发明创造名称：通过分子计数提高等位基因调用的置信度
外观设计名称：
决定号：182340
决定日：2019-06-22
委内编号：1F237550
优先权日：
申请（专利）号：201180049727.3
申请日：2011-09-20
复审请求人：安捷伦科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：周洋
合议组组长：李康琦
参审员：赵彦豪
国际分类号：C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，则该发明是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201180049727.3，名称为“通过分子计数提高等位基因调用的置信度”的发明专利申请。申请人为安捷伦科技有限公司。本申请的申请日为2011年09月20日，最早优先权日为2010年09月21日，公开日为2013年06月12日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年07月31日发出驳回决定，以本申请权利要求1-24不具备创造性为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2013年04月15日提交的说明书第1-134段、说明书附图、说明书摘要、摘要附图，说明书核苷酸和氨基酸序列表；以及2015年11月24日提交的权利要求第1-24项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种确定多个样品中所测序的起始多核苷酸分子最小数量的方法，所述方法包括： 将衔接子附接到多个不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含： 所述样品特定的单一多重标识即MID；和 简并碱基区域即DBR，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的最小数量； 所述方法不用于诊断或治疗目的。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含测序引物位点。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含以下一者或多者：反射序列和启动子位点。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述DBR包含至少2个核苷酸碱基，其中所述至少2个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述DBR包含3至20个核苷酸碱基，其中所述3至10个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中将已在测序步骤中测序的每个样品中的多核苷酸的确定数量用于等位基因调用方法。
7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括进行下一代测序过程。
8. 根据权利要求1所述的方法，其中所述多个样品中的每一个为基因组DNA样品。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述多个不同的基因组DNA样品中的每一个源自不同的受试者。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述受试者为人。
11. 根据权利要求1所述的方法，而且其中在所述附接步骤前针对感兴趣区域富集所述样品。
12. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对感兴趣区域富集所述衔接子附接的多核苷酸。
13. 根据权利要求4所述的方法，其中所述衔接子为不对称衔接子，其中第一衔接子结构域存在于所述多核苷酸的第一末端并且第二衔接子区域存在于所述多核苷酸的第二末端，其中所述DBR为包含所述第一衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个以及所述第二衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个的断裂DBR。
14. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述衔接子在扩增反应中附接到所述多核苷酸分子，其中所述DBR存在于用于所述扩增反应的合成引物中。
15. 根据权利要求14所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。
16. 根据权利要求14所述的方法，其中所述方法进一步包括确定在所述PCR反应中扩增的起始多核苷酸的数量。
17. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定所述样品中所述多核苷酸的遗传异质性。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自肿瘤组织的多核苷酸。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述样品包含源自微生物和/或病毒的多核苷酸。
20. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定存在于所述多个不同样品中的所述多核苷酸的遗传异质性。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自肿瘤的不同切片。
22. 根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自受试者的不同肿瘤。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述多个不同的样品源自在不同时间的受试者。
24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述受试者存在感染，其中确定一种或多种感染原在不同时间的遗传异质性。”
驳回决定认为：权利要求1请求保护一种确定多个样品中所测序的起始多核苷酸分子最小数量的方法。对比文件3（US2007020640 A1，公开日2007年01月25日）公开了确定样本扩增产物中起始核苷酸数量的方法，具体为：通过链接或互补的方式将核苷酸条码（相当于衔接子）衔接到来源于一个或者多个样本中启示核苷酸上，其中核苷酸条码包含，预先已知核苷酸序列的核苷酸片段batch-stamp，不同的batch-stamp可以用于识别来源不同样本的核苷酸序列（即相当于MID），以及随机条码，其包含有多个不同的随机核苷酸序列，例如N（相当于DBR），扩增衔接有核苷酸条码的样本，并对扩增产物中的条码进行测序，基于随机条码的数量可以计算出扩增前来源于样本中起始核苷酸的数量（参见第19-53段、实施例1-2）。可见，权利要求1请求保护的技术方案与对比文件3相比，其区别为：对比文件3中并未公开将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品，也为明确的指出DBR的核苷酸还可以是R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V，以及并未指出所述方法不用于诊断或治疗目的。因此，权利要求1实际解决的技术问题为：获得一种在一次反应中确定多个样品中所测序的起始多核苷酸分子最小数量的方法。然而，对比文件4（“A pyrosequencing-tailored nucleotide barcode design unveils opportunities for large-scale sample multiplexing”，Poornima et al，Nucleic Acids Research, 2007年，第35卷, 第19期，公开日2007年12月31日）中给出了将标记有不同条码的来源于不同样本的cDNA进行混合并扩增，基于产物不同的条码来确定其来源（参见第8页右栏第2-4段）。可见，对比文件4中给出了在一次反应中同时扩增不同样本来源的DNA并基于条码进行区分的技术启示。同时，对比文件3中也公开了不同的batch-stamp可以用于识别来源不同样本的核苷酸序列。本领域技术人员都知晓，在一次反应中同时多种不同样本来源的核苷酸是本领域的一种常规技术，而利用条码对其产物进行区分也是本领域的惯用的技术手段。因此，无论是基于对比文件4给出的启示，还是根据本领域的公知常识，本领域技术人员都很容易想到将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品并在一次反应中确定多个样品中所测序的起始多核苷酸分子最小数量。另外，DBR还可以采用何种简并的核苷酸以及该方法用于何种用途，本领域技术人员可以根据实验的需求进行常规的选择。因此，权利要求1在对比文件3、对比文件4以及公知常识相结合的教导下是显而易见的，其不具备专利法第22条第3款规定的创造性。本领域技术人员可以为了后续相关实验操作的目的，在衔接子中添加相应的测序引物位点、反射序列和启动子位点，因此从属权利要求2-3也均不具备创造性。对比文件3公开了简并碱基区域即DBR的长度可以是5个或7个随机核苷酸，而具体采用简并的核苷酸、样本为基因组DNA、采用下一代测序过程，以及估计等位基因的频率，本领域技术人员可以根据需求进行常规的选择，因此从属权利要求4-8也均不具备创造性。本领域技术人员可以根据实验的具体需求，对样本来源于何种受试者进行常规选择，因此从属权利要求9-10也均不具备创造性。利用条码进行样本的富集同样是本领域的常规技术，而如何个调整衔接子的结构，本领域技术人员可以根据需求进行常规的选择，而这样的选择也并未带来预料不到的技术效果，因此从属权利要求11-13也均不具备创造性。权利要求14-16的附加技术特征已被对比文件3公开，因此从属权利要求14-16也均不具备创造性。本领域技术人员可以根据实验的具体需求，具体选择何种来源的样本以及如何确定遗传异质性，因此从属权利要求17-24也均不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年11月15日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人在意见陈述中提出，对比文件3的技术问题与权利要求1的技术问题不同。对比文件3的主要技术问题是如何验证PCR结果的真实性(authentication)，即如何去除重复或污染。对比文件3没有涉及基因型分型或等位基因判读的问题，更没有提到通过利用DBR来增加等位基因判读的置信度的问题。