发明创造名称：一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法
外观设计名称：
决定号：181332
决定日：2019-06-14
委内编号：1F249825
优先权日：
申请（专利）号：201410368834.8
申请日：2014-07-30
复审请求人：晶叶（青岛）生物科技有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：尹昕
合议组组长：王亦然
参审员：韩世炜
国际分类号：C12P21/06
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项发明的技术方案仅仅是本领域技术人员在现有技术基础上的常规调整，也没有证据显示其取得了预料不到的技术效果，则该发明对本领域技术人员而言是显而易见的。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410368834.8，名称为“一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法”的发明专利申请。申请人为晶叶（青岛）生物科技有限公司。本申请的申请日为2014年07月30日，公开日为2014年11月12日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年02月24日发出驳回决定，以权利要求1不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本申请，驳回决定所依据的文本为申请日即2014年07月30日提交的权利要求第1项、说明书第1-12段以及说明书摘要。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法，包括如下步骤：将预处理之后的风干鱼鳞置入20倍体积的0.5mol/L柠檬酸中，加入鱼鳞质量的2%微生物蛋白酶，搅拌提取24h，所述微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得，具有胰蛋白酶作用，提取液加入一定量的NaCl溶液至最终浓度为0.9mol/L过夜，在4℃条件10000×g离心15min，弃去上清，加入10倍体积的0.5mol/L醋酸中溶解，重复盐析和离心操作一次，在10倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液中透析12h，每4h换一次溶液，再用蒸馏水透析至中性，冷冻干燥备用，此时得到的是酶溶性胶原蛋白，冷冻干燥备用。”
驳回决定认为，本申请权利要求1请求保护一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法。对比文件1（CN 101307348A，公开日2008年11月19日）公开了一种从淡水鱼鱼鳞中制备胶原蛋白的方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）权利要求1中柠檬酸浓度为0.5mol/L；（2）权利要求1采用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶，用量为鱼鳞质量的2%，搅拌提取24h，微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得；（3）权利要求1中盐析后4℃条件10000×g离心15min，沉淀用10倍体积的醋酸溶解；透析先用10倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液12h，每4h换一次溶液，而对比文件1是直接蒸馏水透析。实际解决的技术问题是用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白。
