发明创造名称：一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒
外观设计名称：
决定号：181680
决定日：2019-06-20
委内编号：1F231625
优先权日：
申请（专利）号：201310268535.2
申请日：2013-06-29
复审请求人：中国农业科学院兰州兽医研究所
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：安玉苹
合议组组长：王亦然
参审员：王慧
国际分类号：C12Q1/70，C12Q1/68，G01N21/64
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：对于发明所请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情形，如果现有技术给出了将区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使得本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进现有技术并获得要求保护的技术方案，则该技术方案是显而易见的。
全文：
本复审请求涉及申请号为201310268535.2，名称为“一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒”的发明专利申请。申请人为中国农业科学院兰州兽医研究所。本申请的申请日为2013年06月29日，公开日为2013年09月18日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年05月26日以权利要求1-6不符合专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为：申请日2013年06月29日提交的说明书第1-7页（第1-27段）、说明书摘要、摘要附图、说明书附图第1页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页，以及2016年06月23日提交的权利要求第1-6项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含One Step RT-PCR bufferIII、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II、阴性对照，其特征在于：还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
2. 根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物浓度均为10pmol/μL，扩增引物及探针引物配比为1:1:1。
3. 根据权利要求1或2所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述扩增引物扩增出的条带序列为：
序列SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:2的由5’端向3’端延长的序列，长度228bp，序列如下， SEQIDNO:4：
cccgggttgaaaagcctcgtgttgggtggcagaaaagctgttaagcagggagtggtaaaccttgttaaatatgccaaataacaacggcaagcagcaaaagaaaaagaaggggaatggccagccagtcaatcagctgtgccaaatgctgggtaagatcatcgcccaacaaaaccagtccagaggcaagggaccggggaagaaaaataggaagaaaaacccggagaagcc。
4. 根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述探针引物的5’端标记物为FAM报告荧光基团、3’端标记物为TAMRA淬灭荧光基团。
5. 根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述阳性对照为构建的pMD-228阳性质粒，该质粒是扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所扩增的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因序列，长度228bp，克隆至pMD18-T克隆载体，命名为pMD-228。
6. 根据权利要求1所述的一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，其特征在于所述试剂盒组分的配比为：
a. 2×One Step RT-PCR bufferIII：25份；
b. Ex Taq HS：1份；
c. PrimerScript RT Enzyme Mix II: 1份；
d.引物浓度均为10pmol/μl的三条引物混合液6份，上游引物2份，下游引物2份，探针引物2份；
e. 无RNA酶水13份；
f. 阳性对照pMD18-T-228阳性质粒6份；
g. 阴性对照无RNA酶水6份。”