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年12月06日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：对比文件1中实质公开了核酸条码中不同的随机条码即单一的代表着反应起始时不同的靶核酸，在此基础上，本领域技术人员可以确定出随机条码的数量则代表着反应起始时不同的靶核酸的数量。同时，对比文件3的实施例中公开了采用DNA条码HBP检测单一病人样本来源的实例，其指出，测得132条序列；其中，22条带有与其它序列相同的条码（可能是冗余序列），剩下的10条序列带独特条码，其代表着反应起始是，来源不同的细胞或不同基因组的不同靶核酸。结合上述内容，本领域技术人员实质可以获得样本中起始核酸的相应数据。实施例2中则指出了DNA条码HBP检测单一病人样本来源的实例，其中讲道：测到46条序列；其中36条含独特条码，1条含冗余条码；1条具有实施例1中DNA条码HBP，因而是污染序列；8条貌似PCR误差的结果。从上述结果中可以看出，基于不同的条码同样可以获知样本中起始核酸的相应数据。而且，基于“污染序列”的信息，可以获知基于batch-stamp可以获知样本来源的信息。由此可见，结合上述内容，本领域技术人员实质上可以从对比文件3中获知有关起始核酸的相应信息。因而，坚持原驳回决定。
复审请求人于2017年12月18日主动提交了经修改的权利要求书的全文替换页（共3页22项），其内容如下：
“1. 一种等位基因判读方法，所述方法包括： 将衔接子附接到多个包含基因组DNA的不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含： 所述样品特定的单一多重标识即MID；和 简并碱基区域即DBR，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的最小数量；以及 利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高进行等位基因测定时的置信度， 所述方法不用于诊断或治疗目的。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含测序引物位点。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述衔接子进一步包含以下一者或多者：反射序列和启动子位点。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述DBR包含至少2个核苷酸碱基，其中所述至少2个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述DBR包含3至20个核苷酸碱基，其中所述3至10个核苷酸碱基的每一个选自：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V和N。
6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括进行下一 代测序过程。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述多个不同的基因组DNA样品中的每一个源自不同的受试者。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述受试者为人。
9. 根据权利要求1所述的方法，而且其中在所述附接步骤前针对感兴趣区域富集所述样品。
10. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括针对感兴趣区域富集所述衔接子附接的多核苷酸。
11. 根据权利要求2所述的方法，其中所述衔接子为不对称衔接子，其中第一衔接子结构域存在于所述多核苷酸的第一末端并且第二衔接子区域存在于所述多核苷酸的第二末端，其中所述DBR为包含所述第一衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个以及所述第二衔接子结构域中的所述至少2个核苷酸碱基的一个或多个的断裂DBR。
12. 根据权利要求1所述的方法，其中将所述衔接子在扩增反应中附接到所述多核苷酸分子，其中所述DBR存在于用于所述扩增反应的合成引物中。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述扩增反应为PCR。
14. 根据权利要求12所述的方法，其中所述方法进一步包括确定在所述PCR反应中扩增的起始多核苷酸的数量。
15. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定所述样品中所述多核苷酸的遗传异质性。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述样品包含源自肿瘤组织的多核苷酸。
17. 根据权利要求15所述的方法，其中所述样品包含源自微生物和/或病毒的多核苷酸。
18. 根据权利要求1所述的方法，其中所述方法涉及确定存在于所述多个不同样品中的所述多核苷酸的遗传异质性。
19. 根据权利要求18所述的方法，其中所述多个不同的样品源自肿瘤的不同切片。
20. 根据权利要求18所述的方法，其中所述多个不同的样品源自受试者的不同肿瘤。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述多个不同的样品源自在不同时间的受试者。
22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述受试者存在感染，其中确定一种或多种感染原在不同时间的遗传异质性。”
