发明创造名称：一种尿液微量蛋白检测试剂盒及其检测方法
外观设计名称：
决定号：182180
决定日：2019-06-25
委内编号：1F254576
优先权日：
申请（专利）号：201610265806.2
申请日：2016-04-26
复审请求人：上海中信亚特斯诊断试剂有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李玉林
合议组组长：张苗
参审员：李璟
国际分类号：G01N33/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，如果该区别技术特征一部分被与本申请属于相同技术领域的另一篇对比文件公开，且该部分区别技术特征在该另一篇对比文件中所起作用与其在本申请中所起作用相同，另一部分区别技术特征属于本领域公知常识，则该权利要求相对于两篇对比文件与公知常识的结合不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610265806.2，名称为“一种尿液微量蛋白检测试剂盒及其检测方法”的发明专利申请（下称本申请），申请人为上海中信亚特斯诊断试剂有限公司。申请日为2016年04月26日，公开日为2016年08月31日。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年03月30日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1-9不具备专利法第22条第3款规定的创造性，其中引用了如下对比文件：
对比文件1：CN105181973A，公开日为2015年12月23日；
对比文件2：CN104820097A，公开日为2015年08月05日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2016年04月26日提交的说明书摘要、说明书附图第1-4页；2016年07月01日提交的说明书第1-19页；2017年11月30日提交的权利要求第1-9项。
驳回决定所针对的权利要求书全文如下：
“1. 一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，包括：
(1)藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液；
(2)由生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液；
(3)由链霉亲和素标记的藻红蛋白；
(4)校准品，至少包括七种微量蛋白混合液；
(5)缓冲液；
所述的七种微量蛋白为MA、TRF、β2-MG、α2-MG、α1-MG、Cystatin C、IgG；
所述的缓冲液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白和Proclin-300组成；其中，氯化钠的浓度为6.0-10.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.5-3.5g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.2-0.4g/L，牛血清白蛋白的浓度为8.0-12.0g/L，Proclin-300的浓度为0.01-0.03ml/L，Triton X-100的浓度为0.1-0.3ml/L；
所述的磁性荧光微球，其藕联时抗体浓度为：每106个磁性荧光微球，每种抗体用量为2-10ug；
所述的磁性荧光微球，通过如下方法制得：将磁性荧光微球在由MES、NHS和EDC组成的活化体系中活化处理15-20分钟，加磁场，静置分离5分钟，用MES洗涤3次后加入抗体2-10ug/106个荧光微球，室温藕联2小时后，用MES洗涤1遍除去游离的抗体，加入1％BSA溶液，置2-8℃冰箱封闭过夜，封闭结束后，用1％BSA溶液洗涤1遍，加入Proclin 300，2-8℃保存；
所述活化体系中，当微球数量为2.5×106时，MES的体积为230ul，EDC为10ul，NHS为10ul；或当微球数量为2.5×106时，MES的体积为480ul，EDC为10ul，NHS为10ul。
2. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液中，各种抗体微球的浓度均为100个/ul。
3. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液中，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:20-100。
4. 根据权利要求3所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50。
5. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液中，各种蛋白抗原的浓度如下：
6. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素标记的藻红蛋白的浓度为2mg/L。
7. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述的校准品，包括：
七种微量蛋白混合液S1，其中七种微量蛋白的浓度分别为：60mg/L的MA、50mg/L的TRF、2.5mg/L的β2-MG、90mg/L的α2-MG、70mg/L的α1-MG、3mg/L的Cystatin C，100mg/L的IgG；
七种微量蛋白混合液S2-S6，将所述混合液S1按照1:2或1:3梯度稀释后的系列校准品；以及，
缓冲液S7，作为空白参照。
8. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液中，氯化钠的浓度为8.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.9g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.296g/L，牛血清白蛋白的浓度为10.0g/L，Proclin-300的浓度为0.02ml/L，Triton X-100的浓度为0.2ml/L。
9. 使用权利要求1-8任一项所述的试剂盒联合检测尿液七种微量蛋白的方法，包括：
a.在酶标板微孔内加入10ul尿液样本，同时取校准品各10ul作为标准参照，其中缓冲液作为空白参照；
b.取生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液10ul加入酶标板微孔内，混合均匀；
c.取藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液10ul加入酶标板微孔内，震荡混匀后于37℃第一次孵育30分钟，孵育结束后在磁分离板上静置2-5钟后洗涤3遍；
d.取链霉亲和素标记的藻红蛋白20ul加入酶标板微孔内，混匀后置于37℃第二次孵育20分钟，孵育结束后在磁分离板上静置2-5钟后洗涤3遍；
e.加入50ul的缓冲液，Luminex 200仪器上读取平均荧光强度，测得七种尿微量蛋白的含量。 ”
驳回决定具体认为：1、权利要求1请求保护的是一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒。对比文件1公开了一种应用LUMINEX系统检测糖尿病肾病早期检测标记组合物的试剂盒及其使用方法，权利要求1相对于对比文件1的区别技术特征是：（1）尿微量蛋白标志物还包括α2-巨球蛋白(α2-MG)、胱抑素C(Cystatin C)、免疫球蛋白G(IgG)；（2）检测体系中具体试剂的限定，包括偶联有7种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液以及磁性荧光微球的制备、生物素标记的抗原混合液、校准品混合液以及缓冲液组分的限定。区别技术特征（2）的一部分被对比文件2公开了，区别技术特征（2）的其他部分以及区别技术特征（1）属于本领域的常用技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1、对比文件2以及本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-8的附加技术特征或被对比文件2公开了，或属于本领域的常用技术手段。当其引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求2-8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求9请求保护的是一种联合检测尿液七种微量蛋白的方法。对比文件1公开了使用Luminex系统对各组尿液中相关蛋白标记物分子的表达水平进行检测，权利要求9相对于对比文件1的区别技术特征是：检测步骤及实验参数的具体限定、检测试剂的具体限定，包括7种尿液微量蛋白抗体的磁性微球混合液、生物素标记抗原混合液、校准品。对于权利要求9中检测的7种微量蛋白标志物、偶联抗体的磁性荧光微球缓冲液，以及相应的生物素标记抗原混合液、校准品混合液和缓冲液的组成、含量已经在权利要求1-8的评述中详细阐释，在竞争法中，依次加入待测样本、标记抗原、偶联抗体的微球竞争形成复合物的过程对本领域技术人员而言是常规技术手段，而具体的样本量、孵育时间、温度、洗涤次数、磁分离等实验参数的调整和优化是本领域技术人员所应具备的实验技能。