发明创造名称：一种骨肽溶液的制备方法
外观设计名称：
决定号：181216
决定日：2019-06-13
委内编号：1F248787
优先权日：
申请（专利）号：201510044085.8
申请日：2015-01-28
复审请求人：南京新百药业有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：曹克浩
合议组组长：孙俊荣
参审员：李金光
国际分类号：C12P21/06，C07K1/34
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：对于本发明和最接近现有技术公开了从骨组织中提取骨肽的相似技术构思的情形，当主要区别特征在于预处理还联合减压提取和超声粉碎的步骤、酶解顺序和次数以及相应处理参数时，如果其他现有技术给出了将上述步骤引入最接近现有技术的技术启示，同时本领域技术人员出于生产需要在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的上述步骤顺序及处理参数，从而易于获得本发明的技术方案，那么该发明相对于现有技术的组合以及常规技术手段不具有突出的实质性特点和显著的进步。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510044085.8、名称为“一种骨肽溶液的制备方法”的发明专利申请。申请人为南京新百药业有限公司。
经实质审查，针对申请人于申请日提交的说明书摘要、说明书第1-33段；2017年08月01日提交的权利要求第1-8项，国家知识产权局原审查部门于2018年01月04日以权利要求1-8不符合专利法第22条第3款规定为由驳回了本申请。
驳回决定认为：权利要求1请求保护一种骨肽溶液的制备方法，与对比文件1（“猪股骨降血压肽酶解条件的优化及其分离纯化的研究”，刘小红，中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑，2014年第03期，B024-178，2014年03月15日）的区别技术特征在于：（1）预处理的工艺流程参数不同：权利要求1中在脱脂后再次进行高压蒸煮，然后再低压维持，并结合超声辅助破碎细胞，固液分离并浓缩得到浓缩液，而对比文件1在脱脂后直接干燥粉碎制得骨粉；（2）酶解工艺流程参数不同：权利要求1中两步酶解，而对比文件1中三步酶解；（3）后续分离纯化的工艺流程参数不同。基于上述区别技术特征，本发明实际解决的技术问题是：提供一种骨肽溶液的制备方法。然而，对于上述区别特征（1），本领域技术人员有动机尝试在高压蒸煮后进行低压维持，其技术效果可以预期。而且，在高温高压处理之前先进行煮沸后静置脱脂，属于本领域的常规操作。并且对比文件2（“超声波辅助酶解制备猪肩胛骨降血压肽的工艺及酶解效果比较”，陈昌琳等，食品工业科技，第36卷第2期，第217-226页，2015年01月15日）给出了“对酶解底物进行超声预处理能够疏松底物结构，显著提高酶解效率”的启示。因此，为了提高酶解效率，本领域技术人员有动机对动物的四肢骨进行进一步的超声波辅助处理以破碎细胞，使四肢骨的结构更加松散，从而利于后续的酶解操作。为了进一步提高酶解效率，本领域技术人员有动机对预处理后的溶液进行固液分离并浓缩，而蒸发浓缩属于本领域的常规技术手段。对于上述区别特征（2），对比文件1已经给出了“三步酶解猪股骨制备多肽”的启示，因此本领域技术人员有动机尝试采用两步酶解法水解动物四肢骨制备多肽。并且本领域技术人员有动机尝试采用胃蛋白酶、糜蛋白酶和胰蛋白酶水解动物四肢骨制备多肽。而且，本领域技术人员能够通过有限的试验对其操作条件进行常规调整，如酶解反应的最适温度、pH值、加酶量、反应时间，且本发明的上述参数也均在常规范围内。对于上述区别特征（3），对灭酶后的溶液进行分离纯化是本领域的常规操作。而且，本领域技术人员能够根据需要选择合适的分离纯化手段，如过滤、超滤，并能够通过有限的试验对其工艺流程参数进行常规调整，其技术效果可以预期。因此，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术手段得出权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于相同或相似的理由，权利要求2-8的附加技术特征或是被对比文件1或2公开（参见对比文件1第1.1.3节，表1-1），或是属于本领域常规技术手段.因此权利要求2-8同样不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种骨肽溶液的制备方法，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的动物四肢骨洗涤后粉碎，加水煮沸、静置1-2小时脱脂，然后移入高压釜，升温至110-125℃，压力维持在2.7-3.0kg/cm2，保持1.5-2.0小时，然后减压到0.5-0.8kg/cm2，减压时间为2.0-2.5小时；再用超声波辅助破碎细胞后进行固液分离得滤液；将滤液蒸发浓缩，得浓缩液；
(2)将步骤(1)中所得浓缩液维持在30-40℃，添加酸至pH值2.5-3.0，加入浓缩液重量2.0-3.0％的胃蛋白酶或糜蛋白酶消化6-8小时，得消化液，命名为消化液A；