对于区别技术特征（1），对比文件1公开了重量/体积比1∶10至1∶20的柠檬酸或苹果酸溶液脱钙处理预处理鱼鳞，以及脱钙鱼鳞按重量/体积比为1∶5至1∶20加入质量浓度为1％的含质量分数为0.1-2％胃蛋白酶或0.5-1％碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液。由此可见，以柠檬酸或苹果酸进行“除灰”是现有技术，本领域技术人员可以对其用量和浓度进行调整；对于区别技术特征（2），对比文件2（CN 1335405A，公开日2002年02月13日）公开的胶原蛋白制备工艺用胰蛋白酶和微生物酶中的一种或两种进行酶解，因此本领域技术人员可以预期使用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶的效果。对比文件3（CN 101709319A，公开时间2010年05月19日）也公开了鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备，其中采取了米曲霉接种麸皮制得的麸皮曲，利用麸皮曲的蛋白酶来酶解鱼皮鱼鳞，因而本领域技术人员能够想到采用微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得蛋白酶。酶用量、搅拌及其时间是本领域技术人员经过有限的试验容易调整的；对于区别技术特征（3），盐析-透析是本领域蛋白纯化的惯用手段，在对比文件1公开内容的基础上，在20℃以下、5000-50000g离心10-30min的范围内调整温度、离心力、离心时间以及根据沉淀的量调整醋酸的体积是容易的。对比文件4（汪海波等，“草鱼鱼鳞胶原蛋白的提取及其部分生物学性能”，《水产学报》第36卷第4期，公开日2012年04月15日）公开了胶原蛋白沉淀依次用0.1 mol/L的乙酸（即醋酸）和蒸馏水透析，因此先采用0.1 mol/L的醋酸溶液再用蒸馏水透析是本领域技术人员容易想到的，且用量和换液时间是本领域技术人员经过有限的试验容易调整的。综上所述，权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年04月10日向国家知识产权局提出了复审请求。复审请求人认为：对于驳回决定所认定的本申请权利要求1与对比文件1的区别特征2，对比文件2公开了胶原蛋白的制备，其需要先用盐酸处理再用氢氧化钠进行碱处理后再用胰蛋白酶或者微生物酶处理。本申请的微生物蛋白酶的处理前提是鱼鳞经过柠檬酸处理，两者处理的底物不一样，并且本申请的微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得。由此可见，对比文件2中的酶与本申请中的酶所起的作用不一样，对比文件2没有给出技术启示。此外，对比文件3公开的鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法采用的是麸皮曲发酵获得的蛋白酶，其作为底物的鱼皮鳞是经过高温处理，而不是采用本申请的柠檬酸处理。因此对比文件3没有给出技术启示。对比文件4也没有公开采用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法。就技术效果而言，采用本发明的方法最终纯化获得胶原蛋白的水平达到0.25-0.26g/10g鱼鳞。综上所述，权利要求1作为一个整体，相对于对比文件1-4与公知常识的结合具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月28日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，对比文件1已经公开了柠檬酸或苹果酸溶液脱钙处理预处理鱼鳞，其目的是脱钙和调节pH。此外，本申请的实施例中并没有记载柠檬酸的使用，而是以醋酸或者盐酸替代的。对比文件1还公开了胃蛋白酶或碱性蛋白酶提取胶原蛋白，引用对比文件2的目的是其公开了胰蛋白酶和微生物酶对胶原蛋白提取的技术启示，引用对比文件3的目的是其公开了利用麸皮曲的蛋白酶酶解鱼皮鱼鳞的技术启示，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3，本领域技术人员可以预期蛋白酶提取胶原蛋白的技术效果。本申请是在酶法的基础上选用微生物来源的蛋白酶进行胶原蛋白提取，这是本申请声称的发明点，然而，利用微生物来源的蛋白酶提取胶原蛋白在现有技术（如对比文件2、3）中已有记载。事实上，本申请没有具体记载选自何种微生物来源的蛋白酶。另外，本申请仅记载胶原蛋白的得率为0.25-0.26g/10g，即2.5-2.6%，而对比文件1的得率达到26.4-38.9%（参见说明书第4页第3-4行），因而本申请没有产生预料不到的技术效果。故坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年04月04日向复审请求人发出复审通知书，其中指出：本申请权利要求1请求保护一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法，与对比文件1公开的从淡水鱼鱼鳞中制备胶原蛋白的方法相比，区别技术特征在于：（1）权利要求1采用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶进行提取，用量为鱼鳞质量的2%，搅拌提取24h，微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得；对比文件1采用胃蛋白酶或0.5-1％碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液进行提取。