因此，权利要求9相对于对比文件1、对比文件2以及本领域公知常识的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年06月25日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了权利要求书的全文修改替换页。修改涉及：将权利要求7的附加技术特征“所述的校准品，包括七种微量蛋白混合液S1，其中七种微量蛋白的浓度分别为：60mg/L的MA、50mg/L的TRF、2.5mg/L的β2-MG、90mg/L的α2-MG、70mg/L的α1-MG、3mg/L的Cystatin C，100mg/L的IgG；七种微量蛋白混合液S2-S6，将所述混合液S1按照1:2或1:3梯度稀释后的系列校准品；以及缓冲液S7，作为空白参照”增加至权利要求1中，删除了权利要求7，并对权利要求的编号和引用关系进行了适应性修改。复审请求人认为：1）本申请中的试剂盒能够全面检测肾脏的不同损伤程度，7个蛋白的分子量形成一定梯度，可全面的对肾小球的过滤能力进行检测，越大分子量的蛋白在尿液中被检测到，肾脏的损伤程度越严重。2）对比文件1是对多个蛋白进行分别的检测，对比文件2是在一个反应体系中检测一个蛋白，而本申请是一管式检测多个蛋白的方法。并且，为了避免检测蛋白之间的相互干扰，本申请采用竞争法（生物素标记抗原），而不是夹心法（生物素标记抗体）。3）本申请中包含对检测体系中具体试剂的限定，在说明书实施例中详细加载了各个参数的优化过程，期间进行了大量的组合尝试，最终获得了可用于临床检测的水平。4）复审请求人提供附件材料证明本申请是上海市科委重大研究项目研究成果的一部分并且准备申报进入临床。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年07月02日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年02月12日发出复审通知书，在复审通知书中提出如下审查意见：1、权利要求1请求保护的是一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒。对比文件1公开了一种应用LUMINEX系统检测糖尿病肾病早期检测标记组合物的试剂盒及其使用方法，权利要求1相对于对比文件1的区别技术特征是：（1）尿微量蛋白标志物还包括α2-巨球蛋白(α2-MG)、胱抑素C(Cystatin C)、免疫球蛋白G(IgG)；（2）具体试剂的限定，包括偶联有7种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液以及磁性荧光微球的制备、由生物素标记的7种微量蛋白抗原混合液、包括7种微量蛋白的校准品混合液以及缓冲液组分的限定；磁性荧光微球的制备具体包括：磁性荧光微球藕联时抗体浓度为：每106个磁性荧光微球，每种抗体用量为2-10ug；所述的磁性荧光微球，通过如下方法制得：将磁性荧光微球在由MES、NHS和EDC组成的活化体系中活化处理15-20分钟，加磁场，静置分离5分钟，用MES洗涤3次后加入抗体2-10ug/106个荧光微球，室温藕联2小时后，用MES洗涤1遍除去游离的抗体，加入1％BSA溶液，置2-8℃冰箱封闭过夜，封闭结束后，用1％BSA溶液洗涤1遍，加入Proclin 300，2-8℃保存；所述活化体系中，当微球数量为2.5×106时，MES的体积为230ul，EDC为10ul，NHS为10ul；或当微球数量为2.5×106时，MES的体积为480ul，EDC为10ul，NHS为10ul。缓冲液组分的限定为：所述的缓冲液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白和Proclin-300组成；其中，氯化钠的浓度为6.0-10.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.5-3.5g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.2-0.4g/L，牛血清白蛋白的浓度为8.0-12.0g/L，Proclin-300的浓度为0.01-0.03ml/L，Triton X-100的浓度为0.1-0.3ml/L。校准品混合液组分的限定为：包括七种微量蛋白混合液S1，其中七种微量蛋白的浓度分别为：60mg/L的MA、50mg/L的TRF、2.5mg/L的β2-MG、90mg/L的α2-MG、70mg/L的α1-MG、3mg/L的Cystatin C，100mg/L的IgG；七种微量蛋白混合液S2-S6，将所述混合液S1按照1:2或1:3梯度稀释后的系列校准品；以及缓冲液S7，作为空白参照。区别技术特征（2）的一部分被对比文件2公开了，区别技术特征（2）的其他部分以及区别技术特征（1）属于本领域的常用技术手段。