驳回决定认为：权利要求1请求保护一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，对比文件1（CN101463395A，公开日：2009年06月24日）公开了一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）的检测试剂盒。权利要求1和对比文件1区别技术特征在于：（1）使用Ex Taq HS和PrimerScript RT Enzyme Mix II，（2）加入序列SEQ ID NO:3的探针，用于实时（real-time）检测，（3）使用一对引物SEQ ID NO：1和2，与对比文件1的SEQ ID NO：5和6相同，而不包含对比文件1中的引物SEQ ID NO：1-4。对于区别特征（1），Ex Taq HS和PrimerScript RT Enzyme Mix II均为分子生物领域PCR试验中的常规试剂；对于区别特征（2），对比文件2（CN102230024A，公开日：2011年11月02日）公开了一种猪蓝耳病病毒实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法，包括（1）设计针对猪蓝耳病病毒的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；（2）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；（3）配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（4）选定反应条件及程序，上机检测。可见，加入探针序列用于实时（real-time）检测的技术特征已被对比文件2公开，且作用与在本申请中的作用相同；探针的设计和特异性筛选是本领域的常规技术。另外，对比文件2也只使用了一对引物，即公开了区别特征（3）。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2-6中进一步限定的特征或者已被对比文件1或2公开，或者属于本领域的常规技术，因此，权利要求2-6也不具有创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年09月06日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了附件1（PRRSV基因翻译图谱，复印件共1页），但没有修改申请文件。复审请求人认为：（1）Ex Taq HS具有高扩增效率，高扩增灵敏度的特点，其经普通Taq DNA聚合酶的化学修饰获得，具有更高的特异性和产率等优点，为最优的结果。PrimeScript RT Enzyme Mix II 是具有高扩增活性，高热稳定性以及无细菌核酸污染的新型反转录酶，与对比文件1中的RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶截然不同。Ex Taq HS和PrimeScript RT Enzyme Mix II对本申请试剂盒性能提高和科研分析具有显著的提高，使得试剂盒具有创造性。（2）本申请的引物、探针、靶序列及其配比等均不同于对比文件2，探针和引物的设计需要付出创造性劳动才可以获得，本申请的试剂盒能够对PCR产物进行实时监测，内标的加入可以部分消除终产物定量造成的不准确性。引物和探针的选择都需要付出创造性劳动，本申请的试剂盒中配套了一对引物和一条探针引物。PRRSV基因的独特特点在于病毒基因组的每个读码框和相邻的读码框有部分重叠，对比文件2中选用ORF6与PRRSV变异最大的基因ORF5重叠（详情参见附件1）。对比文件2的靶基因为ORF6，本申请是更保守、更优的ORF7。本申请减少使用内标探针，降低了成本，对比文件2中利用内标探针建立了传统荧光定量方法，检测繁琐、重复性差，加入内标只是一种半定量的方法，而利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是最准确、重复性最好的定量方法，已得到全世界的公认和广泛引用。本申请完成一个循环检测时间仅为8分钟左右，而对比文件约24分钟，取得了意料不到的技术效果。
经形式审查合格，国家知识产权局于2017年10月18日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月15日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：（1）权利要求1的试剂盒中使用Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II和One Step RT-PCR buffer III，而对比文件1中相应使用的是Taq酶、AMV逆转录酶和One Step RNA PCR混合液；（2）权利要求1中只有一对引物，还加入了序列SEQ ID NO:3的探针，用于实时荧光PCR（real-time）检测，而对比文件1中不包括探针，没有采用实时RT-PCR检测。基于上述区别技术特征可以确定，本申请实际解决的技术问题是提供一种检测PRRSV的实时RT-PCR试剂盒。对于区别技术特征（1），Ex Taq HS和PrimerScript RT Enzyme Mix II均为分子生物领域PCR试验中的常规试剂，本领域技术人员可常规选择能够发挥高效率的产品，而选定Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II和One Step RT-PCR buffer III；对于区别技术特征（2），实时RT-PCR检测方法具有通过荧光信号对PCR进程进行定量分析的优点，本领域技术人员为了提高检测效率、便于观察，可以根据需要常规使用实时RT-PCR技术，并且，对比文件2公开了一种猪蓝耳病病毒实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法，包括（1）设计针对猪蓝耳病病毒的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；（2）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；（3）配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（4）选定反应条件及程序，上机检测。