发明创造名称：用于FLOURY (FL2)性状基因渗入的玉米中的FLOURY 2基因特异性测定法
外观设计名称：
决定号：181579
决定日：2019-06-21
委内编号：1F246101
优先权日：2012-05-30
申请（专利）号：201380038311.0
申请日：2013-05-29
复审请求人：陶氏益农公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李振鹏
合议组组长：王慧梅
参审员：邢云龙
国际分类号：C12N5/00,A01H1/02,A01H5/00,C12N5/10,C12N5/02,C12N5/04,C12N15/82,C12N15/87,C12P19/34,A01H1/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的对比文件公开的技术方案之间存在区别技术特征，而现有技术中没有给出将该区别技术特征应用到该最接近的对比文件以解决其存在的技术问题的启示，且发明取得了有益的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案具备突出的实质性特点和显著的进步，具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380038311.0，名称为“用于FLOURY (FL2)性状基因渗入的玉米中的FLOURY 2基因特异性测定法”的发明专利申请。申请人为陶氏益农公司。本申请的申请日为2013年05月29日，优先权日为2012年05月30日，公开日为2015年08月12日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月23日以权利要求1-12、14-15和17不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定为由驳回了本发明专利申请，并在其他说明部分评述了权利要求13、16和18不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定，具体理由是：权利要求1要求保护一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法,该技术方案与对比文件1（WO9802563 A1，公开日：1998年01月22日，参见说明书第1页第2段-第3页第2段）公开技术内容的区别在于：权利要求1限定了检测f12基因座上的两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏的具体方法，而对比文件1仅公开了fl2基因座上存在编码能导致玉米醇溶蛋白含量降低的半显性fl2突变的24kDa蛋白的等位基因，且权利要求1进一步限定了用于检测的核酸分子。基于上述区别特征，权利要求1实际要解决的技术问题是提供一种具体的等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法。而在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员为评估玉米中醇溶蛋白的含量，有动机对fl2基因座的上述两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏进行检测。同时对比文件2（GenBank：AF090446.1，公开日：2003年05月14日，参见CDS, ORIGIN部分）与对比文件3（GenBank: L34340.1，公开日：1995年09月26日，参见CDS, ORIGIN部分）分别公开了22-kD α-玉米醇溶蛋白21（azs22-16）与24-kD α-玉米醇溶蛋白基因（floury2）基因的CDS序列及其编码蛋白的氨基酸序列，它们的编码蛋白分别与本申请SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10编码的蛋白相同。当本领域技术人员对上述两种基因进行检测时，能够常规选择核酸杂交的方式对上述两种基因序列、其可自然获得的突变序列、包含上述两种基因的基因组片段进行杂交检测，并且能够借助设计软件选择用于杂交检测的核酸分子，从而得到权利要求1的技术方案。因此权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。在杂交检测目的核酸时，先使用引物对扩增目的片段，然后用报告物标记的探针进行杂交、检测报告物的水平是本领域常规技术手段，因此从属权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1公开了利用分子标记进行检测，而荧光染料属于本领域常规使用的分子标记，具体的激发/发射光谱类型是一种常规选择，并且选择FAM、VIC标记也没有产生预料不到的技术效果，因此从属权利要求3-4, 8-9同样不具备专利法第22条第3款规定的创造性。本领域公知用于杂交的核苷酸片段长度从十几到几百bp不等，允许少数碱基存在差异，本领域技术人员可以根据目标序列借助设计软件进行选择，进一步限定的内容并没有产生预料不到的技术效果，因此从属权利要求5-7同样不具备专利法第22条第3款规定的创造性。本领域技术人员可以根据实验条件、实际需求等选择通过PCR反应进行扩增或者通过细胞增殖等非基于PCR的反应扩增，并且扩增方式的选择并没有产生预料不到的技术效果，因此从属权利要求10-11同样不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件2公开了α-玉米醇溶蛋白野生型基因序列，对比文件3公开了突变型fl2基因序列，通过序列比对，fl2包含核苷酸位置495处C至T突变，因此从属权利要求12同样不具备专利法第22条第3款规定的创造性。