同时，提交了一份新的意见陈述书：（1）对比文件3的技术问题与权利要求1的技术问题不同。对比文件3的主要技术问题是如何验证PCR结果的真实性(authentication)，即如何去除重复或污染。对比文件3没有涉及基因型分型或等位基因判读的问题，更没有提到通过利用DBR来增加等位基因判读的置信度的问题。（2）对比文件3通篇都在教导用一种特定的方式使用该随机条码，即：通过检测扩增产物中随机条码的存在来验证扩增序列的真实性。对比文件3完全没有提及扩增产物中不同的随机条码的数目；更没有提及这些数目与原始样品中靶核酸数目的关系。（3）从对比文件3公开的核酸条码中不同的随机条码即单一地代表着反应起始时不同的靶核酸，到本领域技术人员可以确定出随机条码的数量代表着反应起始时不同的靶核酸的数量，这是一个分析推理过程。本领域技术人员能够通过分析推理确定随机条码的数量代表着反应起始时不同的靶核酸的数量，并不等于其有动机去做这样的分析推理。具体而言，对比文件3没有给予本领域技术人员任何引导促使其考虑反应起始时样品中不同的靶核酸的数量的问题。知晓对于反应起始时样品中不同的靶核酸的数量解决对比文件3的技术问题，即验证扩增产物的真实性而言没有任何帮助。（4）修改后的权利要求l还进一步限定了“利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高进行等位基因测定时的置信度”的技术特征，对比文件3对此技术手段没有任何公开或启示。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年02月02日向复审请求人发出复审通知书，指出：修改后的权利要求1与对比文件3的实质区别在于，权利要求1中明确限定了“利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高进行等位基因测定时的置信度”。由此，权利要求1相对于对比文件3实际解决的技术问题在于，其将所述随机条码化方法具体应用于等位基因的判读方法中。对于上述区别特征，对比文件3的实施例1中公开了如下分析结果：从该实验获得132条序列，其中有22条序列其随机条码与已获得序列完全相同（即冗余序列），剩余的110条序列则具有不同的随机条码区，显示所述序列源自分离的细胞或分离的基因组靶分子；并且实施例2中公开了如下分析结果：从该实验获得46条序列，其中36条序列是期望的有效序列，因为它们每条序列均具有独一无二的随机条码；1条序列是冗余序列，这意味着MLM1位置序列（即目标序列）具有已被确定(already seen)的随机条码，因此该2条序列中的1条被计为有效序列。由此可见，对比文件3中已经公开了利用随机条码序列（即本申请的简并碱基区域）来确定扩增产物的来源，即所述扩增产物是来源于样品起始多核苷酸的原始母模板（即源自分离的细胞或分离的基因组靶分子），还是来源于随机条码序列经扩增后已被确定的扩增子模板（即随机条码序列区域显示为完全相同的冗余扩增序列）。而所述利用源自原始母模板的扩增真实性的扩增产物数量，来提高进行等位基因判读时的统计置信度，则在对比文件3的第5-6段中给出了相关技术启示。具体而言，对比文件3第5段明确提示本发明可用于定量多态性序列的相对丰度，而本领域技术人员知晓当多态性序列的相对丰度均为50%时即为等位基因，也就是说，等位基因的判读实际上属于基因组中多态性序列的相对丰度测定的具体情形；对比文件3第6段则明确提示本发明可提供高水平的置信度(confidence)，在对比文件3上述公开内容的基础上，本领域技术人员将会有动机将所述随机条码化方法，具体应用于等位基因判读方法中并由此提高置信度。因此，权利要求1不具备创造性。从属权利要求2-22的附加技术特征，属于本领域的常规知识或者已经被对比文件3所实质公开，因此权利要求2-22也均不具备创造性。
复审请求人于2019年03月04日提交了意见陈述书，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共3页，22项），其仅对权利要求1进行了修改。复审请求人所修改的权利要求1如下：
“1. 一种等位基因判读方法，所述方法包括： 将衔接子附接到多个包含基因组DNA的不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含： 所述样品特定的单一多重标识即MID；和 简并碱基区域即DBR，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的最小数量；以及 利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高对等位基因测定结果的置信度， 所述方法不用于诊断或治疗目的。”
