发明创造名称：检测高油酸花生FAD2A和FAD2B基因位点突变基因型的引物及其PCR检测方法
外观设计名称：
决定号：182148
决定日：2019-06-25
委内编号：1F237168
优先权日：
申请（专利）号：201410642798.X
申请日：2014-11-14
复审请求人：河南省农业科学院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李洋
合议组组长：李康琦
参审员：幸颖
国际分类号：C12Q1/68,C12N15/11
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明与最接近对比文件的区别技术特征为公知常识，例如教科书或者工具书等中披露的解决发明实际解决的技术问题的技术手段，则认为现有技术中已经给出将该区别特征应用到该最接近的对比文件以解决该技术问题的启示，发明是显而易见的，不具有突出的实质性特点，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410642798.X，名称为“检测高油酸花生FAD2A和FAD2B基因位点突变基因型的引物及其PCR检测方法”的发明专利申请。申请人为河南省农业科学院。本申请的申请日为2014年11月14日，公开日为2015年02月04日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月27日发出驳回决定，驳回了本发明专利申请，其理由是：权利要求1-2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为：申请日2014年11月14日提交的说明书第1-32段、说明书附图图1-图4、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表；以及2017年02月10日提交的权利要求第1-2项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：
(1)检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变的引物设计：
当检测ahFAD2A基因448bp处无突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-WT-R；
FAD2A-F：5’......GATTACTGATTATTGACTT......3'，
FAD2A-WT-R：5’......GTTTTGGGACAAACACTTCACC......3’；
当检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生突变型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-Mu-R；
FAD2A-F：5’......GATTACTGATTATTGACTT......3’，
FAD2A-Mu-R：5’......GTTTTGGGACAAACACTTAGAT......3’；
(2)检测ahFAD2B基因442bp位点突变的引物设计：
当检测ahFAD2B基因442bp位点无碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-WT-R；
FAD2B-F：5’......CAGAACCATTAGCTTTG......3’，
FAD2B-WT-R：5’......GACAAACACTTCGTCGCGTTAG......3’；
当检测ahFAD2B基因442bp位点有碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生突变型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-Ins-R；
FAD2B-F：5’......CAGAACCATTAGCTTTG......3’，
FAD2B-Ins-R：5’......GACAAACACTTCGTCGCGTTAT......3’；
利用所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR检测方法，该方法包括以下步骤：
(1)PCR扩增：PCR反应体系总体积为10μL，包括1U的DNA聚合酶、1倍浓度的反应buffer，0.4mM dNTPs，上下游引物各3μM，20ng的DNA样本；
所述上下游引物为FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R四对中的一对；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，45.9℃退火30s，72℃延伸45s，30或35次循环；最后72℃延伸10min；
(2)电泳检测：将四对引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；
(3)电泳后在凝胶成像仪中检测PCR产物，组合分析四对引物的电泳结果，得到样本对应的基因型；
其中引物FAD2A-F和FAD2A-WT-R的PCR反应为30次循环，FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R的PCR反应为35次循环。
2. 权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物在回交育种和基因型鉴定中的应用。”
