发明创造名称：复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法
外观设计名称：
决定号：181463
决定日：2019-06-18
委内编号：1F260565
优先权日：
申请（专利）号：201610972723.7
申请日：2016-11-03
复审请求人：安徽理工大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：武立民
合议组组长：万俊杰
参审员：刘天佐
国际分类号：C02F3/34，C12N1/20，C12N1/14，C12R1/38，C12R1/645，C02F101/38
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求与最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术在整体上存在启示，使得本领域的技术人员在面对所要解决的技术问题时有动机采用该区别特征来改进最接近的现有技术并获得权利要求的技术方案，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610972723.7、名称为“复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法”的发明专利申请（下称本申请）。本申请的申请人为安徽理工大学，申请日为2016年11月3日，公开日为2017年3月22日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年6月15日驳回了本申请，其理由是：权利要求1-10相对于对比文件1（CN 105505850A，公开日为2016年4月20日）、对比文件2（“聚丙烯酰胺生物降解研究进展”，丁海燕等，《油气田地面工程》，第35卷，第3期，第17-18页，公开日为2016年3月20日）和本领域常规技术手段的结合不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所针对的文本为：2016年11月3日提交的说明书第[0001]-[0071]段、说明书附图图1、说明书摘要和摘要附图；2018年5月29日提交的权利要求第1-10项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征是：将球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液作为复合降解菌悬液，在一定的聚丙烯酰胺浓度下,将球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液按1:X的体积比加入到降解培养基中，调制含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至5～7、培养温度25～50℃等条件下，通过生物降解作用对聚丙烯酰胺进行降解。
2. 根据权利要求1所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌的活化及驯化包括以下步骤：
1)球红假单胞菌：a、活化培养：从冰箱中取出甘油保存的菌种放置一段时间，用无菌吸管吸取0.3～0.5ml的液体菌种，转到液体基础培养基中，培养一段时间后再转接一次，即可得到复活的球红假单胞菌；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述球红假单胞菌基础培养基配方为：NH4CL 1g、K2HPO4 0.2g、NaCL 0.5g、NaHCO3 1g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCL2·4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、1000ml去离子水、PH＝7，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MgCL2 2g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂；
2)黄孢原毛平革菌：a、活化培养：取在冰箱中斜面保藏的黄孢原毛平革菌，在无菌操作台上挑取斜面培养基上的孢子接种到新鲜的黄孢原毛平革菌固体培养基上，挑取成熟的孢子再接种到固体培养基上，等长出成熟的孢子作为活化的菌种使用，并置于冰箱中保藏；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述黄孢原毛平革菌基础培养基配方为：马铃薯淀粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，维生素B18mg，PH＝6，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂。
3. 根据权利要求2所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌驯化培养步骤的条件为：在120rpm，30℃的条件下培养。
4. 根据权利要求3所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液分别通过以下步骤制备得到：
1)球红假单胞菌：接种驯化后的球红假单胞菌到液体培养基中，置于温度30℃、转速120rpm的摇床中震荡培养40h；再取适量发酵培养液于低速离心机上4000转离心10min，倒出上清液，用无菌生理盐水冲洗底部的细菌，采用血球计数器计数，最后配制成109/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。