复审请求人认为：（1）本发明发现的问题是，在测序之前扩增等位基因时，PCR系统可能仅扩增一个染色体上的等位基因，而不扩增另一个，这样，当等位基因为杂合时，无论后续的测序多么准确，得到的都是错误的“纯合”结果。这种错误不是一个等位基因过度放大造成的，而是另一个等位基因没有放大或者放大不足，导致后续未测序或测序不足(undersequencing)造成的。发现这个问题本身就构成了本发明的技术贡献。现有技术没有认识到等位基因测定中存在这个问题，因此在判断等位基因确定结果的可信度时，仅仅考虑测序深度。该问题是本发明人鉴定出来的，如说明书所述：“我们的实验表明，样品制备早期的低含量：DNA可导致全部对应于一个等位基因的读段的高覆盖度，并且这种情况的发生可比根据二项分布的预期情况多出许多次。这是由于少数DNA分子(或甚至单个分子)的扩增所致，该扩增导致了源自单条染色体（即，两条二倍体染色体中只有一条实际存在于感兴趣样品中）上基因座位的大量读段。其结果是随覆盖度而变化的误差大大偏离预测的二项误差”。有鉴于此，请求人提出了利用DBR与测序深度结合来判断测序结果置信度的方法。（2）对比文件3公开了通过对PCR扩增模板核酸随机加条码，来克服样品量小时PCR的扩增偏倚。然而，对比文件3教导的扩增偏移主要是指PCR系统对混入样品中的少量外来核酸进行了过多的冗余扩增，导致结果失真（见对比文件3[0003]段）。可见，即使对比文件3给予了本领域技术人员拓展其方法的适用场景的启示，这样的启示也无非是将该方法应用于这样的场景：样品中少数模板核酸被不成比例地过度扩增（过度放大），导致结果失真。而这样的场景往往就是样品污染，正如对比文件3例示的。因此即使本领域技术人员有动机将对比文件3的方法应用于等位基因判读的场景，也只会按照对比文件3的教导来使用，用来校正过度扩增、检验样品中是否有外来核酸混入，等等。然而本发明的技术问题并不是样品占少数的等位基因被过度放大。等位基因的量是50％对50％，并没有多数vs少数的问题。而且，按照对比文件3的方式来应用条码化方法，也解决不了本发明的技术问题。（3）即使本领域技术人员会使用对比文件3的方法来提高“置信度”，他也不会用来增加对等位基因测定的结果（即等位基因的基因型）的置信度。如上所述，对比文件3没有教导或暗示对等位基因之一的偏好测序以及这将如何影响等位基因测定的结果。如合议组指出的，对比文件3教导的是使用该方法确定多态性的相对“丰度”。因此，在对比文件3的教导下，本领域技术人员想到的是如何增加对等位基因数量的测量的置信度。然而，对于本发明的等位基因判读，决定基因型的是等位基因的测得的碱基序列，而不是数量，因此本发明的置信度是对个体等位基因的碱基序列（由测序步骤确定）的置信度，而不是对等位基因的相对数量的置信度。对比文件3的教导在这一点上是偏离本发明的。为了明确这一点，请求人修改了权利要求的措辞，明确“置信度”针对的是等位基因的测定结果而言的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出复审请求审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在2019年03月04日答复复审通知书时提交了权利要求书的替换文本（共3页，22项），经审查，该修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此本复审决定所针对的审查文本如下：2013年04月15日国际申请进入中国国家阶段时提交的说明书第1-134段、说明书附图图1-图3、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表；以及2019年03月04日提交的权利要求第1-22项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
评价一项发明是否具备创造性时，应将其与最接近的现有技术比较以确定区别特征和实际解决的技术问题，然后考察现有技术整体上是否给出了将上述区别特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，如果现有技术中存在这种启示，则该发明是显而易见的，不具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护“一种等位基因判读方法，所述方法包括：将衔接子附接到多个包含基因组DNA的不同样品中的起始多核苷酸分子，其中每个样品对应的所述衔接子包含： 所述样品特定的单一多重标识即MID；和 简并碱基区域即DBR，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N； 将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品； 扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸； 对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列；以及 确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的最小数量；以及 利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高对等位基因测定结果的置信度，所述方法不用于诊断或治疗目的”。权利要求1所述方法实质涉及利用简并碱基区域(即DBR)来提高进行等位基因测定时的置信度；其所解决的技术问题是校正扩增反应中出现的偏差（参见其说明书第[0003]段）。
