发明创造名称：脂肪酸的酶促ω氧化和ω胺化
外观设计名称：
决定号：182150
决定日：2019-06-26
委内编号：1F236348
优先权日：2012-03-12
申请（专利）号：201380015945.4
申请日：2013-03-12
复审请求人：赢创德固赛有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王莉
合议组组长：韩世炜
参审员：彭郁葱
国际分类号：C12N9/02,C12N9/04,C12N9/10,C12P7/42,C12P7/62,C12P7/64,C12P13/00,C12N15/52
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将上述区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380015945.4，名称为“脂肪酸的酶促ω氧化和ω胺化”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为赢创德固赛有限公司，申请日为2013年03月12日，优先权日为2012年03月12日，公开日为2014年11月26日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门以权利要求1-23不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由于2017年08月03日驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：2014年09月23日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文译文的说明书第1-31页、说明书摘要、说明书核苷酸或氨基酸序列表第1-175页；2017年03月06日提交的权利要求第1-23项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 用于氧化式（I）的脂肪酸或其酯的方法
其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，
其中n是0-30，优选6-24，
所述方法包括以下步骤：
a）通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN，
b）通过将来自步骤a）的所述脂肪酸醇与醇脱氢酶接触进一步氧化来自步骤a）的所述脂肪酸醇为至少一种醛或酮，
c）通过在胺供体，优选为丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触将来自步骤b）的所述醛或酮胺化，
其中步骤c）任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD(P)H存在的情况下进行。
2. 权利要求1的方法，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶优选为来自泊库岛食烷菌（Alcanivorax borkumensis）SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶（数据库编号YP_691921）或其变体。
3. 权利要求1-2中任一项的方法，其中所述醇脱氢酶是NAD(P) 依赖的醇脱氢酶，优选来自大肠杆菌（Escherichia coli）MS 187-1的NAD依赖的醇脱氢酶 (数据库编号ZP_07145023)或其变体，或葡萄糖-甲醇-胆碱-氧化还原酶家族的氧化还原酶，优选来自恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）GB-1 (数据库编号CAB54054.1)的氧化还原酶或其变体，或含黄素的醇脱氢酶，优选来自热带念珠菌（Candida tropicalis）的含黄素的醇脱氢酶(数据库编号AAS46878.1)或其变体。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其中，在所述步骤a）中，存在另外的铁氧还蛋白还原酶，优选来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库编号YP_691923)或其变体，和/或铁氧还蛋白，优选来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白(数据库编号YP_691920)或其变体。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其中所述步骤c）在丙氨酸脱氢酶、铵和NADH存在的情况下进行，并且所述丙氨酸脱氢酶是来自枯草芽孢杆菌枯草亚种168株（Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）的丙氨酸脱氢酶(数据库编号NP_391071)或其变体。
6. 权利要求1-5中任一项的方法，其中以全细胞催化剂的形式重组提供至少一种选自以下的酶：CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。
7. 权利要求6的方法，其中以一种或多于一种的全细胞催化剂的形式重组提供在所述步骤a）、b）或c）的至少一个中存在的或与所述脂肪酸或其酯、来自步骤b）的进一步氧化的脂肪酸或其酯或者来自步骤c）的胺化的进一步氧化的脂肪酸或其酯接触的选自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的所有酶。