可见，对比文件2公开的实时RT-PCR检测中只需要一对引物和一条探针，本领域技术人员可以根据需要对扩增引物进行设计或在现有技术中进行选定，如对比文件1中的SEQ ID NO：5和6。对比文件2中同时加入了探针序列，且作用与在本申请中的作用相同；探针的设计和特异性筛选是本领域的常规技术，并且，也没有证据表明上述区别技术特征的采用给技术方案带来了预料不到的技术效果。因此，权利要求1不具备创造性。权利要求2-6进一步限定的技术特征或者已经被对比文件1或2公开，或者属于本领域的常规技术，因此，权利要求2-6也不具有创造性。
复审请求人于2019年02月02日提交了意见陈述书，没有修改申请文件。复审请求人认为：对比文件1中三对引物同时使用才能达到检测效果，而本申请只使用其中一对引物就能达到检测PRRSV的用时短、敏感且高效的效果，这种效果主要通过设计配对一条探针、使用扩增性能有效的Hot Start型DNA聚合酶Ex Taq HS和具有高扩增活性、高热稳定性以及无细菌核酸污染的新型反转录酶PrimeScript RT Enzyme Mix II实现。对比文件1并没有提供任何使用一对引物、没有提供使用后续提高扩增性能的酶的启发就能达到此效果的启示，对比文件2虽然也使用一对引物，一条探针，但效果截然不同。市面上没有针对对比文件2的试剂盒，因而创造性的产品并不是通过理论的常规可以容易达到的。此外，本申请使用的引物及探针克服了对比文件2使用内标才能解决“消除终产物定量造成的不准确性”，从而减缓了使用内标的繁琐步骤，效果更灵敏，用时更短，节约时间和资源。对比文件1、2仅给出了检测PRRSV的常规思路以及用于检测PRRSV的特异性基因来源，并未公开任何有关缩短时间的技术内容，本申请权利要求1提供的试剂盒在缩短检测时间的同时，还具有非常好的灵敏性，能用于快速检测低微含量的PRRSV，具有预料不到的技术效果。
2019年05月10日合议组发出合议组成员变更通知书。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段没有提交修改的申请文件，因此本复审请求审查决定以驳回决定针对的文本，即申请日2013年06月29日提交的说明书第1-7页（第1-27段）、说明书摘要、摘要附图、说明书附图第1页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-2页、以及2016年06月23日提交的权利要求第1-6项为审查基础。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，对于发明所请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情形，如果现有技术给出了将区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，使得本领域技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进现有技术并获得要求保护的技术方案，则该技术方案是显而易见的。
权利要求1要求保护一种用于检测PRRSV的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒，包含One Step RT-PCR bufferIII、Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II、阴性对照，其特征在于：还包含有阳性对照、序列SEQ ID NO:1至 SEQ ID NO:2的扩增引物和序列SEQ ID NO:3的探针引物的混合物。
对比文件1公开了一种用于猪繁殖与呼吸综合症病毒（PRRSV）的检测试剂盒，并公开了以下技术内容：试剂盒包含RNA酶抑制剂、AMV逆转录酶、Taq酶、无RNA酶水、One Step RNA PCR混合液、阴性对照以及序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6引物的混合物，阳性对照（参见对比文件1的权利要求1-7）。其中本申请权利要求1中的扩增引物SEQ ID NO：1和2与对比文件1中的SEQ ID NO：5和6相同。
权利要求1和对比文件1相比，区别技术特征在于：（1）权利要求1的试剂盒中使用Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II和One Step RT-PCR buffer III，而对比文件1中相应使用的是Taq酶、AMV逆转录酶和One Step RNA PCR混合液；（2）权利要求1中只有一对引物，还加入了序列SEQ ID NO:3的探针，用于实时荧光PCR（real-time）检测，而对比文件1中包括三对引物，不包括探针，没有采用实时荧光RT-PCR检测。基于上述区别技术特征可以确定，本申请实际解决的技术问题是提供一种检测PRRSV的实时荧光RT-PCR试剂盒。