因此，权利要求1相对于对比文件1、对比文件2以及本领域常用技术手段的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。2、从属权利要求2-7的附加技术特征属于本领域的常用技术手段。当其引用的权利要求不具备创造性时，从属权利要求2-7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。3、权利要求8请求保护的是一种联合检测尿液七种微量蛋白的方法。对比文件1公开了使用LUMINEX系统对各组尿液中相关蛋白标记物分子的表达水平进行检测，权利要求8相对于对比文件1的区别技术特征是：检测步骤及实验参数的具体限定、检测试剂的具体限定，包括7种尿液微量蛋白抗体的磁性微球混合液、生物素标记抗原混合液、校准品。对于权利要求8中检测的7种微量蛋白标志物、偶联抗体的磁性荧光微球缓冲液，以及相应的生物素标记抗原混合液、校准品混合液和缓冲液的组成、含量可参见针对权利要求1-7的评述。在竞争法中，依次加入待测样本、标记抗原、偶联抗体的微球竞争形成复合物的过程对本领域技术人员而言是常规技术手段，而具体的样本量、孵育时间、温度、洗涤次数、磁分离等实验参数的调整和优化是本领域技术人员所应具备的实验技能。因此，权利要求8相对于对比文件1、对比文件2以及本领域常用技术手段的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。4、针对复审请求人的意见陈述进行了答复。
复审请求人于2019年03月26日提交了复审无效宣告程序意见陈述书，并提交了权利要求书的全文修改替换页。修改涉及：将权利要求4中的技术特征“所述生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50”增加至权利要求1中，删除了权利要求3、4，并对权利要求的编号进行了适应性修改。修改后的权利要求书全文如下：
“1. 一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，包括：
(1)藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液；
(2)由生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液，所述生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50；
(3)由链霉亲和素标记的藻红蛋白；
(4)校准品，至少包括七种微量蛋白混合液；
(5)缓冲液；
所述的七种微量蛋白为MA、TRF、β2-MG、α2-MG、α1-MG、Cystatin C、IgG；
所述的缓冲液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白和Proclin-300组成；其中，氯化钠的浓度为6.0-10.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.5-3.5g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.2-0.4g/L，牛血清白蛋白的浓度为8.0-12.0g/L，Proclin-300的浓度为0.01-0.03ml/L，Triton X-100的浓度为0.1-0.3ml/L；
所述的磁性荧光微球，其藕联时抗体浓度为：每106个磁性荧光微球，每种抗体用量为2-10ug；
所述的磁性荧光微球，通过如下方法制得：将磁性荧光微球在由MES、NHS和EDC组成的活化体系中活化处理15-20分钟，加磁场，静置分离5分钟，用MES洗涤3次后加入抗体2-10ug/106个荧光微球，室温藕联2小时后，用MES洗涤1遍除去游离的抗体，加入1％BSA溶液，置2-8℃冰箱封闭过夜，封闭结束后，用1％BSA溶液洗涤1遍，加入Proclin300，2-8℃保存；
所述活化体系中，当微球数量为2.5×106时，MES的体积为230ul，EDC为10ul，NHS为10ul；或当微球数量为2.5×106时，MES的体积为480ul，EDC为10ul，NHS为10ul；
所述的校准品，包括七种微量蛋白混合液S1，其中七种微量蛋白的浓度分别为：60mg/L的MA、50mg/L的TRF、2.5mg/L的β2-MG、90mg/L的α2-MG、70mg/L的α1-MG、3mg/L的Cystatin C，100mg/L的IgG；七种微量蛋白混合液 S2-S6，将所述混合液S1按照1:2或1:3梯度稀释后的系列校准品；以及缓冲液S7，作为空白参照。
2. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液中，各种抗体微球的浓度均为100个/ul。
3. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液中，各种蛋白抗原的浓度如下：
4. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素标记的藻红蛋白的浓度为2mg/L。
5. 根据权利要求1所述的一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液中，氯化钠的浓度为8.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.9g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.296g/L，牛血清白蛋白的浓度为10.0g/L，Proclin-300的浓度为0.02ml/L，Triton X-100的浓度为0.2ml/L。
6. 使用权利要求1-7任一项所述的试剂盒联合检测尿液七种微量蛋白的方法，包括：
a.在酶标板微孔内加入10ul尿液样本，同时取校准品各10ul作为标准参照，其中缓冲液作为空白参照；
b.取生物素标记的七种微量蛋白抗原混合液10ul加入酶标板微孔内，混合均匀；
c.取藕联有七种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液10ul加入酶标板微孔内，震荡混匀后于37℃第一次孵育30分钟，孵育结束后在磁分离板上静置2-5钟后洗涤3遍；
d.取链霉亲和素标记的藻红蛋白20ul加入酶标板微孔内，混匀后置于37℃第二次孵育20分钟，孵育结束后在磁分离板上静置2-5钟后洗涤3遍；
e.加入50ul的缓冲液，Luminex200仪器上读取平均荧光强度，测得七种尿微量蛋白的含量。”
复审请求人认为：1）对比文件2所涉及的样品是“人体血浆”，而对比文件1所涉及的样品是“尿液”，两篇对比文件的技术方案在本领域技术人员看来是没有结合在一起的可能性；2）利用LUMINEX技术检测蛋白质时, 用生物素标记抗原不是本领域的常用技术手段；本申请为了避免检测蛋白之间的相互干扰，采用竞争法（生物素标记抗原），而不是夹心法（生物素标记抗体），特别是“生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50”取得了意想不到的技术效果；3）本申请中的试剂盒能够全面检测肾脏的不同损伤程度，7个蛋白的分子量形成一定梯度，可全面的对肾小球的过滤能力进行检测，越大分子量的蛋白在尿液中被检测到，肾脏的损伤程度越严重。4）对比文件1是对多个蛋白进行分别的检测，对比文件2是在一个反应体系中检测一个蛋白，而本申请是一管式检测多个蛋白的方法。5）本申请中包含对检测体系中具体试剂的限定，在说明书实施例中详细加载了各个参数的优化过程，期间进行了大量的组合尝试，最终获得了可用于临床检测的水平。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在2018年06月25日提出复审请求时以及2019年03月26日对申请文件进行了修改。经查，上述修改符合专利法第33条的规定。本复审请求审查决定针对的审查文本为：申请日2016年04月26日提交的说明书摘要、说明书附图第1-4页；2016年07月01日提交的说明书第1-19页；2019年03月26日提交的权利要求第1-6项。
2、关于创造性
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
权利要求请求保护的技术方案与作为最接近的现有技术的对比文件相比存在区别技术特征，如果该区别技术特征一部分被与本申请属于相同技术领域的另一篇对比文件公开，且该部分区别技术特征在该另一篇对比文件中所起作用与其在本申请中所起作用相同，另一部分区别技术特征属于本领域公知常识，则该权利要求相对于两篇对比文件与公知常识的结合不具备创造性。
具体到本案：
1）权利要求1不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求1请求保护的是一种尿液七种微量蛋白联合检测试剂盒。对比文件1公开了一种应用LUMINEX系统检测糖尿病肾病早期检测标记组合物的试剂盒及其使用方法（参见说明书第5-24段、权利要求4，6），所述糖尿病肾病蛋白标记物选自尿转铁蛋白、β2-微球蛋白(β2-MG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、微量白蛋白(MA1b)等23种糖尿病肾病蛋白标志物中的至少3种，优选至少5种；所述试剂盒包括糖尿病肾病早期检测蛋白标记物抗体、荧光羧基微球、羧基微球偶联试剂、streptavidin-phycoerythrin (即链霉亲和素标记的藻红蛋白)标记抗体、糖尿病肾病早期检测蛋白标记物的标准品和洗液等。