（2）制备方法的具体参数不同。权利要求1采用0.5mol/L的柠檬酸脱钙，对提取液4℃条件下离心，沉淀用10倍体积的醋酸溶解，透析先用10倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液12h，每4h换一次溶液，再用蒸馏水透析；对比文件1采用4-12%的柠檬酸脱钙，未限定离心温度和醋酸溶解体积，对提取物用蒸馏水进行透析。根据上述区别技术特征，本申请相对于对比文件1实际解决的技术问题是提供一种节约成本的新的提取鱼鳞胶原蛋白的方法。
对于上述区别技术特征（1），对比文件3也公开了一种鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其中采取了米曲霉接种麸皮制得的麸皮曲，利用麸皮曲的蛋白酶来酶解鱼皮鱼鳞，而且对比文件3采用微生物发酵麸皮下脚料获得了廉价的蛋白酶，显著降低胶原蛋白的生产成本，其解决的技术问题和本发明相同，本领域技术人员可以从对比文件3得到技术启示，将微生物发酵获得的蛋白酶用于鱼鳞胶原蛋白的提取制备方法。至于微生物酶的用量、搅拌时间等参数均是本领域技术人员通过常规实验可以进行合理选择的。对于区别技术特征（2），对比文件1采用了10到20倍体积的4-12%的柠檬酸或苹果酸溶液对鱼鳞进行脱钙；盐析-透析是本领域蛋白纯化的惯用手段，在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员可以在20℃以下、5000-50000g离心10-30min的范围内调整温度、离心力、离心时间等获得合适的参数，也可以根据沉淀的量调整醋酸的体积。此外，对比文件4公开了胶原蛋白沉淀依次用0.1 mol/L的乙酸（即醋酸）和蒸馏水透析，因此对提取物先采用0.1 mol/L的醋酸溶液再用蒸馏水透析是本领域技术人员容易想到的，且适宜的用量和时间参数也是本领域技术人员经过有限的试验容易获得的。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件3、4以及本领域的公知常识，本领域技术人员通过有限的试验以获得权利要求1所要求保护的技术方案是显而易见的，且该技术方案并未产生任何预料不到的技术效果，因此该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定。
对于复审请求人的意见，合议组认为，本申请采用柠檬酸对鱼鳞进行脱钙处理后用微生物来源的蛋白酶提取胶原蛋白，根据说明书的记载，其采用微生物蛋白酶的目的在于降低生产成本和减小环境污染。但柠檬酸与微生物酶之间并不存在特定的组合关系。对比文件1和3都记载了从鱼鳞中提取胶原蛋白的方法，其中作为最接近的现有技术，对比文件1中公开的操作步骤和原理都与本发明类似，脱钙步骤也采用了与本发明同样的柠檬酸制剂，虽然提取步骤使用的是胃蛋白酶或碱性蛋白酶，但当本领域技术人员面对降低成本等技术问题时，有动机在对比文件1的基础上选择更加经济的微生物发酵产生的微生物蛋白酶。微生物蛋白酶是本领域一种已知的提取胶原蛋白的工具，对比文件3公开了利用麸皮曲的蛋白酶酶解鱼皮鱼鳞的技术方案，其目的与本发明采用微生物蛋白酶的目的相同，也是为了降低成本，提升经济效益。虽然对比文件3作为底物的鱼皮鳞经过高温处理，没有采用柠檬酸，但这只是脱钙程序不同，并不影响本领域技术人员从对比文件3中获得采用微生物酶提取胶原蛋白的技术启示。此外，尽管本申请声称发明对现有技术的贡献在于采用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白，但并没有具体记载选自何种微生物来源的蛋白酶，也没有证据表明其取得了预期不到的技术效果，本发明的胶原蛋白的得率为0.25-0.26g/10g，即2.5-2.6%，而对比文件1中胶原蛋白的得率达到26.4-38.9%（参见说明书第4页第3-4行）。因此复审请求人的意见不能说明本发明具备创造性。