对于区别技术特征（1），Ex Taq HS是具有校正功能耐热脱氧核糖核酸聚合酶，PrimerScript RT Enzyme Mix II是反转录酶混合液，One Step RT-PCR buffer III是RT-PCR反应缓冲液体系，均为分子生物领域PCR试验中的常规试剂，在对比文件1中已经公开了使用Taq酶、AMV逆转录酶和One Step RNA PCR混合液的基础上，本领域技术人员可常规选择能够发挥相同或相似作用的其他高效率的产品，而选定Ex Taq HS、PrimerScript RT Enzyme Mix II和One Step RT-PCR buffer III是本领域技术人员的常规选择；
对于区别技术特征（2），实时荧光RT-PCR检测方法具有通过荧光信号对PCR进程进行定量分析的优点，本领域技术人员为了提高检测效率、便于观察，可以根据需要常规使用实时荧光RT-PCR技术，并且，对比文件2公开了一种猪蓝耳病病毒实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法，包括（1）设计针对猪蓝耳病病毒的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；（2）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；（3）配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（4）选定反应条件及程序，上机检测（参见对比文件2权利要求1-5）。其中，猪蓝耳病病毒即为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）。可见，对比文件2公开的实时荧光RT-PCR检测中只需要一对引物和一条探针，本领域技术人员可以根据需要对扩增引物进行设计或在现有技术中进行选定，如对比文件1中的SEQ ID NO：5和6。对比文件2中同时加入了探针序列，且作用与在本申请中的作用相同；探针的设计和特异性筛选是本领域的常规技术，本领域技术人员可以根据需要进行设计，并通过常规试验对其功能进行验证。并且，也没有证据表明上述区别技术特征的采用给技术方案带来了预料不到的技术效果。
综上所述，在对比文件1的基础上，结合对比文件2和本领域常规技术获得权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，因此，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2中进一步限定了引物和探针的浓度和配比，确定引物和探针的浓度和配比对于本领域技术人员来说是常规技术。权利要求3中进一步限定了扩增出的核酸序列，该目标核酸序列也已被对比文件1公开（参见对比文件1权利要求9、序列9）。权利要求4的附加技术特性进一步限定了荧光基团，所述的荧光基团已被对比文件2公开（参见对比文件2的权利要求2）。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求5中进一步限定了阳性对照为构建的pMD-228阳性质粒，pMD-18T质粒载体是本领域常用的质粒，权利要求5中所述的引物和目标核酸已被对比文件1公开（参见对比文件1权利要求1和7，序列5，6，9），构建含目的核酸的阳性质粒是常规技术。从属权利要求6中进一步限定了试剂盒中各组分的配比，根据需要调整和确定PCR试验盒中所需的各种试剂的配比对于本领域技术人员来说是常规技术。因此在其引用的权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求5和6也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
3、对复审请求人相关意见的评述
合议组认为：本申请的引物已经被对比文件1所公开，并且在对比文件1中所获得的目标产物也是相同的，本领域技术人员可以知晓，通常情况下，选定一对扩增引物即可完成目标DNA序列的扩增，因而选用对比文件1中的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6是容易做到的。同时，对比文件2中公开的实时荧光定量RT-PCR技术也是本领域已知的基因扩增和检测技术，其操作简单、实时观测等优点都是本领域技术人员所熟知的，对比文件1和对比文件2都是用于检测PRRSV，扩增出病毒特异性片段，进行检测，因而本领域技术人员有动机利用对比文件1中已经公开的引物，并不采用内标进行扩增，采用对比文件2中公开的实时荧光定量RT-PCR技术进行实时监测。对比文件2中也是使用一对引物和一条探针进行配套的，其所能达到的技术效果与本申请是相似的。探针的设计属于本领域的常规技术，本领域技术人员有能力设计特异性探针并对其效果进行验证，并不需要花费创造性劳动。Ex Taq HS和PrimeScript RT Enzyme Mix II均为市售产品，其发挥的作用为Taq DNA聚合酶和逆转录酶的作用，而本领域技术人员熟知市售产品的特点，可以对其进行常规选择，其所能达到的高特异性、高热稳定性、高扩增活性等技术优点所带来的技术效果也是可以预期的。并且，市场上没有相同或相似的检测试剂盒和疫苗并不表明本申请具有创造性。完成一个循环检测时间与选用的反转录体系中使用的反转录酶相关，而本领域技术人员对已知的反转录试剂盒的效率均有了解，为了提高反应效率，采用已知的高效率的反转录酶、Taq酶及逆转录反应缓冲液体系是常规选择，能够提高检测效率也是本领域技术人员可以预期的。综上所述，请求人陈述的理由不具有说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年05月26日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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