权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征在于：（1）尿微量蛋白标志物还包括α2-巨球蛋白(α2-MG)、胱抑素C(Cystatin C)、免疫球蛋白G(IgG)；（2）具体试剂的限定，包括偶联有7种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液以及磁性荧光微球的制备、由生物素标记的7种微量蛋白抗原混合液、包括7种微量蛋白的校准品混合液以及缓冲液组分的限定；生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50；磁性荧光微球的制备具体包括：磁性荧光微球藕联时抗体浓度为：每106个磁性荧光微球，每种抗体用量为2-10ug；所述的磁性荧光微球，通过如下方法制得：将磁性荧光微球在由MES、NHS和EDC组成的活化体系中活化处理15-20分钟，加磁场，静置分离5分钟，用MES洗涤3次后加入抗体2-10ug/106个荧光微球，室温藕联2小时后，用MES洗涤1遍除去游离的抗体，加入1％BSA溶液，置2-8℃冰箱封闭过夜，封闭结束后，用1％BSA溶液洗涤1遍，加入Proclin 300，2-8℃保存；所述活化体系中，当微球数量为2.5×106时，MES的体积为230ul，EDC为10ul，NHS为10ul；或当微球数量为2.5×106时，MES的体积为480ul，EDC为10ul，NHS为10ul。缓冲液组分的限定为：所述的缓冲液由氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、牛血清白蛋白和Proclin-300组成；其中，氯化钠的浓度为6.0-10.0g/L，磷酸氢二钠的浓度为2.5-3.5g/L，磷酸二氢钠的浓度为0.2-0.4g/L，牛血清白蛋白的浓度为8.0-12.0g/L，Proclin-300的浓度为0.01-0.03ml/L，Triton X-100的浓度为0.1-0.3ml/L。校准品混合液组分的限定为：包括七种微量蛋白混合液S1，其中七种微量蛋白的浓度分别为：60mg/L的MA、50mg/L的TRF、2.5mg/L的β2-MG、90mg/L的α2-MG、70mg/L的α1-MG、3mg/L的Cystatin C，100mg/L的IgG；七种微量蛋白混合液S2-S6，将所述混合液S1按照1:2或1:3梯度稀释后的系列校准品；以及缓冲液S7，作为空白参照。基于上述区别技术特征可以确定发明实际解决的技术问题是如何检测尿液中的7种特定的尿微量蛋白。
对于区别技术特征（1），对比文件1公开了采用LUMINEX技术，采用LUMINEX技术在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析（参见说明书第5段）。在对比文件1的教导下，当本领域技术人员面对需要检测尿液中的多种特定的尿微量蛋白从而来进行肾病综合全面诊断时，有动机采用对比文件1所述的LUMINEX液相芯片技术，实现一次性联合检测7种尿微量蛋白。对比文件1公开了权利要求1所述7种蛋白中的β2-微球蛋白(β2-MG)、α1-微球蛋白(α1-MG)、微量白蛋白(MA1b)，对于对比文件1没有公开的其他尿微量蛋白：α2-巨球蛋白是临床判定患者肾实质性病变损害不可逆性的指标或作为肾后性血尿的标志物；胱抑素C是评定肾小球过滤GFR的指标；IgG与肾小球病变的严重程度相关，上述尿微量蛋白均是本领域常用的肾脏病变标志物，是针对尿液检测时本领域的常规选择。将上述标志物与对比文件1公开的标志物进行组合对本领域技术人员而言不需要克服技术上的难题，并且所述蛋白标志物组合物并未产生本领域技术人员预料不到的技术效果。
对于区别技术特征（2），对比文件2公开了一种定量检测样本中脂蛋白磷脂酶A2浓度的液体芯片试剂盒及其制备方法，所述试剂盒中包括磁性荧光微球标记的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体（参见权利要求1-2）；所述磁性荧光微球的制备包括以下步骤：将未包被的微球中加入磷酸二氢钠缓冲液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液和碳二亚胺溶液进行活化，然后加入特异性的抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体1-125μg在4-8℃进行包被；洗涤；再加入含1-10％质量分数的动物血清蛋白的封闭液进行封闭；最后在10-100mM磷酸盐缓冲液中避光、4-8℃存放（参见权利要求8）；对比文件2还进一步公开了应用于液体芯片检测系统中的标准品稀释液，所述标准品稀释液是在pH7.0-7.4、浓度为 10-100mM磷酸盐缓冲液中，分别加入1-10％质量分数的动物血清、 0.01-0.5％质量分数的防腐剂Proclin 300、1-10％质量分数的蛋白保护剂牛血清白蛋白、0.05-1％ 质量分数的表面活性剂Triton X -100混合而成（参见说明书第10-15段）；对比文件2公开了包被有抗脂蛋白磷脂酶A2的单克隆抗体的微球，每106个磁性荧光微球，抗体的用量是2-50μg（参见说明书第6段）。