常规检测技术，这不同于对比文件1中提及的RT-PCR技术。对比文件2明确公开了免疫PCR与ELISA的区别就在于ELISA是以碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶来标记抗体，用颜色反应来表明阴性或阳性结果，而免疫PCR则是一段特定的双链或单链DNA来标记抗体，再用PCR扩增抗体所连接的DNA（参见对比文件2第51页第2段）。且通过PCR扩增系统对于信号的放大使得该技术具有很高的灵敏度（参见对比文件2摘要、第51页第1段）。本领域技术人员在对比文件2的启示下，容易想到将ELISA替换为免疫PCR，也能够预期，能达到高灵敏度的效果。由此可见将对比文件2中的免疫PCR技术代替ELISA技术用于检测ALV是存在技术启示的。因此，复审请求人的意见不具有说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017 年07 月06 日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定，请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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