针对复审通知书，复审请求人于2019年04 月30日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。除了重申复审请求书中的意见外，复审请求人进一步指出：对比文件3公开了鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其采用的是麸皮曲发酵获得的蛋白酶，其中公开的步骤包括：（2）鱼皮鱼鳞高温提取：将鱼皮鱼鳞与3-8倍鱼皮鱼鳞质量的水混合，110-121℃提取30-90min后， 冷却至45-65℃，得鱼皮鱼鳞提取液；（3）酶解：将鱼皮鱼鳞提取液与鱼皮鱼鳞提取液重量4％-8％的麸皮曲混合，于45-65℃酶解6-10h。对比文件3选择麸皮曲发酵获得的蛋白酶的原因是：对鱼皮、鱼鳞胶原蛋白酶解液中金属离子和腥味具有较好的吸附作用；所得胶原蛋白肽粉末产品中灰分含量明显低于其他酶解方法，且无腥味。因此对比文件3选择麸皮曲发酵获得的蛋白酶的作用是去除腥味。然而，本申请采用的蛋白酶是以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得，酵素一般是用酵母参与发酵制备得到的（微生物菌种与对比文件3的不同）。本申请采用该蛋白酶的目的是出于降低成本的目的，更为重要的是提高鱼鳞中胶原蛋白的获得水平(0.26g/10g鱼鳞)。可见，两者蛋白酶在各自申请中所起到的实际作用并不相同，因此，对比文件3并没有给出技术启示。对比文件4也没有公开上述区别技术特征。此外，本申请权利要求1具有显著进步，与对比文件1相比，本发明采用自产微生物蛋白酶提取酶溶性胶原蛋白，降低了生产成本，同时最大限度避免了酸提取法可能造成的环境污染。综上所述，权利要求1作为一个整体相对于对比文件1-4与公知常识的结合具有突出的实质性特点与显著的进步，符合专利法第22条第3款的规定。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审程序中没有提交修改的权利要求书，因此本复审请求审查决定所针对的文本与驳回决定针对的文本相同，即复审请求人于2014年07月30日提交的权利要求第1项、说明书第1-12段以及说明书摘要。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果发明的技术方案仅仅是本领域技术人员在现有技术基础上进行的常规调整，也没有证据显示其取得了预料不到的技术效果，则该发明对本领域技术人员而言是显而易见的。
本申请权利要求1请求保护一种利用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白的方法，包括如下步骤：将预处理之后的风干鱼鳞置入20倍体积的0.5mol/L柠檬酸中，加入鱼鳞质量的2%微生物蛋白酶，搅拌提取24h，所述微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得，具有胰蛋白酶作用，提取液加入一定量的NaCl溶液至最终浓度为0.9mol/L过夜，在4℃条件10000×g离心15min，弃去上清，加入10倍体积的0.5mol/L醋酸中溶解，重复盐析和离心操作一次，在10倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液中透析12h，每4h换一次溶液，再用蒸馏水透析至中性，冷冻干燥备用，此时得到的是酶溶性胶原蛋白，冷冻干燥备用。
对比文件1公开了一种从淡水鱼鱼鳞中制备胶原蛋白的方法，具体步骤为：(1)对鱼鳞进行预处理，彻底清洗鱼鳞并自然风干或置于50摄氏度以下干燥；(2)将预处理鱼鳞按重量/体积比为1∶10至1∶20加入4-12%的柠檬酸或苹果酸溶液；(3)向步骤(2)所得的脱钙鱼鳞按重量/体积比为1∶5至1∶20加入质量浓度为1％的含质量分数为0.1-2％胃蛋白酶或0.5-1％碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液，每次处理12-48h，提取完毕后用纱布过滤，将得到的滤液置20℃以下5000-50000g离心10-20min，取上清液，加NaCl至其终浓度为0.7-0.9 mol/L，盐析过夜，5000-50000g离心10-30min，取沉淀，将所得的沉淀用0.50mol/L乙酸（即醋酸）溶解，重复盐析1次，再将得到的沉淀用蒸馏水透析1-3d，每天更换蒸馏水2-3次，将透析液冷冻干燥，即得未变性的鱼鳞胶原蛋白（参见权利要求1）。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：（1）权利要求1采用具有胰蛋白酶作用的微生物蛋白酶进行提取，用量为鱼鳞质量的2%，搅拌提取24h，微生物蛋白酶采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得；对比文件1采用胃蛋白酶或0.5-1％碱性蛋白酶的苹果酸或柠檬酸溶液进行提取。