可见，对比文件2给出了在液相芯片检测系统中使用偶联有标记抗体的磁性荧光微球的技术启示，并进一步教导了所述磁性荧光微球的制备方法，所述磁性荧光微球在对比文件2中所起的作用与其在权利要求1所述技术方案中所起的作用相同，都是用于标记抗体，由于微球带有磁性，因此避免了人工使用滤过板，使得整个检测过程可以自动完成，提高了检测速率。在对比文件2的启示下，本领域技术人员有动机对对比文件1中所述的羧基微球进行改进，在液相芯片检测体系中使用磁性荧光微球标记尿液微量蛋白抗体，本领域技术人员获得能够用于液相芯片检测系统中的磁珠不需要付出创造性的劳动。而磁性荧光微球的活化是本领域技术人员所应具备的常规实验技能，MES作为缓冲液和洗涤液，NHS和EDC作为活化剂以及Proclin 300作为防腐剂等均是本领域的常规选择。对于缓冲液和活化剂含量比例、抗体浓度、包被温度、施加磁场等是本领域常规的实验参数优化，上述选择与优化对本领域技术人员而言不需要付出创造性的劳动。
权利要求1中所述检测体系中使用的生物素标记抗原，不同于对比文件中的生物素标记抗体。对本领域技术人员而言，夹心法和竞争法均是蛋白质检测领域的常规技术手段。通过生物素标记抗原与样本中的待测抗原和磁性荧光微球上偶联的抗体竞争结合，从而实现对目的蛋白的检测对本领域技术人员而言不需要克服技术上的难题，同时也没有产生预料不到的技术效果。生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50均属于本领域的常规选择。
根据检测标志物的不同，相应地替换抗原、校准品是本领域技术人员所具备的常规实验技能。由于涉及多种蛋白质标志物，将偶联抗体的磁性荧光微球、生物素标记的抗原、校准品分别配制成混合液从而方便使用，这对本领域技术人员而言不需要付出创造性的劳动。
对比文件2公开了标准品稀释液中包含磷酸盐缓冲液、防腐剂Proclin 300、牛血清白蛋白以及表面活性剂Triton X-100（参见权利要求6）。对本领域技术人员而言，使用氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠配制磷酸盐缓冲液是本领域的常规技术手段，对缓冲液中各组分、含量的优化是本领域技术人员所具备的基本实验技能。权利要求1中所述缓冲液对本领域技术人员而言不需要克服技术上的难题，同时也未能产生预料不到的技术效果。
对比文件2公开了使用梯度浓度的抗原标准品和质控品（参见说明书第18段）。针对不同的检测物质，选择不同的初始浓度和不同的稀释梯度制备标准品并设置空白对照对本领域技术人员而言不需要付出创造性的劳动。
因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域常用技术手段得到权利要求1中所述的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
2）权利要求2不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2对其引用的权利要求进行了进一步的限定。藕联有多种微量蛋白抗体的磁性荧光微球混合液中，各种抗体微球的浓度均为100个/ul属于本领域的常规选择。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
3）权利要求3-5不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求3-5对其引用的权利要求进行了进一步的限定。对本领域技术人员而言，各种生物素标记抗原的浓度，链霉亲和素标记的藻红蛋白的浓度，以及缓冲液各个组分、含量的优化是根据具体的检测蛋白不同而对液相芯片检测体系中的成分进行的适应性调整，所述调整过程应是本领域技术人员所应具备的常规实验技能，优化得到权利要求中所述的技术方案对本领域技术人员而言不需要克服技术上的难题，也没有产生预料不到的技术效果。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求3-5也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