8. 权利要求6-7中任一项的方法，其中所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽，优选选自以下的AlkL：来自恶臭假单胞菌的AlkL（数据库编号CAB69081）、来自水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei） VT8的AlkL (数据库编号YP_957722)、来自亚历山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii） HTCC2633的AlkL (数据库编号ZP_00953584)、来自Marinobacter manganoxydans MnI7-9的AlkL (数据库编号ZP_09158756)、来自柄杆菌属种（Caulobacter sp.） K31的AlkL (数据库编号YP_001672217)、来自食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）的AlkL(数据库编号Q00595)或其变体。
9. 权利要求6-8中任一项的方法，其中所述全细胞催化剂是这样的细胞，其具有相比于其野生型至少一种催化脂肪酸的β-氧化反应之一的酶降低的活性，其中所述酶优选选自脂肪酸输入蛋白、脂肪酸-CoA连接酶、酰基-CoA脱氢酶、2,4-二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶。
10. 权利要求5-9中任一项的方法，其中选择步骤c）中的所述丙氨酸脱氢酶使得它还原在步骤b）中由所述醇脱氢酶氧化的氧化还原辅因子，优选NAD 或NADP 。
11. 全细胞催化剂，其表达重组的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、重组的醇脱氢酶、重组的氨基转移酶和任选一种或多于一种选自以下的重组酶：丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。
12. 权利要求11的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂另外表达AlkL家族的多肽，优选选自以下的AlkL：来自恶臭假单胞菌的AlkL（数据库编号CAB69081）、来自水油海杆菌（Marinobacter aquaeolei） VT8的AlkL (数据库编号YP_957722)、来自亚历山大海洋柄菌（Oceanicaulis alexandrii） HTCC2633的AlkL (数据库编号ZP_00953584)、来自Marinobacter manganoxydans MnI7-9的AlkL (数据库编号ZP_09158756)、来自柄杆菌属种（Caulobacter sp.） K31的AlkL (数据库编号YP_001672217)、来自食油假单胞菌（Pseudomonas oleovorans）的AlkL(数据库编号Q00595)或其变体。
13. 权利要求11-12中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂是这样的细胞，其具有相比于其野生型至少一种催化脂肪酸的β-氧化反应之一的酶降低的活性，其中所述酶优选选自脂肪酸输入蛋白、脂肪酸-CoA连接酶、酰基-CoA脱氢酶、2,4-二烯酰基-CoA还原酶、烯酰基-CoA水合酶和3-酮酰基-CoA硫解酶。
14. 权利要求11-13中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂表达铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白。
15. 权利要求11-14中任一项的全细胞催化剂，其中所述全细胞催化剂表达丙氨酸脱氢酶，并且其中所述丙氨酸脱氢酶来自枯草芽孢杆菌枯草亚种168株（Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168）(数据库编号NP_391071)或是其变体。
16. 权利要求11-15中任一项的全细胞催化剂，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN和/或它是来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库编号YP_691921)或其变体，并且所述铁氧还蛋白还原酶是来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白还原酶(数据库编号YP_691923)或其变体，并且所述铁氧还蛋白是来自泊库岛食烷菌SK2的铁氧还蛋白(数据库编号YP_691920)或其变体。
17. 权利要求1-16中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述醇脱氢酶是NAD(P) 依赖的醇脱氢酶、葡萄糖-甲醇-胆碱-氧化还原酶家族的氧化还原酶或者含黄素的醇氧化酶，优选NAD(P) 依赖的醇脱氢酶，最优选来自大肠杆菌MS 187-1的NAD依赖的醇脱氢酶(数据库编号ZP_07145023)或其变体。
18. 权利要求1-17中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述氨基转移酶是来自恶臭假单胞菌GB-1的氨基转移酶(数据库编号YP_001668026.1)或其变体。
19. 权利要求1-18中任一项的全细胞催化剂或方法，其中所述脂肪酸是不饱和的或支化的脂肪酸。
20. 权利要求1-19中任一项的全细胞催化剂或方法，其中以全细胞催化剂的形式重组提供选自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶、丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶的至少一种酶，或者所述目的通过全细胞催化剂实现，其中所述全细胞催化剂是相对于细胞的野生型具有至少一种内源醛脱氢酶降低的活性的细胞。
21. 权利要求11-20中任一项的全细胞催化剂用于氧化和/或胺化脂肪酸或其酯的用途，其中所述脂肪酸或其酯优选具有式（I）
其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，
其中n是0-30，优选6-24。
22. 权利要求21的全细胞催化剂的用途，其中所述氧化产生氧化产物的混合物，基于反应的脂肪酸或其酯的物质的量，所述混合物包含至少90％的对应的醇、少于1％的对应的醛和少于10％的对应的酸。
23. 权利要求21-22中任一项的全细胞催化剂的用途，其中所述脂肪酸是不饱和的或支化的脂肪酸。”