(3)向步骤(2)所得消化液A中添加碱液至pH值7.5-8.0，加入浓缩液重量0.5-1.5％的胰蛋白酶消化6-8小时，温度维持在30-40℃，得消化液，命名为消化液B；
(4)将步骤(3)所得消化液B升温灭酶处理，然后冷却，静置分层，除去上层悬浮物和底层沉淀，取中间澄清液过滤得提取液；
(5)将步骤(4)所得提取液超滤，收集超滤液，即得骨肽溶液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的动物四肢骨为猪、牛或羊四肢骨中任一种或几种混合物；粉碎后四肢骨头粒径为0.5-1.5cm的骨块。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中加入的水量为粉碎后的动物四肢骨重量的3-4.5倍。
4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的滤液蒸发浓缩为浓缩到原滤液体积的50-60％；所述的超声波辅助破碎细胞条件：超声波频率为26-30kHz，超声波功率为290-330w，温度为40-45℃，时间为15-20min；使用管道过滤器进行固液分离得滤液。
5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述酸为盐酸或 磷酸；酸的浓度为1.5-2.0mol/L。
6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述碱为氢氧化钠或氢氧化钾；碱的浓度为2.0-2.5mol/L。
7. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中升温除酶的温度为87-100℃，处理时间15-20min；冷却至1-5℃。
8. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的超滤条件为：超滤膜为PS-10聚砜膜或聚丙烯(PP)中空纤维膜；超滤膜的截留量为9000-10000Da；超滤操作压力为0.07-0.09MPa；超滤温度为30-40℃；超滤时间为35-45min。”
申请人南京新百药业有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月12日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交修改的权利要求书，主要将从属权利要求2的特征“动物四肢骨为猪、牛或羊四肢骨中任一种或几种混合物”限入权利要求1。
修改后的权利要求1如下：
“1. 一种骨肽溶液的制备方法，其具体步骤如下：
(1)取新鲜的动物四肢骨洗涤后粉碎，加水煮沸、静置1-2小时脱脂，然后移入高压釜，升温至110-125℃，压力维持在2.7-3.0kg/cm2，保持1.5-2.0小时，然后减压到0.5-0.8kg/cm2，减压时间为2.0-2.5小时；再用超声波辅助破碎细胞后进行固液分离得滤液；将滤液蒸发浓缩，得浓缩液；其中述的动物四肢骨为猪、牛或羊四肢骨中任一种或几种混合物；
(2)将步骤(1)中所得浓缩液维持在30-40℃，添加酸至pH值2.5-3.0，加入浓缩液重量2.0-3.0％的胃蛋白酶或糜蛋白酶消化6-8小时，得消化液，命名为消化液A；
(3)向步骤(2)所得消化液A中添加碱液至pH值7.5-8.0，加入浓缩液重量0.5-1.5％的胰蛋白酶消化6-8小时，温度维持在30-40℃，得消化液，命名为消化液B；
(4)将步骤(3)所得消化液B升温灭酶处理，然后冷却，静置分层，除去上层悬浮物和底层沉淀，取中间澄清液过滤得提取液；
(5)将步骤(4)所得提取液超滤，收集超滤液，即得骨肽溶液。”
复审请求人认为：
（1）对比文件1和2以猪股骨为原料来制备降血压肽，本发明以动物四肢骨为原料制备含有钙磷铁等无机元素和氨基酸片段以及多种生长因子的多肽混合物，其中含有骨质蛋白肽、骨血蛋白肽和骨胶原蛋白肽等，因此本发明与对比文件1、2的研究对象不同、目标产物不同，最佳工艺不同，因此无法从对比文件1获得启示。
（2）发明人选取几十种酶做了大量创造性实验的基础上得发现胰蛋白酶、胃蛋白酶和糜蛋白酶的组合水解动物四肢骨制备多肽，相比于其他酶活更强，水解效率更高。此外，现有技术中没有将减压提取辅助超声波破碎细胞来制备骨肽溶液的报道。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月19日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理，并于2019年04月09日发出复审通知书，指出：
权利要求1与对比文件1的技术方案的技术构思都是从骨组织通过预处理（如高压蒸煮）-多步法酶解消化-超滤纯化-提取骨肽，二者的区别特征在于：①预处理不同：权利要求1的预处理包括高压蒸煮后进行减压提取和超声波破碎处理，对比文件1的预处理仅仅进行高压蒸煮；②酶解流程及其相应参数不同：权利要求1使用酸性-碱性两步酶解法进行消化，对比文件1使用碱性-酸性-中性三步酶解法进行消化，以及两种酶解法的相应技术参数随之不同；③权利要求1是先进行脱脂再进行高压蒸煮，对比文件1是先高压蒸煮再进行脱脂。