根据对权利要求1的评述，对比文件1公开了fl2突变能够降低α-玉米醇溶蛋白含量、提高赖氨酸含量，制备包含具有功能的fl2突变的种质进一步用于遗传转化属于本领域常规技术手段，因此权利要求14不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求15所要求保护的技术方案与对比文件1（参见说明书第1页第2段-第3页第2段，第15页第1段）公开的技术内容的区别为权利要求15限定将分离的DNA在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交，获得fl2突变的遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中，权利要求15进一步限定了与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子。基于该区别特征，权利要求15实际要解决的技术问题是提供一种将高赖氨酸含量的性状基因渗入植物种质中的方法。结合对权利要求1的评述可知，本领域技术人员能够得到权利要求15的技术方案，并能够合理预期高赖氨酸含量的性状已经基因渗入包含fl2突变的杂交后代的种质中，因此权利要求15不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求17要求保护SEQ ID NO:10的核苷酸序列，其与对比文件3（参见CDS, ORIGIN）公开的技术内容的区别为核苷酸序列不完全相同。权利要求17实际要解决的技术问题是提供一种包含floury2基因编码序列的核苷酸序列。然而，根据具体的研究目的和预期效果，在编码序列两端添加一定长度的非编码序列属于本领域常规技术手段，并且SEQ ID NO:10所示核苷酸序列也没有编码产生新的蛋白，即不具有预料不到的技术效果。因此，权利要求17不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。其他说明中指出：对比文件1公开了fl2突变能够降低α-玉米醇溶蛋白含量、提高赖氨酸含量，制备包含具有功能的fl2突变的玉米植物细胞属于本领域常规技术手段。结合针对权利要求1的评述，根据对比文件2和3的比对结果可知，f12突变包含核苷酸位置495处C/T突变，本领域技术人员有动机分析鉴定495C/T突变与赖氨酸含量的关系，从而将包含核苷酸位置495处C/T突变的所述f12突变引入玉米植物细胞。因此，权利要求13不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。基于与评述权利要求13相似的理由，在对比文件1-3的基础上，本领域技术人员有动机分析鉴定495C/T突变与赖氨酸含量的关系，从而将包含核苷酸位置495处C/T突变的SNP引入玉米植物细胞。因此，权利要求16不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。根据对权利要求1的评述，对比文件1公开了fl2基因座上24kDa醇溶蛋白基因将导致醇溶蛋白含量降低、提高赖氨酸含量，制备包含24kDa醇溶蛋白基因的玉米植物细胞进一步用于遗传转化属于本领域常规技术手段。权利要求18要求保护的技术方案和对比文件1公开的技术内容相比，区别特征为权利要求18限定了向玉米植物细胞引入SEQ ID NO:10的核苷酸序列。基于该区别特征，权利要求18实际要解决的技术问题是确定24kDa醇溶蛋白基因的核苷酸序列。对比文件3公开了24-kD α-玉米醇溶蛋白基因（floury2）CDS序列及其编码蛋白的氨基酸序列（参见CDS, ORIGIN），其核酸序列与本申请SEQ ID NO:10的第34-1645bp相同，其编码蛋白与本申请SEQ ID NO:10编码蛋白相同。根据具体的研究目的和预期效果，在编码序列两端添加一定长度的非编码序列属于本领域常规技术手段，并且SEQ ID NO:10所示核苷酸序列也没有编码产生新的蛋白，即不具有预料不到的技术效果。因此，权利要求18不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。针对申请人的意见陈述：待检测的目的基因，即22-kD α-玉米醇溶蛋白基因和24-kD α-玉米醇溶蛋白基因是明确的且基因序列是已知的；用于检测的方法，即基于PCR的荧光探针接合性测定法(KASPar?测定法)的原理和操作是本领域熟知的；在此基础上，本领域技术人员能够根据目标基因借助设计软件、通过常规设计并选择得到适用于上述测定方法的核酸分子，其产生的效果是能够合理预期的。SNP大多是沉默位点，并不导致氨基酸变化。本领域技术人员有动机从导致α-玉米醇溶蛋白氨基酸序列发生改变的SNP位点中进行选择，例如选择导致丙氨酸至缬氨酸取代的495C/T突变。权利要求中并没有明确是针对495处的C/T突变进行检测，即涵盖了在杂交条件下，将SEQ ID NO:6-8中一条或多条核酸分子用于检测SEQ ID NO:9和10的全部技术方案，这包含了不利用495处的C/T突变进行接合性分析的方法。根据本申请说明书表3的记载可知，只有当联合使用寡核苷酸序列SEQ ID NO:6-8才能够通过对495位点的检测预测fl2的接合性，而权利要求1和15中的具体限定“所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8”不足以鉴定出495位的C/T突变导致丙氨酸突变为缬氨酸。
驳回决定所依据的文本为：2015年01月19日本申请进入中国国家阶段时按照原始国际申请文件的中文译文提交的说明书第1-149段（即第1-20页）、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-15页，2015年06月17日提交的说明书附图图1-图6（即第1-18页）、摘要附图，2017年05月09日提交的权利要求第1-18项 。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，该方法包括：
从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；并
测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性，
其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
2. 权利要求1的方法，其进一步包括：