4）权利要求6不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求6请求保护的是一种联合检测尿液七种微量蛋白的方法。对比文件1公开了使用LUMINEX系统对各组尿液中相关蛋白标记物分子的表达水平进行检测（参见说明书第19段）。所述检测方法包括：（1）选取受试者尿液；（2）使用200μl检测缓冲液预湿试验板，置于振荡器振摇10分钟后应用负压吸引器吸走试验板中的液体；（3）然后分别加入30μl梯度稀释的标准品、对照和样品；（3）随后加入30μl抗体标记的荧光羧基微球，封板后将试验板置于振荡器振摇4℃孵育过夜；（4）洗板后加入检测抗体，室温振荡试验板1小时；（5）再加入streptavidin-phycoerythrin标记抗体，孵育30分钟，洗板后在LUMINEX200上机检测，MILLIPLEX ANALYST软件分析。
权利要求6所要求保护的技术方案与对比文件1相比，区别技术特征在于：检测步骤及实验参数的具体限定、检测试剂的具体限定，包括7种尿液微量蛋白抗体的磁性微球混合液、生物素标记抗原混合液、校准品。基于上述区别技术特征可以确定发明实际解决的技术问题是如何检测尿液中7种特定的尿微量蛋白。
对于权利要求6中检测的7种微量蛋白标志物、偶联抗体的磁性荧光微球缓冲液，以及相应的生物素标记抗原混合液、校准品混合液和缓冲液的组成、含量已经在权利要求1-5的评述中详细阐释，此处不再赘述。在竞争法中，依次加入待测样本、标记抗原、偶联抗体的微球竞争形成复合物的过程对本领域技术人员而言是常规技术手段，而具体的样本量、孵育时间、温度、洗涤次数、磁分离等实验参数的调整和优化是本领域技术人员所应具备的实验技能。在对比文件1的基础上结合对比文件2和本领域常用技术手段得到权利要求6所请求保护的技术方案对本领域技术人员而言是显而易见的，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求6不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、针对复审请求人意见陈述的答复
对于复审请求人答复复审通知书时的意见陈述，合议组认为：1）对比文件1和对比文件2中均采用LUMINEX技术对样品进行检测，LUMINEX技术同时适用于血浆样品和尿液样品，本领域技术人员可根据检测需要来选择样品，将对比文件1和对比文件2结合并不存在技术障碍；2）液相芯片技术在蛋白水平上的检测基础是抗原抗体反应，常用的免疫学反应原理有夹心法和竞争法，在液相芯片中也可以使用这些常用的免疫学含量检测模式，并不存在技术障碍。针对多种待检测物的检测体系，相互之间没有干扰并且检测体系稳定是对检测试剂盒的普遍需求；具体到特定的蛋白质检测，本领域技术人员可以根据情况进行选择，当采用常用的夹心法不能获得较好的技术效果时，进一步采用竞争法对本领域技术人员而言并不需要付出创造性的劳动。而生物素为琥珀酰亚胺酯，每种蛋白抗原与生物素的摩尔比为1:50均属于本领域的常规选择，并未取得预料不到的技术效果；3）根据发生的病理生理机制不同，肾损伤可以分为肾小球性、肾小管性、组织性等，肾小球性尿微量蛋白以中高分子量蛋白质（60-500kD）为主，组成成分为白蛋白和球蛋白，如转铁蛋白、免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM）、α2-巨球蛋白和C3等，肾小管性标志物以低分子量蛋白（低于50kD）为主，如β2-微球蛋白、α1-微球蛋白、胱抑素C等。本申请所述7种蛋白均是肾损伤的常见检测指标，所述尿蛋白的组合并没有取得预料不到的技术效果。4）对比文件1说明书第5段记载了LUMINEX技术在一次实验中可以同时完成多个目标分子的检测，并具体介绍了检测原理。根据对比文件1公开了内容可知，所述检测是同时对同一样本中的多个指标参数进行的定性定量检测，并不是复审请求人所述的分别检测。虽然对比文件2只检测一个蛋白，但是对比文件2还公开了可自由组合增加检测标记物的种类，实现多标志物同时检测（参见说明书第25，26段），同时，对比文件2给出了在液相芯片检测系统中使用磁性荧光微球标记抗体的技术启示。5）对于试剂盒中缓冲液、校准品和生物素化抗原等组分浓度的调整，本领域技术人员可以通过本领域常用的正交试验、棋盘试验等技术手段优化得到。制备磁微粒标记的抗体是本领域的常规技术手段，对比文件2也教导了制备方法，在对比文件2的基础上，根据待检测物不同，调整抗体种类、抗体用量、活化剂以及活化条件等对本领域技术人员而言是显而易见的。对上述实验参数的调整不需要付出创造性的劳动。对于复审请求人所述的技术效果，液相芯片技术具有高通量、灵敏度高等优点是本领域的公知常识，本申请所请求保护的技术方案并没有取得预料不到的技术效果。
综上所述，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
根据以上事实和理由，本案合议组依法作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年03月30日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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