驳回决定指出：权利要求1与对比文件1（CN101580815A，公开日2009年11月18日）的区别在于：对比文件1没有公开细胞色素P450单加氧酶是具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。由于对比文件1公开了细胞色素P450单加氧酶，其具有LLLIGGNDTTRN序列，而且CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶也是一种细胞色素P450单加氧酶，在对比文件1公开的细胞色素P450单加氧酶具有所述功能的基础上，本领域技术人员完全能够选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶并根据本领域的常规实验验证其效果，因此权利要求1不具备创造性。权利要求2-10的技术方案是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合本领域常识或常规选择容易得到的，也不具备创造性。参照针对权利要求1-10的评述，本领域技术人员完全能够选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶并根据本领域的常规实验验证其效果。因此，权利要求11、12、15-17、19和20不具备创造性。当权利要求21-23引用所述权利要求时，基于同样的原因和理由，权利要求21-23也不具备创造性。在对比文件1公开的内容的基础上，本领域技术人员会想到选择降低β-氧化反应涉及的酶活性，也会想到选择过表达铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白，因此，权利要求13和14不具备创造性。由于恶臭假单胞菌GB-1的氨基转移酶也是本领域常规使用的氨基转移酶，而且对比文件1中也选择了来自恶臭假单胞菌的烷烃单加氧酶，因而，本领域技术人员完全能够根据本领域的常识选择恶臭假单胞菌GB-1的氨基转移酶。因此，权利要求18不具备创造性。当权利要求21-23引用权利要求13、14和18时，权利要求21-23也不具备创造性。
申请人赢创德固赛有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月01日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书全文替换页（共4页22项）。相对于驳回针对的权利要求书，其修改如下：将原权利要求7并入权利要求1，删除原权利要求7，并调整权利要求编号和引用关系。
复审请求时修改的权利要求1如下：
“1. 用于氧化式（I）的脂肪酸或其酯的方法
其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，
其中n是0-30，优选6-24，
所述方法包括以下步骤：
a）通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN，
b）通过将来自步骤a）的所述脂肪酸醇与醇脱氢酶接触进一步氧化来自步骤a）的所述脂肪酸醇为至少一种醛或酮，
c）通过在胺供体，优选为丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触将来自步骤b）的所述醛或酮胺化，
其中步骤c）任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD(P)H存在的情况下进行，
其中以一种或多于一种的全细胞催化剂的形式重组提供在所述步骤a）、b）或c）的至少一个中存在的或与所述脂肪酸或其酯、来自步骤b）的进一步氧化的脂肪酸或其酯或者来自步骤c）的胺化的进一步氧化的脂肪酸或其酯接触的选自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶和丙氨酸脱氢酶的所有酶。”
复审请求人认为：（1）对比文件1完全没有教导或暗示采用CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶氧化脂肪酸或其酯，更没有教导或暗示将其用作烷烃单加氧酶的选择。在对比文件1的教导下，本领域技术人员不会有动机具体选择CYP153家族的成员来实现本发明。（2）本申请的实施例证实了来自泊库岛食烷菌SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶相对于来自其他家族的细胞色素P450单加氧酶可以获得多得多的期望产物，实现了优异的技术效果。对比文件1教导优选的单加氧酶是来自恶臭假单胞菌GPO1的alkBGT，具有包括可能导致产生若干不想要的副产物的缺点，本申请的CYP153单加氧酶更加特异性地产生期望的脂肪酸醇。因此，权利要求1相对于对比文件1具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月20日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年11月02日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别在于：1）权利要求1是通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇，而对比文件1使用的是来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT；2）权利要求1还记载了步骤c）任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD(P)H存在的情况下进行。针对区别特征1），对比文件1给出了使用细菌来源的细胞色素P450单加氧酶氧化所述脂肪酸或其酯（月桂酸或月桂酸甲酯）的教导，而本领域公知，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是典型的细菌I类P450s（P450加氧酶系统），来自NAD(P)H的电子通过铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶传递到这些酶上，可以氧化C5-C12烷烃和脂肪酸（参见公知常识证据1：《石油微生物学》，（法）伯纳德等著，张煜等译，中国石化出版社，2011年4月第1版，第204-206页，表13-2），可见，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是本领域常见的可用于氧化烷烃和脂肪酸的细胞色素P450单加氧酶。