对比文件3公开了利用随机条码(barcode)和批次标记(batch-stamp)来确保PCR产物和其他序列信息真实性(authentication)的方法（参见其说明书第2段）；所述方法允许鉴定有效序列，其能够将污染扩增序列和冗余扩增序列与有效序列进行区分；所述随机条码方法通过校正PCR扩增或产物复制过程中出现的偏好，可允许定量基因组甲基化或多态性序列的相对丰度（参见其说明书第5段）；并且具体公开了所述示例性的随机条码化寡核苷酸包括：与靶核酸分子互补的序列(1)、批次标记序列(2)、随机条码序列(3)、左侧引物结合区(4)、以及5’拴束序列(5)（参见其说明书第13段、附图1）；其中所述批次标记序列是指能够唯一鉴定特定实验信息的预先确定的序列（参见其说明书第27段、附图3），所述随机条码序列是指能够特异性鉴定靶核酸的初始未知的任意序列，例如随机核苷酸N选自A、C、G、T，随机核苷酸D选自A、G、T（参见其说明书第21段、附图3）；所述代表性的方法步骤包括：A、将靶DNA分子变性；B、将随机条码化的寡核苷酸退火至靶DNA分子；C、延伸随机条码化的寡核苷酸以合成随机条码化的靶DNA分子；D、用PCR扩增随机条码化的靶DNA分子（参见其说明书第14段、附图2A-2D）；其中所述扩增产物可以通过凝胶电泳并进一步克隆和测序合适大小的产物来进行分析（参见其说明书第34段）；并且在实施例1-2中具体公开了所述序列分析结果：从该实验获得132条序列，其中有22条序列其随机条码与已获得序列完全相同（即冗余序列），剩余的110条序列则具有不同的随机条码区，显示所述序列源自分离的细胞或分离的基因组靶分子（参见其说明书第53段）；从该实验获得46条序列，其中36条序列是期望的有效序列，因为它们每条序列均具有独一无二的随机条码；1条序列是污染序列，因为它含有实施例1（即非本次实验）所使用的批次标记和随机条码；1条序列是冗余序列，这意味着MLM1位置序列（即目标序列）具有已被确定(already seen)的随机条码，因此该2条序列中的1条被计为有效序列；剩余的8条序列是PCR错误和非特异性扩增的类型（参见其说明书第63段）。由此可见，对比文件3公开了利用随机条码(barcode)通过确保PCR产物真实性而用于定量基因组多态性序列的相对丰度；其所解决的技术问题也包括校正PCR扩增过程中出现的偏好（参见其说明书第3段）。
对比文件3中公开的“通过确保PCR真实性来定量多态性序列的相对丰度的方法”，就相当于权利要求1中所述的“通过提高置信度来进行等位基因的判读方法”；对比文件3中公开的“将随机条码化的寡核苷酸退火至靶DNA分子”，就相当于权利要求1中所述的“将衔接子附接到多个包含基因组DNA的不同样品中的起始多核苷酸分子”，简而言之，“随机条码化的寡核苷酸”即相当于“衔接子”、靶DNA分子”即相当于“起始多核苷酸分子”（即DNA模板）；对比文件3中公开的“所述随机条码化寡核苷酸包括：批次标记序列，即能够唯一鉴定特定实验信息的预先确定的序列；和随机条码序列，即能够特异性鉴定靶核酸的初始未知的任意序列，例如随机核苷酸N选自A、C、G、T，随机核苷酸D选自A、G、T”，就相当于权利要求1中所述的“所述衔接子包含：所述样品特定的单一多重标识即MID；和 简并碱基区域即DBR，其包含选自以下的至少一个核苷酸碱基：R、Y、S、W、K、M、B、D、H、V、N”，简而言之，批次标记序列(batch-stamp)即相当于单一多重标识(MID)、随机条码序列(barcode)即相当于简并碱基区域(DBR)；对比文件3中公开的“用PCR扩增随机条码化的靶DNA分子”，就相当于权利要求1中所述的“将所述多个不同的衔接子附接的样品混合以生成混合样品；扩增所述混合样品中的所述衔接子附接的多核苷酸”；对比文件3中公开的“所述扩增产物可以通过克隆和测序合适大小的产物来进行分析”，就相当于权利要求1中所述的“对多个所述扩增的衔接子附接的多核苷酸测序，其中获得所述多个衔接子附接的多核苷酸的每一个的所述MID、所述DBR和所述多核苷酸至少一部分的序列”；对比文件3中公开的“剩余的110条序列则具有不同的随机条码区，显示所述序列源自分离的细胞或分离的基因组靶分子”，就相当于权利要求1中所述的“确定存在于来自每个样品的所述多个测序衔接子附接的多核苷酸中的不同DBR序列的数量，以确定已在测序步骤中测序的每个样品中的起始多核苷酸的最小数量”。对比文件3所述方法也可以不用于诊断或治疗目的。基于上述分析，权利要求1与对比文件3的区别特征在于：权利要求1中明确限定了“利用所述数量来给出等位基因判读中置信度的统计度量，由此提高对等位基因测定结果的置信度”。由此，权利要求1相对于对比文件3实际解决的技术问题在于：其将所述随机条码化方法具体应用于等位基因的判读方法中。
对于上述区别特征，对比文件3的实施例1中公开了如下分析结果：从该实验获得132条序列，其中有22条序列其随机条码与已获得序列完全相同（即冗余序列），剩余的110条序列则具有不同的随机条码区，显示所述序列源自分离的细胞或分离的基因组靶分子（参见其说明书第53段）；并且实施例2中公开了如下分析结果：从该实验获得46条序列，其中36条序列是期望的有效序列，因为它们每条序列均具有独一无二的随机条码；1条序列是冗余序列，这意味着MLM1位置序列（即目标序列）具有已被确定(already seen)的随机条码，因此该2条序列中的1条被计为有效序列（参见其说明书第63段）。由此可见，对比文件3中已经公开了利用随机条码序列（即本申请的简并碱基区域）来确定扩增产物的来源，即所述扩增产物是来源于样品起始多核苷酸的原始母模板（即源自分离的细胞或分离的基因组靶分子），还是来源于随机条码序列经扩增后已被确定的扩增子模板（即随机条码序列区域显示为完全相同的冗余扩增序列）。而所述利用源自原始母模板的扩增真实性的扩增产物数量，来提高进行等位基因判读时的统计置信度，则在对比文件3的第5-6段中给出了相关技术启示。具体而言，对比文件3第5段明确提示本发明可用于定量多态性序列的相对丰度，尽管多态性序列的相对丰度与基因转录数量有关，而等位基因判读与等位基因本身的数量有关，然而它们却均是利用源自原始母模板的扩增真实性的扩增产物数量来进行判读的；而且对比文件3第6段明确提示所述方法可提供高水平的置信度(confidence)，在对比文件3上述公开内容的基础上，本领域技术人员将会有动机将所述随机条码化方法，具体应用于等位基因判读方法中并由此提高置信度。