2)黄孢原毛平革菌：在30℃培养5d的黄孢原毛平革菌固体培养基上加入10mL的无菌生理盐水，并用灼烧的接种环刮下一定量的孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶。然后，放置30℃200r/min的摇床充分振荡5h。最后，通过采用血球计数器计数配制成107/ml的孢子悬液，4℃冰箱保存备用。
5. 复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在降解培养基中加入体积比为1:X球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液，搅拌均匀，其中：球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液按(1～5)％的比例加入降解培养基中；
2)调制含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至4～9、培养温度25～50℃、摇床转速70～170r/min。
6. 根据权利要求5所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述的复合菌降解试验中基础培养基：马铃薯淀粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g、MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，维生素B1 8mg，PH＝6；液体培养基：同上不加入琼脂；降解培养基：葡萄糖2g、酒石酸铵0.2g、MgSO4 1g、KH2PO4 3g、维生素B1 8mg，微量元素10ml、去离子水1000mL、Ph＝6，其中微量元素：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g。
7. 根据权利要求5所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：选择混合菌的接种量分别为(2～4)％。
8. 根据权利要求7所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至5～7。
9. 根据权利要求8所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节含聚丙烯酰胺的降解培养基温度至30～35℃。
10. 根据权利要求9所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：所述调节降解试验摇床转速130～150r/min。”
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年9月12日向国家知识产权局提出了复审请求，同时提交了修改后的权利要求书。修改后的权利要求书如下：
“1. 复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征是：1)在降解培养基中加入体积比为1:1球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液，搅拌均匀，其中：球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液按(2～4)％的比例加入降解培养基中；
2)调制含聚丙烯酰胺的降解培养基PH至5～7、培养温度30～35℃、摇床转速130～150r/min；
所述球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌的活化包括以下步骤：
1)球红假单胞菌：a、活化培养：从冰箱中取出甘油保存的菌种放置一段时间，用无菌吸管吸取0.3～0.5ml的液体菌种，转到液体基础培养基中，培养一段时间后再转接一次，即可得到复活的球红假单胞菌；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述球红假单胞菌基础培养基配方为：NH4CL 1g、K2HPO4 0.2g、NaCL 0.5g、NaHCO3 1g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCL2·4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、1000ml去离子水、PH＝7，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MgCL2 2g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂；