因而，在对比文件1结合上述本领域公知的基础上，本领域技术人员完全能够选择已知序列（如具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN）的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，并通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与该酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇。针对区别特征2），如前所述，对比文件1已经公开使用载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因和针对枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald的大肠杆菌菌株用于氨化反应以及以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD ，在此基础上，选择铵和NAD(P)H存在的情况下进行氨化反应是本领域常规选择。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求10请求保护全细胞催化剂，与对比文件1公开的内容相比，区别在于：权利要求10表达重组的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶和任选自以下的重组酶有：铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，而对比文件1具体使用的是来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT。参见对权利要求1的评述，在对比文件1结合本领域公知的基础上，本领域技术人员完全能够选择已知序列的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，并结合铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶将所述脂肪酸或其酯与该酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇。因而，该权利要求10不具备创造性。从属权利要求2-9、11-19的附加技术特征或者被对比文件1公开，或者属于本领域的常规选择，也不具备创造性。权利要求20-22请求保护权利要求10-19中任一项的全细胞催化剂用于氧化和/或胺化脂肪酸或其酯的用途。基于对比文件1公开的内容，在其引用的权利要求不具备创造性的前提下，权利要求20-22也不具备创造性。
复审请求人于2019年02月18日提交了意见陈述书和附件（比较实施例的数据），但未修改申请文件。结合上述附件，复审请求人认为：（1）对比文件1并没有教导可以采用细菌来源的细胞色素P450单加氧酶来氧化脂肪酸或酯。（2）CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶可以更加特异性地产生期望的脂肪酸醇，现有技术对此没有给出任何教导或暗示。（3）提交的比较例证实了CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶相比于AlkBGT对于氧化脂肪酸特异性更高并且能够产生更多的ω-羟基月桂酸甲酯(HLSME)。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书全文替换页（共4页22项）。经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所针对的文本为：2014年09月23日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文译文的说明书第1-31页、说明书摘要、说明书核苷酸或氨基酸序列表第1-175页；2017年11月01日提交的权利要求第1-22项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术存在区别技术特征，而现有技术给出了将上述区别技术特征应用到最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术从而获得要求保护的发明，并且所获得的发明的技术效果是可以预料的，则该发明不具备创造性。
具体到本案，权利要求1要求保护“用于氧化式（I）的脂肪酸或其酯的方法
其中R选自H、甲基、乙基、丙基和丁基，
其中n是0-30，优选6-24，
所述方法包括以下步骤：
a）通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇，其中所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN，
b）通过将来自步骤a）的所述脂肪酸醇与醇脱氢酶接触进一步氧化来自步骤a）的所述脂肪酸醇为至少一种醛或酮，
c）通过在胺供体，优选为丙氨酸存在的情况下与氨基转移酶接触将来自步骤b）的所述醛或酮胺化，
其中步骤c）任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD(P)H存在的情况下进行，
其中以一种或多于一种的全细胞催化剂的形式重组提供在所述步骤a）、b）或c）的至少一个中存在的或与所述脂肪酸或其酯、来自步骤b）的进一步氧化的脂肪酸或其酯或者来自步骤c）的胺化的进一步氧化的脂肪酸或其酯接触的选自CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、氨基转移酶和丙氨酸脱氢酶的所有酶。”