驳回决定认为：对比文件1公开了用于扩增ahFAD2基因的引物序列，其中引物aF19与本申请中的引物FAD2A-F一致，引物bF19与本申请中的引物FAD2B-F一致。由于引物具体的使用方法不会改变引物产品的结构和组成，因此权利要求1与对比文件1的区别在于引物对的下游引物不同。而对比文件1还公开了：Yu(2008)等用辐射诱变的方法获得了4份油酸含量75%以上的高油酸花生突变体材料，并通过同源克隆法比较和分析了突变体及其原始亲本材料的FAD2基因序列，发现FAD2B基因在442bp的A插入产生了译码突变和终止密码子，导致编码蛋白质失活，并且突变体FAD2A基因也存在448bp的点突变，导致氨基酸改变，编码蛋白质活性降低。在此基础上，本领域技术人员为了进行检测与高油酸相关的基因有动机针对上述突变区域进行检测，而分别设计针对野生型和突变型且包含突变区域的引物也是本领域检测等位基因时的常规方法，其效果也是可以预期的。设计引物的过程是本领域的常规技术手段，本领域技术人员能够对所设计的引物进行常规的调整。因而在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，也未产生预料不到的效果，因此权利要求1不具备创造性。权利要求2请求保护权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物在回交育种和基因型鉴定中的应用。而将与高油酸性状相关的检测引物用于回交育种和基因型鉴定是本领域的常规技术手段，因此权利要求2也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月10日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了权利要求书的修改替换页（共2页3项），其中所作修改为：将权利要求1中涉及检测方法的内容拆分出来作为新的独立权利要求2。经修改的权利要求书如下：
“1. 一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：
（1）检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变的引物设计：
当检测ahFAD2A基因448bp处无突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生野生型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-WT-R；
FAD2A-F：5’…...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-WT-R：5’…...GTTTTGGGACAAACACTTCACC…...3’；
当检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变时，在花生野生型FAD2A基因序列-88bp处设计正向引物FAD2A-F，在花生突变型FAD2A基因序列448bp处设计反向引物FAD2A-Mu-R；
FAD2A-F：5’…...GATTACTGATTATTGACTT…...3’，
FAD2A-Mu-R：5’…...GTTTTGGGACAAACACTTAGAT…...3’；
（2）检测ahFAD2B基因442bp位点突变的引物设计：
当检测ahFAD2B基因442bp位点无碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因序列-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生野生型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-WT-R；
FAD2B-F：5’…...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-WT-R：5’…...GACAAACACTTCGTCGCGTTAG…...3’；
当检测ahFAD2B基因442bp位点有碱基插入时，在花生野生型FAD2B基因-80bp处设计正向引物FAD2B-F，在花生突变型FAD2B基因序列442bp处设计反向引物FAD2B-Ins-R；
FAD2B-F：5’…...CAGAACCATTAGCTTTG…...3’，
FAD2B-Ins-R：5’…...GACAAACACTTCGTCGCGTTAT…...3’。
2. 一种利用权利要求1所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）PCR扩增：PCR反应体系总体积为10μL，包括1U的DNA聚合酶、1倍浓度的反应buffer，0.4 mM dNTPs，上下游引物各3μM，20ng的DNA样本；
所述上下游引物为FAD2A-F和FAD2A-WT-R、FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R四对中的一对；
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，45.9℃退火30s，72℃延伸45s，30或35次循环；最后72℃延伸10min；
（2）电泳检测：将四对引物的PCR产物分别进行琼脂糖凝胶电泳；
（3）电泳后在凝胶成像仪中检测PCR产物，组合分析四对引物的电泳结果，得到样本对应的基因型；
其中引物FAD2A-F和FAD2A-WT-R的PCR反应为30次循环，FAD2A-F和FAD2A-Mu-R、FAD2B-F和FAD2B-WT-R、FAD2B-F和FAD2B-Ins-R的PCR反应为35次循环。
3. 权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物在回交育种和基因型鉴定中的应用。”
复审请求人认为：（1）本申请仅需琼脂糖电泳条带就能基因分型，而对比文件1的引物只是用于扩增测序，不具有扩增产物分型的作用；（2）目前关于FAD2检测突变位点的方法存在种种缺陷，而本申请利用扩增条带分型进行突变位点检测，能够准确区分9种基因型，检测效果好，具有不可替代的科研价值。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年11月27日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，新修改的权利要求2与申请日提交的权利要求3一致，参见第一次审查意见通知书可知，该权利要求不具备创造性。对于复审请求人的意见陈述，在检测等位基因分型时，分别设计针对野生型和突变型且包含突变区域的引物，利用扩增条带分型是本领域的常规方法，基于该方法可以使检测结果无需测序仅通过电泳的条带即可获知基因型，也是本领域普遍周知的，且在设计引物过程中为了提高特异性而引入错配碱基也是本领域的常规技术手段，本申请并未验证所设计的引物或使用的方法获得了何种预料不到的技术效果。申请日之前未见相关报道，仅能说明该技术方案具备新颖性，不能说明该技术方法不容易实现。