使所述分离的基因组DNA与两个各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子，和两个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列；
在扩增反应中包含至少一个包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列且用第一报告物标记的核酸分子，和至少一个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交且用第二报告物标记的核酸分子；并
检测所述第一和第二报告物的水平。
3. 权利要求2的方法，其中所述第一报告物和所述第二报告物是具有可区别的激发/发射光谱的荧光染料。
4. 权利要求3的方法，其中所述第一报告物是FAM，且所述第二报告物是VIC。
5. 权利要求1的方法，其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度为10-35个核苷酸。
6. 权利要求5的方法，其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子的长度为15-30个核苷酸。
7. 权利要求5的方法，其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子之一与SEQ ID NO:9的10-35个连续核苷酸是至少95％相同的。
8. 权利要求1的方法，其中至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子用荧光染料标记，且至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子用具有可区别的激发/发射光谱的第二荧光染料标记。
9. 权利要求8的方法，其中至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子用FAM标记，且至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子用VIC标记。
10. 权利要求1的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括在PCR反应中扩增。
11. 权利要求1的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括在非基于PCR的反应中扩增。
12. 权利要求1的方法，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)。
13. 获得玉米植物细胞的方法，其包括向玉米植物细胞引入权利要求12的fl2突变。
14. 种质，其包含权利要求12的fl2突变。
15. 一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，所述方法包括：
将在所述fl2基因中具有突变的植物与另一个植物杂交；
从通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的核酸与至少一种具有以下核苷酸序列的核酸分子接触，所述核苷酸序列能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交；并
如下选择在所述fl2基因中包含突变的来自所述杂交的后代，即繁殖获得在高严格性情况下结合所述至少一种核酸分子的样品的植物，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中，
其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
16. 获得经遗传修饰的玉米植物细胞的方法，其包括向玉米植物细胞中引入核苷酸位置495处的(C/T)SNP。
17. SEQ ID NO:10的核苷酸序列。
18. 获得玉米植物的细胞的方法，其包括向玉米植物的细胞引入SEQ ID NO:10的核苷酸序列。”
申请人陶氏益农公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年03月07日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共2页，12项），相对于驳回决定针对的权利要求书，所作的修改在于：将原权利要求1中“使所述分离的基因组DNA与至少一种包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子和至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触”和“其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子选自下组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8”修改为“使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交”；删除了原权利要求5-7、13、16和18；将原权利要求8中“至少一种包含能够……杂交的核苷酸序列的核酸分子用荧光染料标记，……杂交的核酸分子……修改为“至少一种能够……杂家的所述核酸分子用第一荧光染料标记，……杂交的所述核酸分子……”，将原权利要求9中“……用FAM标记，且……用VIC标记”修改为“所述第一荧光染料是FAM，且所述第二荧光染料是VIC；将原权利要求10中“包括在PCR反应中扩增”修改为“包括PCR反应”；将原权利要求15中“使所述分离的核酸与……至少一种具有以下核苷酸序列的核酸分子接触，……核酸分子选自下组：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8”修改为“使所述分离的核酸与多个核酸接触，所述多个核酸包括至少一种具有以下核苷酸序列的核酸分子接触，……核酸分子包括第一等位基因特异性引物序列，其包含SEQ ID NO:6，和共同反向引物序列，其包含SEQ ID NO:8”；以及对权利要求的编号和引用关系进行了适应性修改。