（2）制备方法的具体参数不同。权利要求1采用0.5mol/L的柠檬酸脱钙，对提取液4℃条件下离心，沉淀用10倍体积的醋酸溶解，透析先用10倍体积的0.1mol/L的醋酸溶液12h，每4h换一次溶液，再用蒸馏水透析；对比文件1采用4-12%的柠檬酸脱钙，未限定离心温度和醋酸溶解体积，对提取物用蒸馏水进行透析。根据说明书的记载，本发明采用微生物蛋白酶提取酶溶性胶原蛋白，降低了生产成本，同时最大限度避免酸提取法可能造成的环境污染。根据上述区别技术特征，本申请相对于对比文件1实际解决的技术问题是提供一种节约成本的新的提取鱼鳞胶原蛋白的方法。
对于上述区别技术特征（1），对比文件3也公开了一种鱼皮鱼鳞胶原蛋白的制备方法，其中采取了米曲霉接种麸皮制得的麸皮曲，利用麸皮曲的蛋白酶来酶解鱼皮鱼鳞（参见权利要求1，说明书第0014段），而且对比文件3采用微生物发酵麸皮下脚料获得了廉价的蛋白酶，显著降低胶原蛋白的生产成本（参见说明书第0015段）。因此，区别技术特征（1）在对比文件3中解决的技术问题和本发明相同，本领域技术人员可以从中得到技术启示，将微生物发酵获得的蛋白酶用于鱼鳞胶原蛋白的提取制备方法。至于微生物酶的用量、搅拌时间等参数均是本领域技术人员通过常规实验可以进行合理选择的。
对于区别技术特征（2），对比文件1采用了10到20倍体积的4-12%的柠檬酸或苹果酸溶液对鱼鳞进行脱钙；盐析-透析是本领域蛋白纯化的惯用手段，在对比文件1公开内容的基础上，本领域技术人员可以在20℃以下、5000-50000g离心10-30min的范围内调整温度、离心力、离心时间等获得合适的参数，也可以根据沉淀的量调整醋酸的体积。此外，对比文件4公开了胶原蛋白沉淀依次用0.1 mol/L的乙酸（即醋酸）和蒸馏水透析（参见第554页第1.2节），因此对提取物先采用0.1 mol/L的醋酸溶液再用蒸馏水透析是本领域技术人员容易想到的，且适宜的用量和时间参数也是本领域技术人员经过有限的试验容易获得的。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件3、4以及本领域的公知常识，本领域技术人员通过有限的试验以获得权利要求1所要求保护的技术方案是显而易见的，且该技术方案并未产生任何预料不到的技术效果，因此该权利要求所要求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款关于创造性的规定。
对于复审请求人的意见，合议组认为，首先，对比文件3公开了利用麸皮曲的蛋白酶酶解鱼皮鱼鳞的技术方案，其中记载的技术效果除了采用麸皮曲的蛋白酶的可以去除鱼皮、鱼鳞胶原蛋白酶解液中金属离子和腥味的作用以外，还包括麸皮曲获得蛋白复合酶廉价、产物得率高、酶制剂成本低等优点（参见说明书第0015段）。这些都与本发明采用微生物蛋白酶的目的相同，即降低成本，提升经济效益。对比文件3提到的去除鱼皮鱼鳞胶原蛋白酶解液中腥味的作用并不会影响本领域技术人员从中获得本发明的技术启示。其次，本发明并没有限定具体的微生物蛋白酶，权利要求中和说明书中记载了所述的微生物蛋白酶的来源为采用自有微生物为主以酵素发酵的下脚料培养基进行发酵获得。本领域技术人员已知酵素是以动植物、菌类等原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性的产品。对比文件3也公开了采用微生物为主以发酵的下脚料培养基进行发酵的过程。本申请权利要求1记载的“自有微生物”并没有限定所述微生物为酵母菌，说明书中对此也没有定义，也没有证据表明所述“自有微生物”产生的蛋白酶必然具有胰蛋白酶活性。此外，尽管本申请声称发明对现有技术的贡献在于采用微生物酶提取鱼鳞胶原蛋白，但并没有具体记载选自何种微生物来源的蛋白酶。同时也没有证据表明本发明取得了预料不到的技术效果，本发明的胶原蛋白的得率为0.25-0.26g/10g，即2.5-2.6%，而对比文件1中胶原蛋白的得率达到26.4-38.9%（参见说明书第4页第3-4行）。综上所述，复审请求人的意见不能说明本发明具备创造性。
基于以上事实和理由，合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年02月24日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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