2)黄孢原毛平革菌：a、活化培养：取在冰箱中斜面保藏的黄孢原毛平革菌，在无菌操作台上挑取斜面培养基上的孢子接种到新鲜的黄孢原毛平革菌固体培养基上，挑取成熟的孢子再接种到固体培养基上，等长出成熟的孢子作为活化的菌种使用，并置于冰箱中保藏；b、驯化培养：在150ml的锥形瓶中加入灭菌的50ml的基础培养基和20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，然后将活化的0.5ml菌接入锥形瓶中，在摇床中震荡培养。培养两天后倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，往后每24h倒出20ml的上清液，再加入20ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，持续5天。再将菌液按2％的比例接入到250ml的锥形瓶中(含50ml基础培养基和150ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液)，3d后每24h倒出50ml的上清液，再加入50ml含聚丙烯酰胺的灭菌的浓缩池溢流液，此过程持续7d,待菌液变浑浊。取驯化液体培养基中的菌接种到相应的固体培养基上，待在恒温培养箱中长出完好的菌落或成熟的孢子，挑取形态较好的菌落或孢子接种到斜面培养基上进行保藏；
所述黄孢原毛平革菌基础培养基配方为：马铃薯淀粉20g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g，琼脂20g，去离子水1000mL，维生素B18mg，PH＝6，其中微量元素配方为：CuSO4·5H2O 0.4g、ZnSO4·7H2O 0.6g、MnCL2·4H2O 0.5g；所述液体培养基配方为：同固体培养基配方，不加入琼脂；
所述球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌驯化培养步骤的条件为：在120rpm，30℃的条件下培养。
2. 根据权利要求1所述的复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法，其特征在于：
球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液分别通过以下步骤制备得到：
1)球红假单胞菌：接种驯化后的球红假单胞菌到液体培养基中，置于温度30℃、转速120rpm的摇床中震荡培养40h；再取适量发酵培养液于低速离心机上4000转离心10min，倒出上清液，用无菌生理盐水冲洗底部的细菌，采用血球计数器计数，最后配制成109/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。
2)黄孢原毛平革菌：在30℃培养5d的黄孢原毛平革菌固体培养基上加入10mL的无菌生理盐水，并用灼烧的接种环刮下一定量的孢子置于盛有玻璃珠的三角瓶。然后，放置30℃ 200r/min的摇床充分振荡5h。最后，通过采用血球计数器计数配制成107/ml的孢子悬液，4℃冰箱保存备用。”
复审请求人在复审请求书中认为：（1）对比文件2并未公开黄孢原毛平革菌可以与哪些菌复配，本领域技术人员不能显而易见地预期将黄孢原毛平革菌与球红假单胞菌复配后产生哪些技术效果；（2）并不是任意两个具有相同功能的菌进行复配都能够具有协同作用，同时例举专利文献证明苯醚-咯菌腈与乐斯本复配的防治效果（40.21%）低于苯醚甲环唑与乐斯本的复配效果（44.13%），即三种农药复配后的防治效果低于未明确记载存在增效作用的两种农药复配的效果；（3）不同单菌对于降解的环境要求并不相同，对比文件2仅公开了黄孢原毛平革菌对大庆油田聚驱采油污水PAM的降解作用，本领域技术人员不能显而易见地想到将其用于降解煤泥水的PAM。
经形式审查合格，国家知识产权局依法受理了该复审请求，于2018年9月18日发出了复审请求受理通知书，并将案卷转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年2月22日向复审请求人发出复审通知书，指出：修改后的权利要求1中将“体积比为1:X”的技术特征修改为“体积比为1:1”，该修改超出了原申请文件记载的范围，不符合专利法第33条的规定。为了提高行政效率，复审通知书中一并指出，即使复审请求人将权利要求1的上述技术特征修改回原申请文件记载的“体积比为1:X”，以克服修改超范围的缺陷，这样修改后的技术方案相对于对比文件1、对比文件2和本领域常规选择的结合也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对于复审请求人的意见，合议组认为：（1）对比文件2给出了黄孢原毛平革菌对PAM有特殊的酶催化降解能力、混合菌群之间的协同作用和这种协同作用达到的技术效果、以及未来应重点研究混合菌降解PAM时的协同作用的正面教导，本领域技术人员有动机选用黄孢原毛平革菌，与球红假单胞菌形成混合菌群降解PAM的技术方案，并能够预期取得较好的降解效果。（2）在对比文件2给出的正面教导下，选用黄孢原毛平革菌与其他菌（例如对比文件1中的球红假单胞菌）的混合菌用以降解PAM，从而通过协同作用提高PAM的降解效果，这是本领域技术人员容易想到的。复审请求人例举的专利文献仅是涉及几种具体农药的复配关系，与微生物复合菌种的效果并无关联，更与球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌的复合效果无关。（3）虽然对比文件2的污水性质与本申请存在差别，但其并不影响本领域技术人员从中获得PAM生物降解的技术启示，本领域技术人员可以在对比文件1公开的培养条件基础上，对相应的条件和参数做出适当的调整，由此获得较好的实验效果。
复审请求人于2019年3月1日提交了意见陈述书和修改后的权利要求书，所作修改仅为将权利要求1中的“体积比为1:1”的技术特征修改为“体积比为1:X”。
在上述程序的基础上，合议组认为，本案事实已经清楚，可以作出复审请求审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