复审请求人认为：（1）本领域技术人员无法得知在72个SNP和7和插入/缺失中，哪个或哪些突变可以用于高精确性的区分野生型和突变体等位基因。在本申请中测试的7个差异性位点中，仅位置495处的SNP（即C突变为T）显示出对floury 2基因的高选择性，而其它位置处的突变要么不能用于基因特异性检测，要么选择性和稳定性不足。因此，要从大量的突变位置中鉴定出能够用于高选择性地鉴定floury 2基因的突变位点，以及选择具体的核苷酸序列以鉴定上述突变位点无疑需要本领域技术人员付出创造性劳动。修改后的独立权利要求中已经描述了用于杂交的具体核苷酸序列即SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO: 8的每一个。由于上述SNP以及用于鉴定该SNP的具体核酸序列相比于对比文件1-3是非显而易见的，并且获得了相比于现有技术的有益技术效果和显著进步（即高选择性地鉴定floury 2基因的突变），因此应当认为权利要求1和11及其从属权利要求具备创造性。（2）欧洲专利局审查员认可了SEQ ID NO:6、7和8的组合相比于现有技术具有创造性。新修改的权利要求书如下：
“1. 一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，该方法包括：
从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；并
测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性。
2. 权利要求1的方法，其进一步包括：
使所述分离的基因组DNA与两个各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子，和两个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列；
在扩增反应中包含至少一个包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列且用第一报告物标记的核酸分子，和至少一个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交且用第二报告物标记的核酸分子；并
检测所述第一和第二报告物的水平。
3. 权利要求2的方法，其中所述第一报告物和所述第二报告物是具有可区别的激发/发射光谱的荧光染料。
4. 权利要求3的方法，其中所述第一报告物是FAM，且所述第二报告物是VIC。
5. 权利要求1的方法，其中至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的所述核酸分子用第一荧光染料标记，且至少一种能够在高严格性 条件下与SEQ ID NO:10杂交的所述核酸分子用具有可区别的激发/发射光谱的第二荧光染料标记。
6. 权利要求5的方法，其中所述第一荧光染料是FAM，且所述第二荧光染料是VIC。
7. 权利要求2的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括PCR反应。
8. 权利要求2的方法，其中扩增所述核苷酸序列包括非基于PCR的反应。
9. 权利要求1的方法，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)。
10. 种质，其包含权利要求9的fl2突变。
11. 一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，所述方法包括：
将在所述fl2基因中具有突变的植物与另一个植物杂交；
从通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的核酸与多个核酸接触，所述多个核酸包括至少一种具有以下核苷酸序列的核酸分子接触，所述核苷酸序列能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交；并
如下选择在所述fl2基因中包含突变的来自所述杂交的后代，即繁殖获得在高严格性情况下结合所述至少一种核酸分子的样品的植物，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中，
其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列的核酸分子包括第一等位基因特异性引物序列，其包含SEQ ID NO:6，和共同反向引物序列，其包含SEQ ID NO:8。
12. SEQ ID NO:10的核苷酸序列。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月18日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：（1）复审请求人虽然修改了权利要求书，但是仍不能确定针对特定的SNP位点进行检查和接合性选择，并且三条引物序列只有在特定的使用方法中才能检测SNP。（2）权利要求12要求保护SEQ ID NO:10的核苷酸序列。根据驳回决定中针对原权利要求17的评述可知，权利要求12不具备创造性。（3）权利要求10要求保护种质，说明书第10段记载了“包含此独特SNP的核苷酸序列，和使用这些方法选择的植物和种质”，说明书第12段记载了“将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入遗传工程化植物的种质中”等，根据上述记载，种质属于专利法第25条第1款第（4）项规定的植物品种的范围，因此不能被授予专利权。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
复审请求人于2018年11月13日提交了复审无效宣告程序意见陈述书，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共2页，10项），所作修改在于：删除了权利要求10和12，删除了权利要求11中“其包含”的表述，并对权利要求编号进行适应性修改。复审请求人认为：修改后的权利要求1-10克服了所述缺陷。