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月28日向复审请求人发出复审通知书，指出：对比文件1公开了用于扩增ahFAD2基因的引物序列，其中引物aF19与本申请中的引物FAD2A-F一致，引物bF19与本申请中的引物FAD2B-F一致。权利要求1与对比文件1的区别在于引物对的反向引物不同，其中检测ahFAD2A基因野生型和突变型的下游引物是在花生野生型FAD2A基因序列的448bp处设计，检测ahFAD2B基因野生型和突变型的下游引物是在花生野生型FAD2B基因序列的442bp处设计。而对比文件1还公开了多篇现有技术表明本领域普遍知晓高油酸花生中存在ahFAD2A基因448bp处的突变和ahFAD2B基因442bp处的插入。在对比文件1的教导下，本领域技术人员有动机针对上述突变区域设计引物进行检测，而将突变位点设计在引物3’最末端以及引物加入错配碱基从而进行AS-PCR是本领域检测等位基因时的常规技术手段。因此权利要求1不具备创造性。由于PCR具体的扩增体系、反应条件是本领域技术人员利用常规技术手段进行有限调整即可获得的，因此在权利要求1所述引物是显而易见的基础上，权利要求2的PCR检测方法也不具备创造性。权利要求3请求保护权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物在回交育种和基因型鉴定中的应用。由于权利要求1所述引物是显而易见的，而对比文件1还公开了对花生亲本进行FAD2A等基因型鉴定以筛选亲本材料从而提高杂交育种效率的体系，因此本领域技术人员容易想到将与高油酸性状相关的FAD2A和FAD2B进行检测以用于回交育种和基因型鉴定，权利要求3也不具备创造性。
针对复审通知书，复审请求人于2019年03年05日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人在意见陈述书中认为：（1）本申请与对比文件1所要解决的技术问题、技术方案与技术效果均差异很大：本申请仅需琼脂糖电泳条带就能基因分型，提供的PCR引物能够确定高油酸基因型，具有准确度高、成本低、结果稳定的效果；而对比文件1仅仅公开了高油酸花生中存在这两种突变，并没有针对突变/插入位点进行研究，所设计的引物仅是用于扩增ahFAD2基因以用于测序，其扩增结果不具有本申请的突变位点检测和基因分型的作用；（2）以原理评判创造性，或者以引物设计属于常规技术手段来否定专利申请的创造性是不合适的，本申请设计了AS-PCR引物并在引物不同位置引入不同的错配碱基，提高了识别突变位点的特异性，特异性和准确性非常高，与测序结果完全一致，达到100%的最好技术效果，因而具备创造性；（3）创造性的评判应当避免“事后诸葛亮”和主观因素的影响。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
决定的理由
1. 审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书的全文替换页（共2页3项），经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定，复审请求人在答复复审通知书时未修改申请文件。因此，本复审请求审查决定依据的审查文本如下：申请日2014年11月14日提交的说明书第1-32段、说明书附图图1-图4、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表；以及2017年11月10日提交的权利要求第1-3项。
2. 关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果发明与最接近对比文件的区别技术特征为公知常识，例如教科书或者工具书等中披露的解决发明实际解决的技术问题的技术手段，则认为现有技术中已经给出将该区别特征应用到该最接近的对比文件以解决该技术问题的启示，发明是易而易见的，不具有突出的实质性特点，不具备创造性。
具体在本案中，权利要求1请求保护一种检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物。对比文件1（雷永，“花生高油酸的分子遗传机制及其高效遗传改良体系构建”，《中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑》，2010年第10期，第D047-45页，公开日2010年10月15日）公开了用于扩增ahFAD2基因的引物序列及其5’位置，如下：
其中引物aF19与本申请中的引物FAD2A-F一致，引物bF19与本申请中的引物FAD2B-F一致（参见对比文件1表3-2）。权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的技术内容相比，其区别在于：引物对的反向引物不同，其中检测ahFAD2A基因野生型和突变型的下游引物是在花生野生型FAD2A基因序列的448bp处设计，检测ahFAD2B基因野生型和突变型的下游引物是在花生野生型FAD2B基因序列的442bp处设计。基于该区别技术特征可以确定，权利要求1相对于对比文件1实际解决的技术问题是：提供能够检测ahFAD2A基因448bp处碱基突变和ahFAD2B基因442bp处碱基突变的引物组。
对于上述区别技术特征，对比文件1还公开了：Patel（2004）通过诱变育种获得了高油酸花生Florunner和M2-225，证实突变的FAD2B基因205bP的插入和FAD2A基因448bp的点突变导致的编码氨基酸替换是Florunner和M2-225高油酸性状产生的分子机制（参见对比文件1第11页倒数第2段）；Yu（2008）等用辐射诱变的方法获得了4份油酸含量75%以上的高油酸花生突变体材料，发现FAD2B基因在442bp的A插入产生了译码突变和终止密码子，导致编码蛋白质失活，并且突变体FAD2A基因也存在448bp的点突变，导致氨基酸改变，编码蛋白质活性降低（参见对比文件1第11页最末段）；Lopez（2000）发现花生FAD2基因的两个SNP位点可能与高油酸性状的产生相关，其中起始密码子后442bp的A碱基插入产生的突变，进而产生失活的脂肪酸去饱和酶蛋白是花生高油酸突变体F435高油酸性状产生的主要原因，而448bp碱基的颠换导致的氨基酸改变可能也与此相关（参见对比文件1第16页第4段）；Bruner（2001）研究证实花生资源材料中天然存在ahFAD2A-wt和ahFAD2A-m等位基因的区别，两者在448bP的点突变导致编码氨基酸的替换（448，G>A；天冬氨酸-天冬酸胺，对比文件150N），448bp突变的ahFAD2A和ahFAD2B基因导致油酸含量升高，亚油酸含量降低（参见对比文件1第16页末段）；Chu（2009）等系统分析了国际上报道的高油酸花生基因源，研究结果表明所有高油酸材料均含有FAD2A的突变型基因（ahEAD2A-m，448bP A核苷酸的替换），而在2B基因的突变上存在2种基因类型，分别是存在于原始高油酸材料ORF中的442bp碱基A的插入和编码区665bp之后长度为205bp的反向重复序列插入导致的移码突变（参见对比文件1第17页第3段）。