本复审请求审查决定所针对的审查文本为：2016年11月3日提交的说明书第[0001]-[0071]段、说明书附图图1、说明书摘要和摘要附图；2019年3月1日提交的权利要求第1-2项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果一项权利要求与最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术在整体上存在启示，使得本领域的技术人员在面对所要解决的技术问题时有动机采用该区别特征来改进最接近的现有技术并获得权利要求的技术方案，则该权利要求不具备创造性。
1、关于权利要求1
权利要求1请求保护复合菌种降解煤泥水中残留聚丙烯酰胺的方法。对比文件1公开了一种煤泥水中残留聚丙烯酰胺的生物降解方法（参见对比文件1说明书第[0005]-[0020]段），包含以下步骤：
步骤一、种子的制备（相当于活化培养）：从冰箱保存的球红假单胞菌试管中挑取一环接入到富集培养基中，菌株经活化和扩大培养后，再按体积百分比2%接入到富集培养基中，在温度为30℃，初始pH＝6，搅拌速度为130r/min时培养36h，可得用于驯化的降解菌。
步骤二、降解菌的驯化（相当于驯化培养）：取上述步骤一制得的种子按体积百分比1～5%接入到含40～80ml富集培养基和10～30ml含聚丙烯酰胺煤泥水的驯化培养基中，在温度为25～40℃，初始pH＝5～7，搅拌速度为100～140r/min时培养54～72h，倒出10～30ml的上清液，然后加入10～30ml含聚丙烯酰胺煤泥水，持续培养4～7d；取第一阶段驯化的菌液按体积百分比1～5%接入到含100～150ml含聚丙烯酰胺煤泥水和30～50ml富集培养基的驯化培养基中，在温度为25～40℃，初始pH＝5～7，搅拌速度为100～140r/min时培养54～72h，倒出30～50ml的上清液，然后加入30～50ml含聚丙烯酰胺煤泥水，持续培养7～10d。所述富集培养基的制备：将下述重量的原料混合而成即可制得富集培养基：NH4Cl 1g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0.5g、NaHCO3 1g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCl2?4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、1000ml去离子水、pH＝7。所述第一阶段驯化培养基是由40～80ml富集培养基和10～30ml含聚丙烯酰胺煤泥水混合而成，第二阶段驯化培养基是由100～150ml含聚丙烯酰胺煤泥水和30～50ml富集培养基混合而成。所述煤泥水是选煤厂浓缩池经絮凝剂聚丙烯酰胺处理后的上清液，含聚丙烯酰胺10～50mg/L。
步骤三、单菌落的分离：取上述步骤二驯化后的菌株培养液，稀释后涂布于含100mg/L聚丙烯酰胺的基础固体培养基上，在温度为30℃时培养72h，将长出的单菌落在固体培养基上划线纯化两次。所述基础固体培养基的制备：将下述重量的原料混合而成即可制得基础固体培养基：NH4Cl 1g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0.5g、NaHCO3 1g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCl2?4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、0.1g聚丙烯酰胺、1000ml去离子水、琼脂20g、pH＝7。
步骤四、菌悬液的配制：取上述步骤三纯化后的菌落，接种到富集培养基中，在温度为30℃，初始pH＝6，搅拌速度为130r/min时培养48h，再取培养液于3000转离心10min，倒出上清液，用无菌生理盐水冲洗底部的细菌，采用血球计数器计数，最后配制成109/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。
步骤五、将上述步骤四保存的菌悬液，按体积百分比1～5%接入到基础培养基中，在温度为25～40℃，初始pH＝5～7，搅拌速度为100～140r/min时培养5～8d，即可对聚丙烯酰胺取得较好的降解效果。所述基础培养基的制备：将下述重量的原料混合而成即可制得基础培养基：NH4Cl 1g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0.5g、NaHCO3 1g、CH3COONa 2g、酵母膏1g、MnCl2?4H2O 0.3g、微量元素5ml、琼脂20g、0.1g聚丙烯酰胺、1000ml去离子水、pH＝7。
权利要求1所要求保护的技术方案与对比文件1所公开的内容相比，其区别特征在于：权利要求1中采用球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液的复合降解菌悬液，限定了球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液的体积比和两种菌种的活化、驯化培养条件。基于上述区别特征可确定，权利要求1实际解决的技术问题是提高PMA降解效果。