合议组于2019年01 月15日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1中请求保护的涉及使用竞争性等位基因特异性PCR之外的其他方法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性的并列技术方案相对于对比文件1（参见说明书第1页第2段-第3页第2段）公开技术内容的区别技术特征为：权利要求1涉及检测fl2基因座上的等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，并具体限定了获得基因组DNA样品，使其与序列8-10所示核酸分子接触。而对比文件1仅公开了存在产生非正常的α-玉米醇溶蛋白的fl2突变等位基因。本申请说明书中仅记载了采用竞争性等位基因特异性PCR、利用序列6-8所示引物能够稳定的检测出所述fl2突变的技术效果，据此无法得出使用其他方法能够稳定的检测出所述fl2突变的技术效果，因而权利要求1该并列技术方案实际解决的技术问题是：提供一种检测玉米fl2突变等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法。在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员有动机对fl2基因座的上述两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏进行检测。同时对比文件2公开了玉米22kDa醇溶蛋白21的氨基酸序列及其基因、对比文件3公开了玉米24kDa醇溶蛋白floury2的氨基酸序列及其基因。从而当本领域技术人员对上述两种基因进行检测时，能够利用本领域常规技术通过比对得到上述两个等位基因的序列差异，并根据序列差异设计针对差异位点的具体引物和/或探针等核酸分子，进而在提取的基因组DNA样品中对上述两个等位基因进行检测。因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。权利要求2-9引用权利要求1，对核酸分子的使用方法、荧光标记、核酸分子的性质、扩增方法、突变位点进行了进一步描述和限定，其附加技术特征均是本领域的常规技术手段，因此在权利要求1不具备创造性的情况下，权利要求2-9也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。权利要求10请求保护一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，该技术方案相对于对比文件1（参见说明书第1页第2段-第3页第2段，第15页第1段）公开的技术内容的区别技术特征为：权利要求10涉及将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，并具体限定了获得后代植物基因组DNA样品，通过与包括序列6和8的至少一种核酸分子接触以及在高严格性情况下结合选择包含fl2基因突变的后代等步骤。基于上述区别技术特征，权利要求10实际解决的技术问题是：提供一种获得并选择fl2突变玉米种质的方法。结合针对权利要求1的评述，当本领域技术人员对fl2等位基因进行检测时，能够利用本领域常规技术通过比对得到上述两个等位基因的序列差异，并根据序列差异设计针对差异位点的具体引物和/或探针等核酸分子在提取的基因组DNA样品中检测fl2突变等位基因。因此，权利要求10不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）SNP大多是沉默位点，并不导致氨基酸变化。本领域技术人员可以通过选择导致氨基酸变化的SNP位点以缩小可选择范围。本申请说明书中记载了采用竞争性等位基因特异性PCR、利用序列6-8所示引物能够稳定的检测出所述fl2突变的技术效果，据此无法得出使用其他方法或仅利用序列6和/或8能够稳定的检测出所述fl2突变的技术效果，因此权利要求1中涉及使用其他方法的并列技术方案以及权利要求10的技术方案并未实际解决高精确性的区分野生型和突变体等位基因的技术问题，而仅是提供另一种具体的检测方法，结合对权利要求1-10的评述可知，即使对于通过比对可以得到的72个SNP位点和7个插入/缺失，本领域技术人员能够利用本领域常规技术手段设计针对差异位点的具体引物和/或探针等核酸分子并检测fl2突变等位基因，这对本领域技术人员而言是显而易见的。
复审请求人于2019年02月27日提交了意见陈述书，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共2页，8项），所作修改在于：在权利要求1中增加了“使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法”的限定，删除了权利要求7-8，将权利要求10中的“使所述分离的核酸与多个核酸接触，所述多个核酸包括至少一种具有以下核苷酸序列的核酸分子接触，所述核苷酸序列能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交”和“其中所述至少一种包含能够与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列的核酸分子包括第一等位基因特异性引物序列SEQ ID NO:6，和共同反向引物序列SEQ ID NO:8”修改为“使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；
使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2基因中的突变”，并对权利要求编号进行了适应性修改。复审请求人认为：修改后的权利要求1和8中描述了使用包括序列6-8的多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法来测定fl2突变。如序列6-8所示的具体核酸序列相比于对比文件1-3的公开是非显而易见的，修改后的权利要求所限定的技术方案具有能够稳定检测出所述fl2突变的技术效果，这是本领域技术人员基于对比文件1-3的公开不能合理预期的。因此，修改后的权利要求1-8具备创造性。