由此可见，本领域普遍知晓高油酸花生中存在ahFAD2A基因448bp处的突变和ahFAD2B基因442bp处的插入。在对比文件1的教导下，本领域技术人员有动机针对上述突变区域设计引物进行检测，而将突变位点设计在引物3’最末端从而进行AS-PCR是本领域检测等位基因时的常规技术手段（参见丁显平主编，《现代临床分子与细胞遗传学技术》，2002年07月第1版，第159-164页，第六节：等位基因特异性PCR检测突变技术，其中公开了当检测已知突变时，根据突变碱基类型设计两种引物：一种引物3’端与野生型模板完全互补，用于扩增正常的等位基因；另一种引物3’端与突变型模板完全互补，用于扩增突变的等位基因，并分别将两种引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳观察结果。此外，该章节还示例了ASPCR及MAS-PCR在β地中海贫血基因诊断中的应用，其中针对4个突变位点每个设计合成3条引物，其中上游引物是共同的，下游引物分别为正常引物与突变引物），且引物中加入内部错配碱基也是AS-PCR引物设计中的常规方法（参见[美]迪芬巴赫（Dieffenbach, C.W.）等著，黄培堂等译，《PCR技术实验指南》，北京科学出版社，1998年08月，第95-105页，第三章第二节 错配和简并引物的设计和应用，其记载了错配引物的设计原理和原则，其中第96页第2段记载了ASPCR等技术引入错配的3’末端；第97页第2段记载了使用序列特异的多对引物直接鉴定单元型的方法）。因而本领域技术人员根据已知的FAD2A和FAD2B基因序列，能够容易地设计出适宜的AS-PCR引物。因此，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段以获得权利要求1所要求保护的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2请求保护一种利用权利要求1所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR检测方法。如前所述，权利要求1所述的高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物是显而易见的，且PCR具体的扩增体系、反应条件是本领域技术人员利用常规技术手段进行有限调整即可获得的。因此，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段以获得权利要求2所要求保护的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求2不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求3请求保护权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物在回交育种和基因型鉴定中的应用。如前所述，权利要求1所述的检测高油酸花生FAD2A和FAD2B突变基因型的PCR引物是显而易见的，且对比文件1还公开了对花生亲本进行FAD2A等基因型鉴定以筛选亲本材料从而提高杂交育种效率的体系（参见对比文件1第65页第4.3.2节），因此本领域技术人员容易想到将与高油酸性状相关的FAD2A和FAD2B进行检测以用于回交育种和基因型鉴定。在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段以获得权利要求3所要求保护的技术方案，对于本领域技术人员来说是显而易见的。权利要求3不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3. 针对复审请求人意见陈述的答复
针对复审请求人答复复审通知书的意见陈述，合议组认为：如对权利要求1的评述中所述，对比文件1公开了待检测的突变位点，并公开了与本申请相同的上游引物序列，使本领域技术人员有动机针对FAD2A和FAD2B基因位点进行PCR检测；对比文件1中还对花生高油酸性状进行了遗传分析，并且教导了花生高油酸为两对隐性基因控制的遗传模式，其分别由ahFAD2A和ahFAD2B的等位基因编码，基因分型结果与高油酸表型相关。因此，本领域技术人员根据对比文件1的教导，有动机对ahFAD2A基因448bp处的突变和ahFAD2B基因442bp处的插入的基因分型进行鉴定。虽然对比文件1中使用的是测序方法，但是由于AS-PCR包括引入内部碱基错配也是本领域常规的PCR方法，其引物设计原则是已知的。该方法已广泛用于各种基因分型的检测中，本领域技术人员熟知其原理，能够相应的设计出合适的引物，无需付出创造性劳动。这些原理或者常规技术手段均是教科书或者工具书等中披露的内容，属于本领域公知常识，其技术效果也是可以预期的。因此，本领域技术人员能够用AS-PCR技术替换对比文件1中的测序技术，针对ahFAD2A基因448bp处的突变和ahFAD2B基因442bp处的插入进行基因型检测，从而显而易见地得到权利要求1的技术方案。复审请求人强调的特异性高、稳定性好的优点，是PCR方法本身所带来的效果。在已知待测序列、待测位点的情况下，根据本领域公知的引物设计原则设计特异性引物对，属于本领域常规技术，无法使得整个技术方案具备非显而易见性。因此，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07月27日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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