因此综上，权利要求1请求保护的技术方案，在对比文件3的公开教导下是显而易见的，其不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求2-3对权利要求1的方法做了进一步的限定，然而，本领域技术人员可以为了后续相关实验操作的目的，在衔接子中添加相应的测序引物位点、反射序列和启动子位点。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求2-3请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求4-5对权利要求1的方法做了进一步的限定，然而，对比文件3公开了简并碱基区域即DBR的长度可以是5个或7个随机核苷酸、以及所述随机核苷酸的种类包括随机核苷酸N（即代表A、C、G、T简并）和随机核苷酸D（即代表A、G、T简并）（参见其实施例1-2、说明书第21段以及说明书附图3）。由此可见，权利要求4-5的附加技术特征已经被对比文件3所实质公开。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求4-5请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求6-8对权利要求1的方法做了进一步的限定，然而采用下一代测序过程、基因组DNA样品源自不同受试者、以及所述受试者为人，本领域技术人员可以根据实验的具体需求进行常规的选择。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求6-8请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求9-11对其引用的方法做了进一步的限定，然而利用条码进行样本的富集同样是本领域的常规技术，而如何调整衔接子的结构，本领域技术人员可以根据需求进行常规的选择，而这样的选择也并未带来预料不到的技术效果。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求9-11请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求12-14对其引用的方法做了进一步的限定，然而，对比文件3公开了将随机条码化的寡核苷酸退火至靶DNA分子；用PCR扩增随机条码化的靶DNA分子；以及利用随机条码序列来确定扩增产物的起始多核苷酸来源（即原始模板来源）（参见其说明书第14段、说明书第53段）。由此可见，权利要求12-14的附加技术特征已经被对比文件3所实质公开。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求12-14请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求15-22对其引用的方法做了进一步的限定，然而，具体选择何种来源的样本以及如何确定遗传异质性，本领域技术人员可以根据实验的具体需求进行常规的选择。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求15-22请求保护的技术方案也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、对复审请求人相关意见的评述
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）对于请求人所述的本发明解决的技术问题，“在测序之前扩增等位基因时，PCR系统可能仅扩增一个染色体上的等位基因，而不扩增另一个”，实质上正是对比文件3所提及的PCR扩增偏好或扩增偏倚问题。因此，本发明与对比文件3所解决的技术问题实际上相一致。只不过本申请将该方法具体应用于等位基因测定该具体的场景中，而无论是多态性序列的相对丰度测定、还是等位基因的判读确定，它们则均是利用源自原始母模板的扩增真实性的扩增产物数量的统计判断问题，这种类似场景的转换应用对于本领域技术人员而言是显而易见的。（2）对比文件3教导的扩增偏倚不仅是针对污染扩增问题，还针对冗余扩增问题（参见其说明书第3段、第5段等等）。请求人所提及的对比文件3中所引用的Taylor文章正是关于很少量的多克隆B细胞的冗余扩增所带来的假阳性问题。对比文件3所教导的扩增偏倚，与模板是否过多或过少并无直接关系，而是与所用的扩增引物与模板的结合偏好有关。也就是说，少量的模板核酸可能发生过度放大，而含量相对较高的模板更可能发生过度放大。（3）本领域技术人员知晓等位基因判读是需要通过所测的碱基序列来进行确定的。然而，本申请并不是在原始样品上直接进行测序，而是需要在PCR扩增之后对所测序列进行统计。此时，为了解决PCR扩增偏倚问题，那就需要统计并校正所测等位基因的相关数量了。因此，修改前后的技术方案实质相同，没有本质区别。综上，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年07月31日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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