随后，复审请求人又于2019年05月22日提交了复审无效宣告程序补正书，同时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共2页，8项），所作的修改在于：将权利要求8中的“将在所述fl2基因中具有突变的植物与另一个植物杂交”修改为“将具有fl2突变的植物与另一个植物杂交，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)并且其中位置495处的核苷酸是T”，以及将“使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2基因中的突变；并如下选择在所述fl2基因中包含突变的来自所述杂交的后代，即繁殖获得在高严格性情况下结合所述至少一种核酸分子的样品的植物”修改为“用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2突变；并从所述杂交选择对于所述fl2突变纯合的后代”。新修改的权利要求书如下：
“1. 一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，该方法包括：
从所述玉米植物组织获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；并
使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性。
2. 权利要求1的方法，其进一步包括：
使所述分离的基因组DNA与两个各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列的核酸分子，和两个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核酸分子接触；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列；
扩增所述分离的基因组DNA的与两个核酸分子杂交的核苷酸序列之间的所述分离的基因组DNA的核苷酸序列，所述两个核酸分子各包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列；
在扩增反应中包含至少一个包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的核苷酸序列且用第一报告物标记的核酸分子，和至少一个能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交且用第二报告物标记的核酸分子；并
检测所述第一和第二报告物的水平。
3. 权利要求2的方法，其中所述第一报告物和所述第二报告物是具有可区别的激发/发射光谱的荧光染料。
4. 权利要求3的方法，其中所述第一报告物是FAM，且所述第二报告物是VIC。
5. 权利要求1的方法，其中至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的所述核酸分子用第一荧光染料标记，且至少一种能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:10杂交的所述核酸分子用具有可区别的激发/发射光谱的第二荧光染料标记。
6. 权利要求5的方法，其中所述第一荧光染料是FAM，且所述第二荧光染料是VIC。
7. 权利要求1的方法，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)。
8. 一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，所述方法包括：
将具有fl2突变的植物与另一个植物杂交，其中所述fl2突变包含核苷酸位置495处的SNP(C/T)并且其中位置495处的核苷酸是T；
从通过所述杂交生成的后代植物获得分离的基因组DNA的样品；
使所述分离的基因组DNA与多个核酸分子接触，所述多个核酸分子包含能够在高严格性条件下与SEQ ID NO:9杂交的SEQ ID NO:7，能够在高严格条件下与SEQ ID NO:10杂交的核苷酸序列SEQ ID NO:6，以及包含SEQ ID NO:8的共同反向引物序列，其能够在高严格条件下与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10两者杂交；
使用所述多个核酸分子，通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2突变；并
从所述杂交选择对于所述fl2突变纯合的后代，由此生成遗传工程化植物，其中高赖氨酸含量的性状已经基因渗入所述遗传工程化植物的种质中。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人于2019年05月22日提交复审无效宣告程序意见陈述书时提交了经修改的权利要求书全文替换页（共2页，8项），经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定依据的审查文本为：2015年01月19日本申请进入中国国家阶段时按照原始国际申请文件的中文译文提交的说明书第1-149段（即第1-20页）、说明书摘要、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-15页，2015年06月17日提交的说明书附图图1-图6（即第1-18页）、摘要附图，以及2019年05月22日提交的权利要求第1-8项。
2、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果权利要求请求保护的技术方案与最接近的对比文件公开的技术方案之间存在区别技术特征，而现有技术中没有给出将该区别技术特征应用到该最接近的对比文件以解决其存在的技术问题的启示，且发明取得了有益的技术效果，则该权利要求请求保护的技术方案具备突出的实质性特点和显著的进步，具备创造性。