对比文件1公开了将月桂酸或月桂酸甲酯（对应于权利要求1中的脂肪酸或其酯）转换成月桂内酰胺的方法，给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶在大肠杆菌中过度表达这些酶（对应于权利要求1中的以一种全细胞催化剂的形式重组提供所有酶），将月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺（参见对比文件1的实施例A），并具体公开了使用来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT进行月桂酸或月桂酸甲酯的羟基化反应（对应于权利要求1中的步骤a），通过醇脱氢酶alkJ催化第二个成醛步骤（对应于权利要求1中的步骤b），在大肠杆菌中通过插入到微转座子Tn5之中的方式，将这些反应所需的基因alkBGJT染色体整合入大肠杆菌的基因组之中，在控制alkB启动子和正调节子alkS的情况下来表达基因（参见对比文件1的实施例A的步骤A1）；利用重组质粒BAD-CV2025-ald（载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因和针对枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald）转化载有Tn5：alkBGJST的大肠杆菌菌株 JM101，用于进行胺化反应形成ω-氨基月桂酸酯，并且再生氨基供体（对应于权利要求1中的步骤c）（参见对比文件1的实施例A的步骤A4），以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD （参见对比文件1的实施例A的步骤A8）。
由此可见，权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别在于：1）权利要求1是通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇，而对比文件1使用的是来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT；2）权利要求1还记载了步骤c）任选在丙氨酸脱氢酶、铵和NAD(P)H存在的情况下进行。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求1实际解决的技术问题是：提供另一种能够氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇的烷烃单加氧酶。
然而， 针对区别特征1），对比文件1还公开了所述细胞的上述优选实施方案而言，优选的酶EI是，尤其是优选的烷烃单加氧酶是，源于恶臭假单胞菌-GPO1 的经过alkBGT基因编码的烷烃单加氧酶；此外可以作为烷烃单加氧酶使用的还有细胞色素-P450-单加氧酶，尤其是源于假丝酵母属例如热带假丝酵母(Candida tropicalis)或者源于植物例如鹰嘴豆(Cicer arietinum L.)的细胞色素-P450-单加氧酶（参见对比文件1说明书第8页第6-18行）。可见，对比文件1给出了可以使用细菌来源的细胞色素P450单加氧酶氧化所述脂肪酸或其酯（月桂酸或月桂酸甲酯）的教导，且本领域公知，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是典型的细菌I类P450s（P450加氧酶系统），来自NAD(P)H的电子通过铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶传递到这些酶上，可以氧化C5-C12烷烃和脂肪酸（参见公知常识证据1，第204-206页，表13-2），可见，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是本领域常见的可用于氧化烷烃和脂肪酸的细胞色素P450单加氧酶。因而，在对比文件1结合上述本领域公知的基础上，本领域技术人员完全能够选择已知序列（如具有肽序列LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN）的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，并通过在分子氧、电子供体和NAD(P)H存在的情况下将所述脂肪酸或其酯与该酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇。针对区别特征2），如前所述，对比文件1已经公开使用载有来自紫色色杆菌DSM30191的转氨酶CV2025的基因和针对枯草芽孢杆菌的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald的大肠杆菌菌株用于氨化反应以及以偶联分析测定活性，在第二步骤中使作为转氨酶反应副产物出现的丙酮酸继续反应，将NADH氧化成NAD ，在此基础上，选择铵和NAD(P)H存在的情况下进行氨化反应是本领域常规选择。可见，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合本领域公知和常规技术能够得出权利要求1的全部技术方案，这对本领域技术人员来说是显而易见的，且所获得的技术效果也是可以预料的。因此，权利要求1所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求10要求保护“全细胞催化剂，其表达重组的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶、重组的醇脱氢酶、重组的氨基转移酶和任选一种或多于一种选自以下的重组酶：丙氨酸脱氢酶、铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶”，对比文件1公开了一种全细胞催化剂，其表达重组的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶（具体参见对比文件1的实施例A）。权利要求10请求保护的技术方案与对比文件1公开的内容相比，区别在于：权利要求10表达重组的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶和任选自以下的重组酶有：铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶，而对比文件1具体使用的是来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT。基于上述区别技术特征可以确定，权利要求10实际解决的技术问题是：提供另一种能够表达氧化所述脂肪酸或其酯的烷烃单加氧酶的全细胞催化剂。然而，参见对权利要求1的评述，在对比文件1结合本领域公知的基础上，本领域技术人员完全能够选择已知序列的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，并结合铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶将所述脂肪酸或其酯与该酶接触来氧化所述脂肪酸或其酯以产生脂肪酸醇。因而，该权利要求10所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2对权利要求1的所述CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶的来源和结构进行了进一步限定了。然而，如前所述，对比文件1给出了使用其他细菌来源的细胞色素P450单加氧酶氧化所述脂肪酸或其酯（月桂酸或月桂酸甲酯）的教导，而CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是典型的细菌I类P450加氧酶系统（参见公知常识证据1，第204-206页，表13-2），因而本领域技术人员能够想到选择已知的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，进而选择使用已知的，如泊库岛食烷菌SK2来源的所述细胞色素P450单加氧酶（数据库编号YP_691921）或其变体也是容易想到和获得的。因而在其引用的权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求3、16对所述醇脱氢酶的来源和结构进行了进一步限定。对比文件1公开了使用源于恶臭假单胞菌GPo1经过alkJ基因编码的醇脱氢酶（参见对比文件1说明书第9页第1行），并且还公开了给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶，将月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺（参见对比文件1的实施例A），因而选用已知的大肠杆菌的醇脱氢酶或其变体，或来自恶臭假单胞菌的氧化还原酶或其变体也是本领域技术人员容易想到和做到的，因而在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求3、16也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求4、13、15对存在另外的铁氧还蛋白还原酶和/或铁氧还蛋白的来源和结构进行了进一步限定。参见对权利要求1和2的评述，选择使用已知的，如泊库岛食烷菌SK2来源的所述细胞色素P450单加氧酶（数据库编号YP_691921）或其变体是本领域技术人员容易想到和获得的，且本领域公知，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶组成及辅助因子是铁氧还蛋白、铁氧还蛋白还原酶（参见公知常识证据1，第204-206页，表13-2），因而本领域技术人员容易想到并在所述全细胞催化剂中添加表达已知与CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶来源相同的铁氧还蛋白还原酶和/或铁氧还蛋白。因而在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求4、13、15也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求5-7、11、14对所述丙氨酸脱氢酶和以全细胞催化剂的形式重组提供的酶进行了进一步限定，然而对比文件1已经公开了给大肠杆菌补充所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶（参见对比文件1的实施例A），载有针对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis subsp.Subtilis)的丙氨酸脱氢酶进行编码的基因ald (SEQ. ID. No.02；NP_391071) （参见对比文件1的实施例A4），全细胞催化剂表达来自恶臭假单胞菌中的AlkL家族的多肽（具体参见对比文件1的实施例A1），因而在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求5-7、11、14也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求8、9、12对所述全细胞催化剂具有的活性和氧化还原辅因子进行了进一步限定，然而，本领域技术人员为了实现更好的氧化效果，会选择降低催化脂肪酸向β-氧化反应进行，也会想到降低β-氧化反应的酶活性，而选择NAD 或NADP 氧化还原辅因子是本领域的常规选择。因而在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求8、9、12也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求17-19对所述氨基转移酶、脂肪酸以及提供酶的形式，全细胞催化剂的相对于野生型的酶活性进行了进一步限定。然而，如前所述，对比文件1公开了使用转氨酶，并且还公开了恶臭假单胞菌中的操纵子，因而本领域技术人员选择已知的来自恶臭假单胞菌GB-1的氨基转移酶(数据库编号YP_001668026.1)或其变体也是容易想到和做到的。