对于上述区别特征，对比文件2公开了聚丙烯酰胺生物降解的研究进展，其中在单菌株降解PAM方面：根据韩昌福等人的实验，以大庆油田聚驱采油污水PAM为实验材料，人工配制实验废水，发现黄孢原毛平革菌对PAM有特殊的酶催化降解能力，其对聚丙烯酰胺的降解率基本可以达到50%。在混合菌株降解PAM方面：常帆等人从山西长庆油田泥浆池废液和周围土壤中获得菌株：假单胞菌CJ419和枯草芽孢杆菌FA16，研究显示，假单胞菌降解率为30.4%，枯草芽孢杆菌的降解率为25%，两种降解菌混合5d后降解率是80.3%。结论：混合菌株之间的协同作用能有效提高降解率，多菌混合作用相对于单菌作用效果更好，所以未来生物降解含有PAM的污水时，仍需以混合菌株间的协同作用为重点研究方向（参见对比文件2第17-18页第3、4部分）。由此可见，对比文件2明确教导了混合菌株降解PAM时，其协同作用和降解效果相对于单菌株来说更好，而黄孢原毛平革菌对PAM有特殊的酶催化降解能力，在对比文件2的上述教导下，本领域技术人员有动机将单菌降解率达到50%的、对PAM有特殊酶催化降解能力的黄孢原毛平革菌与对比文件1中球红假单胞菌的菌悬液作为复合降解菌悬液，用以降解聚丙烯酰胺，并通过常规实验设计确定适宜的球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液的体积比。至于两种菌种活化、驯化培养的具体条件，也是本领域技术人员在对比文件1公开内容的基础上做出的常规选择，并且也没有证据表明正是由于这样的选择而取得了何种预料不到的技术效果。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规选择而得到权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，因此，权利要求1要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、关于权利要求2
权利要求2的附加技术特征对球红假单胞菌菌悬液和黄孢原毛平革菌孢子悬液的制备方法做了进一步的限定，然而对比文件1公开了：将驯化后的球红假单胞菌菌株培养液进行单菌落的分离，然后进行菌悬液的配制：取上述单菌落纯化后的菌落，接种到富集培养基中，在温度为30℃，初始pH＝6，搅拌速度为130r/min时培养48h，再取培养液于3000转离心10min，倒出上清液，用无菌生理盐水冲洗底部的细菌，采用血球计数器计数，最后配制成109/ml的菌悬液，4℃冰箱保存备用。在对比文件1公开的上述内容的基础上，本领域技术人员可以通过常规实验设计优化得到权利要求2中的附加技术特征。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的情况下，权利要求2也不具备专利法第22条第3款的创造性。
（三）关于复审请求人的意见
复审请求人答复复审通知书的意见归纳如下：（1）菌株之间不只会有协同作用，菌株之间也有拮抗作用，对比文件2仅仅给出了假单孢菌和枯草芽孢杆菌混合菌株可以起到协同作用，并未公开球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌之间可以起到协同作用，所以对比文件2不能给出技术启示。（2）不同单菌之间对于降解的环境要求并不相同，对比文件2仅公开了黄孢原毛平革菌对以大庆油田聚驱采油污水PAM为实验材料，人工配制实验废水的降解作用，并没有公开其在煤泥水中是否还具有相同的特殊的酶催化降解能力，因为采油污水和煤泥水属于两种完全不同的体系，甚至在某些方面还是相反的，本领域技术人员不能显而易见想到将黄孢原毛平革菌用于降解煤泥水的PAM。
对此，合议组认为：（1）虽然不是任意两个具有相同功能的菌进行复配都能够具有协同作用，对比文件2也没有明确表明黄孢原毛平革菌可以与哪些菌复配，但是对比文件2给出了黄孢原毛平革菌对PAM有特殊的酶催化降解能力、混合菌群之间的协同作用和这种协同作用达到的技术效果、以及未来应重点研究混合菌降解PAM时的协同作用的正面教导，具体而言，对比文件2至少教导了以下三点：①单菌株降解PAM：黄孢原毛平革菌对PAM有特殊的酶催化降解能力，其对聚丙烯酰胺的降解率基本可以达到50%；②混合菌株降解PAM：混合菌株之间的协同作用能有效提高降解率，多菌混合作用相对于单菌作用效果更好，例如，假单胞菌和枯草芽孢杆菌的混合菌的协同作用相比单菌时能大幅度提高PAM的降解率；③结论：未来生物降解含PAM的污水时，仍需以混合菌株间的协同作用为重点研究方向。因此，在对比文件2给出的黄孢原毛平革菌对污水中的PAM有特殊的酶催化降解能力以及混合菌群之间有很好协同作用的正面教导下，选用黄孢原毛平革菌与其他菌（例如对比文件1中的球红假单胞菌）的混合菌用以降解PAM，从而通过协同作用提高PAM的降解效果，这是本领域技术人员容易想到的，且没有反面教导采用球红假单胞菌和黄孢原毛平革菌的混合菌时会产生拮抗作用。因而，即使对比文件2中公开了若干种可以用于降解PAM的微生物种类，并不会妨碍本领域技术人员将其给出的教导与对比文件1公开的同样对PAM具有良好降解效果的菌种相结合形成混合菌种并通过有限的实验得到本申请的技术方案。
（2）虽然对比文件2的采油污水性质与本申请的煤泥水存在差别，但并无证据证明这样的差别会使得适用于采油污水中PAM降解的所述菌种不能应用于煤泥水的PAM降解，因而并不影响本领域技术人员从对比文件2中获得通过生物降解处理污水中PAM的技术启示，从而有动机尝试将其应用至煤泥水中PAM的降解，本领域技术人员可以通过普通实验手段，例如环境条件的正交试验、梯度浓度的驯化培养实验等，在对比文件1公开的培养条件基础上，对相应的条件和参数做出适当的调整，以获得所需的降解效果。
综上，复审请求人陈述的意见不具备说服力，合议组对此不予支持。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年6月15日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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