具体到本案，权利要求1请求保护一种使用玉米植物组织测定等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法。对比文件1公开了玉米粒中50-60%的蛋白是基本不含赖氨酸的玉米醇溶蛋白，从而使玉米粒对单胃动物营养差。玉米粒中的floury2（fl2）突变是一种导致淀粉胚乳变软的半显性突变。fl2突变能提高玉米粒中赖氨酸的含量。在fl2突变中发现了一种非正常的α-玉米醇溶蛋白，其分子量为24kDa，高于正常玉米醇溶蛋白（参见说明书第1页第2段-第3页第2段）。权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1公开的技术内容相比，区别技术特征为：权利要求1涉及通过竞争等位基因特异性PCR测定法测定fl2基因座上的等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法，并具体限定了获得基因组DNA样品，使其与序列6-8所示核酸分子接触的步骤；而对比文件1仅公开了存在产生非正常的α-玉米醇溶蛋白的fl2突变等位基因。
驳回决定、前置审查意见书中认为：权利要求1实际要解决的技术问题是提供一种具体的等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法。在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员为评估玉米中醇溶蛋白的含量，有动机对fl2基因座的上述两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏进行检测。用于检测的方法，即基于PCR的荧光探针接合性测定法(KASPar?测定法)的原理和操作是本领域熟知的。当本领域技术人员对具体序列已被对比文件2和对比文件3公开的上述两种等位基因进行检测时，能够常规选择核酸杂交的方式对上述两种基因序列、其可自然获得的突变序列、包含上述两种基因的基因组片段进行杂交检测，并且能够借助设计软件选择用于杂交检测的核酸分子，从而得到权利要求1的技术方案。SNP大多是沉默位点，并不导致氨基酸变化，本领域技术人员有动机从导致-玉米醇溶蛋白氨基酸序列发生改变的SNP位点中进行选择，例如选择导致丙氨酸至缬氨酸取代的495C/T突变。综上，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。引用权利要求1的从属权利要求也不具备创造性。
复审通知书中认为：权利要求1中请求保护的涉及使用竞争性等位基因特异性PCR之外的其他方法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性的并列技术方案实际解决的技术问题是：提供一种检测玉米fl2突变等位基因的接合性和/或存在/缺乏的方法。在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员有动机对fl2基因座的上述两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏进行检测。对比文件2公开了玉米22kDa醇溶蛋白的氨基酸序列及其基因、对比文件3公开了玉米24kDa醇溶蛋白的氨基酸序列及其基因。当本领域技术人员对上述两种基因进行检测时，能够利用本领域常规技术通过比对得到上述两个等位基因的序列差异，并根据序列差异设计针对差异位点的具体引物和/或探针等核酸分子在提取的基因组DNA样品中对上述两个等位基因进行检测。因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。引用权利要求1的从属权利要求也不具备创造性。
对此，合议组认为：复审请求人于2019年05月22日提交的权利要求书中，已经具体限定了使用SEQ ID NOs:6-8所述多个核酸分子通过竞争等位基因特异性PCR测定法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性，因此复审通知书中针对的涉及使用竞争性等位基因特异性PCR之外的其他方法测定所述分离的基因组DNA中fl2突变的接合性的并列技术方案的事实基础已经不存在。且根据对SEQ ID NOs:6-8的分析可知，正向引物SEQ ID NO:6：gaaggtgacc aagttcatgc tgcaagccta taggctacaa ctagt（495）和SEQ ID NO:7：gaaggtcgga gtcaacggat t caagccta taggctacaa ctagc（495）的区别仅在于第495位的核苷酸t和c的区别，与39位氨基酸突变导致的SNP相对应，即通过上述核苷酸序列限定出了检测针对的SNP位点。
根据本申请说明书的记载可知（参见实施例1-3，图1-4），野生型玉米与f12突变型玉米的α-玉米醇溶蛋白等位基因存在72个SNP位点，通过竞争等位基因特异性PCR测定法使用对应引物组对其中7个导致氨基酸突变的SNP位点进行检测，结果显示导致-1位氨基酸突变的SNP无法检测出等位基因接合性，39位氨基酸突变的SNP可稳定检测出等位基因接合性，其它氨基酸突变的SNP对检测等位基因接合性不足够稳健。比较视觉评分与来自fl_zygo测定法（即通过竞争等位基因特异性PCR测定法对39位氨基酸突变的SNP检测）的基因型数据揭示了95%的匹配（152个中的145个），剩余的7个穗都以可疑的表型分离。由此可见，权利要求1实际解决的技术问题是，如何稳定准确的检测玉米fl2突变等位基因的接合性和/或存在/缺乏。
虽然在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员为评估玉米中醇溶蛋白的含量，有动机和能力选择竞争等位基因特异性PCR测定法对fl2基因座的上述两种等位基因的接合性和/或存在/缺乏进行检测，但由于α-玉米醇溶蛋白等位基因存在大量SNP位点，本领域技术人员无法预先确定能否以及哪个SNP可以用于高精确性且稳定的区分野生型α-玉米醇溶蛋白基因和fl2突变体。虽然大多SNP是沉默位点并不影响氨基酸的变化，但竞争等位基因特异性PCR测定法是对基因的检测，是否影响氨基酸的变化不是SNP位点选择的特定标准，且影响氨基酸变化的SNP点也不止一个，本领域技术人员仍然无法预先确定能否以及哪个SNP可以用于高精确性且稳定的区分野生型α-玉米醇溶蛋白基因和fl2突变体。即在面对如何稳定准确的检测玉米fl2突变等位基因的接合性和/或存在/缺乏这一技术问题时，对比文件1和现有技术中并没有给出如何解决该技术问题的启示，且如上所述本发明取得了有益的技术效果。因此，驳回决定、前置审查意见和复审通知书中认为权利要求1不具备创造性的理由不成立。同理，驳回决定、前置审查意见和复审通知书中认为权利要求2-7不具备创造性的理由不成立。