对比文件1公开了所述脂肪酸为月桂酸，全细胞为表达所需的单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、丙氨酸脱氢酶以及脂肪酶的大肠杆菌（参见对比文件1的实施例A），并且还公开了在恶臭假单胞菌中也就是在操纵子alkBFGHJKL中组织待克隆的基因alkB、alkG和alkJ，但是将其与针对醛脱氢酶进行编码的基因alkH分开，该酶可能会重新分解所需的中间产物，也就是月桂酸的醛，因此必须将其隔离在alkBGJ基因的克隆过程之外（参见对比文件1的第20页第8-12行），可见，对比文件1给出了降低所述全细胞催化剂内源醛脱氢酶活性的启示。而参见对权利要求1和2的评述，选择使用已知的，如泊库岛食烷菌SK2来源的所述细胞色素P450单加氧酶（数据库编号YP_691921）或其变体是本领域技术人员容易想到和获得的，因而在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求17-19也不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求20-22请求保护权利要求10-19中任一项的全细胞催化剂用于氧化和/或胺化脂肪酸或其酯的用途。如前所述，对比文件1公开了表达重组细胞色素P450单加氧酶、醇脱氢酶、ω-转氨酶、AlkL家族多肽、氨基酸脱氢酶的全细胞催化剂及其用于氧化和胺化月桂酸或者月桂酸甲酯转换成月桂内酰胺的用途（参见对比文件1的实施例A），因而本领域技术人员完全能够选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶并验证其效果。因而在其引用的权利要求10-19不具备创造性的情况下，获得权利要求20-22的技术方案，这对本领域技术人员来说也是显而易见的。因此，权利要求20-22所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
对复审请求人相关意见的评述
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：针对（1）技术启示的问题，如前所述，对比文件1的实施例A中具体公开了使用来自恶臭假单胞菌GPo1的烷烃羟化酶系alkBGT进行月桂酸或月桂酸甲酯的羟基化反应。而恶臭假单胞菌是一种常见的细菌，由此可见，对比文件1实际给出了使用细菌来源的单加氧酶的启示。对比文件1说明书第8页第6-18行还公开了优选的烷烃单加氧酶是源于恶臭假单胞菌GPo1经过alkBGT基因编码的烷烃单加氧酶，并紧接着进一步公开了可以作为烷烃单加氧酶使用的还有细胞色素-P450-单加氧酶，综合对比文件1上下文可以看出，对比文件1实际上给出了可以使用细菌来源的细胞色素P450单加氧酶氧化所述脂肪酸或其酯的教导，且对比文件1还具体使用了CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶是本领域常见的可用于氧化烷烃和脂肪酸的细胞色素P450单加氧酶（参见公知常识证据1），因而本领域技术人员有动机选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。即，选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶对于本领域技术人员而言是显而易见的。针对（2）和（3）技术效果方面，对比文件1也公开了利用恶臭假单胞菌GPo1的AlkBGT烷烃羟化酶系可以从月桂酸甲酯出发合成12-羟基月桂酸甲酯（参见对比文件1的实施例B，附图14），因而本领域技术人员能够在对比文件1的基础上预期，选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶也能够产生ω-羟基月桂酸甲酯。此外，本申请实施例也没有给出实验效果数据证实选择使用的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶能够产生任何预料不到的效果。虽然复审请求人提交了比较实施例，但由该附件的描述可知，复审请求人使用的是来自泊库岛食烷菌的CYP153单加氧酶连同其同源的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白氧化还原酶、以及来自食油假单胞菌的孔蛋白AlkL大肠杆菌W3110 pCOM[Ab_Fd / CYP153-2 / FdOR / alkL]的构建菌株与来自食油假单胞菌的单加氧酶AlkBGT以及来自食油假单胞菌的孔蛋白AlkL大肠杆菌W3110 pBT10_alkL的构建菌株进行比较，首先，比较的内容与本申请要求保护的技术方案并不匹配，比较的是一个具体的构建菌株，而本申请要求保护的是一个更大范围的构建体及其用途方法。其次，显然比较的菌株两者的差异不仅仅在于单加氧酶的选择，来自泊库岛食烷菌的CYP153单加氧酶还连同其同源的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白氧化还原酶，而对照菌株不含有其同源的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白氧化还原酶。再次，从附件的图2和3中可以明显看出，在相同的生物转化时间内，如18小时，菌株W3110 pBT10_alkL从LSME形成ω-羟基月桂酸甲酯（HLSME）的浓度大约为22g/l，明显高于菌株W3110 pCOM[Ab_Fd / CYP153-2 / FdOR / alkL]形成HLSME的浓大约为9 g/l。因而，并不能由此得出CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶相比于AlkBGT对于氧化脂肪酸特异性更高并且能够产生更多的ω-羟基月桂酸甲酯的结论。更重要的是，如前所述，在对比文件1和本领域公知的基础上，选择CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶对于本领域技术人员而言是非常显而易见的，其效果是本领域技术人员经过有限的试验即可得到的。综上所述，复审请求人陈述的理由不具有说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年08月03日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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