权利要求8请求保护一种用于将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法。对比文件1公开了玉米粒中50-60%的蛋白是基本不含赖氨酸的玉米醇溶蛋白，从而使玉米粒对单胃动物营养差。玉米floury2（fl2）突变是一种导致淀粉胚乳变软的半显性突变。fl2突变能提高玉米粒中赖氨酸的含量。在fl2突变中发现了一种非正常的α-玉米醇溶蛋白，其分子量为24kDa，高于正常玉米醇溶蛋白（参见说明书第1页第2段-第3页第2段）。对比文件1还公开了将野生型玉米W64A 与W64Afl2杂交生成F2代（参见说明书第1页第2段-第3页第2段，第15页第1段）。权利要求8所要求保护的技术方案与对比文件1公开的技术内容相比，区别技术特征为：权利要求1涉及将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中的方法，并具体限定了将具有fl2突变的植物与另一个植物杂交，获得后代植物基因组DNA样品并使其与SEQ ID NO:6-8 接触，使用SEQ ID NO:6-8通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2突变，选择对于所述fl2突变纯合的后代；而对比文件1仅公开了存在产生非正常的高赖氨酸含量的α-玉米醇溶蛋白的fl2突变等位基因，以及将野生型玉米与fl2突变型玉米杂交生成F2代。
驳回决定、前置审查意见书中认为：权利要求8（即驳回决定针对的权利要求15）实际要解决的技术问题是提供一种将高赖氨酸含量的性状基因渗入植物种质中的方法。结合对权利要求1的评述可知，本领域技术人员能够得到权利要求8的技术方案，并能够合理预期高赖氨酸含量的性状已经基因渗入包含fl2突变的杂交后代的种质中。因此权利要求8不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
复审通知书中认为：权利要求8（即复审请求人2018年11月13日提交的权利要求10）实际解决的技术问题是提供一种获得并选择fl2突变玉米种质的方法。结合针对权利要求1的评述，当本领域技术人员对fl2等位基因进行检测时，能够通过本领域常规技术通过比对得到上述两个等位基因的序列差异，并根据序列差异设计针对差异位点的具体引物和/或探针等核酸分子在提取的基因组DNA样品中检测fl2突变等位基因。因此，权利要求8不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
对此，合议组认为：复审请求人于2019年05月22日提交的权利要求书中，已经具体限定了使用SEQ ID NOs:6-8所述多个核酸分子通过竞争等位基因特异性PCR测定法检测所述fl2突变，并从所述杂交选择对于所述fl2突变纯合的后代。根据本申请说明书的记载（参见实施例4），可以通过突变fl2_zygo（即通过竞争等位基因特异性PCR测定法对39位氨基酸突变的SNP检测）作为fl2基因渗入的稳健测定法。因此，权利要求8实际解决的技术问题是，如何将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中。根据上述决定理由部分对权利要求1的评述可知，本领域技术人员无法预先确定能否以及哪个SNP可以用于高精确性且稳定的区分野生型α-玉米醇溶蛋白基因和fl2突变体，因而也无法确定如何将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中并高精确性地对杂交后代进行检测。因而在面对如何将高赖氨酸含量的性状可靠且可预测地基因渗入植物种质中这一技术问题时，现有技术中并没有给出如何解决该技术问题的启示，且如上所述本发明取得了有益的技术效果。因此，驳回决定、前置审查意见和复审通知书中认为权利要求8不具备创造性的理由不成立。
驳回决定、前置审查意见书中还认为：对于驳回决定针对的权利要求书，如请求保护获得玉米植物细胞的方法权利要求13，请求保护种质的权利要求14，请求保护获得经遗传修饰的玉米植物细胞的方法的权利要求16，请求保护SEQ ID NO:10的核苷酸序列的权利要求17，请求保护获得玉米植物的细胞的方法的权利要求18不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
对此，合议组认为：复审请求人于2019年05月22日提交的权利要求书中，已经将驳回决定和前置审查意见针对的不具备创造性的权利要求13-14,16-18删除，因此上述驳回决定、前置审查意见书中认为的缺陷的事实基础已不存在。
3.专利法第25条第1款
专利法第25条第1款规定，对动物和植物品种不授予专利权。
可以借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的植物的单个植株及其繁殖材料（如种子等），属于“植物品种”的范畴，不能被授予专利权。
前置审查意见书中认为：请求保护种质的复审请求时提交的权利要求10的主题属于专利法第25条第1款第（4）项规定的植物品种的范围，因此不能被授予专利权。
对此，合议组认为：复审请求人于2019年05月22日提交的权利要求书中，已经将前置审查意见针对的权利要求10删除，因此上述前置审查意见书中认为的缺陷的事实基础已不存在。
根据以上事实和理由，合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2017年11月23日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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