然而，对于区别特征①，一方面，对比文件2（参见第218页第1.2.1节）给出了“酶解之前先对底物进行超声预处理能够疏松底物结构，显著提高酶解效率”的启示。另一方面，为了提高酶解效率，本领域技术人员根据对比文件2的启示，易于想到在对比文件1公开的高压蒸煮预处理骨组织的基础上，进一步联合减压提取处理和超声波辅助处理以破碎细胞，使四肢骨的结构更加松散，从而利于后续的酶解操作。这也是显而易见的，并且根据各个步骤调整相应的技术参数，如温度、压力、处理时间等，也是可以根据生产需要通过简单摸索即可调整得到权利要求1的技术参数。
对于区别特征②，在对比文件1已经给出了“三步酶解猪股骨制备多肽”的启示情况下，对比文件1进一步公开了如何根据酶解适宜条件和酶解工艺来选择胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶这六种酶（参见第2.3.2.1节，表2-1），同时糜蛋白酶也是本领域常用的、可用于替换胃蛋白酶的酸性水解酶，因此本领域技术人员有动机选择各种酸性、碱性、中性蛋白酶等不同种类酶中的一种或数种，并且在适合酶水解的条件下来进行酶解，即通过有限的试验即可从对比文件1的三步酶解法摸索得到二步酶解法，以及相应的酶解参数（如适宜温度、H值、加酶量、反应时间等）。
对于区别特征③，由于去除油脂是进行酶解骨质材料的前提，因此蒸煮骨材料后去除油脂是常规技术手段，还是先去除油脂再进行蒸煮骨材料，二者是具有相同效果的常规替换手段，属于本领域技术人员易于想到和调整的。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术手段得出权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。基于相同或相似的理由，从属权利要求2-8也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对复审请求人的意见，复审通知书认为：（1）本申请以及对比文件1均公开了骨头主要成分有胶原蛋白及磷、钙等矿物质，其中的骨胶原蛋白肽可以提取治疗活性成分（参见本申请说明书第0002段）或营养强化剂（参见对比文件1第1.1.1节）。因此，对比文件1和2的降血压肽实质上属于骨肽的下位概念。同时，猪股骨和包含猪在内的动物四肢骨均为提取骨肽的常见来源。因此，在对比文件1公开了“骨预处理（即高压蒸煮）→三步酶解→灭酶分离→超滤纯化”）的技术构思的情况下，本领域技术人员根据对比文件2给出的“超声预处理以提高酶解骨底物的效率”的技术启示，以及根据对比文件1公开了各种酶的适宜酶解条件，并出于生产需要（如节约成本和简化工艺）而通过简单摸索即可确定本申请的技术方案，即骨预处理（即高压蒸煮、减压提取、超声波破碎）→二步酶解→灭酶分离→超滤纯化。在这种情况下，即使复审请求人将降血压肽排除在骨肽范围之外，本领域技术人员根据二者的研究对象、目标产物、技术构思具有极其相似的关联性，仍然可以获得相应的技术启示。（2）一方面，复审请求人所述的各种水解酶均属于常规的商业化水解酶，本领域技术人员熟知生物活性和适宜酶解条件（参见对比文件1第2.3.2.1节，表2-1）。因此，本领域技术人员根据生产需要（如节约成本和简化工艺）而选择两步法酶解，并根据已知的适宜酶解条件通过简单摸索即可确定所述酶组合。另一方面，如前所述，减压提取处理属于提取活性成分的常规技术手段，能够使溶液沸腾，产生的溶媒蒸汽气泡可加速细胞膜的破裂，使细胞内的有效成分得以较快的溶出，增加物质的溶解和扩散速度，有利于效应成分浸出。因此，为了使得高压蒸煮后的骨组织充分释放效应成分以提高酶解效率，本领域技术人员易于想到在对比文件1公开的高压蒸煮预处理骨组织的基础上，进一步联合减压提取处理和超声波辅助处理以破碎细胞，使四肢骨的结构更加松散，从而利于后续的酶解操作，这也是显而易见的。
针对复审通知书，复审请求人于2019年05月23日提交了意见陈述书，但未提交修改的申请文本。
复审请求人认为：
（1）本发明采用高温高压联合减压处理，最后超声辅助破碎细胞的三种技术联合处理。由于本发明与对比文件2相比骨粉悬浊液和骨细胞组织存在本质区别，悬浊液是一种分散体系，对比文件2采用超声的目的是使骨粉悬浊液充分溶解在蒸馏水中，而本申请采用三种技术的联合处理使有效成分的溶出率显著提高，因此具有创新性。
（2）对比文件1中酶解方法使骨中的有效成分不能最大限度的提取出来。而本发明是将预处理的浓缩液调节pH后加酶进行酶解，将得到的消化液A不经过任何处理直接进入下一步的酶解，在第二步酶解之后才进行升温灭酶，冷却、静置分层处理，这种直接酶解的方法可以提高骨中的有效成分的提取效率。因此本申请具有创新性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了修改的权利要求书，因此本复审决定所针对的文本为：复审请求人于申请日提交的说明书摘要、说明书第1-33段；2018年04月12日提交的权利要求第1-8项。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
对于本发明和最接近现有技术公开了从骨组织中提取骨肽的相似技术构思情形，当主要区别特征在于预处理还联合减压提取和超声粉碎的步骤、酶解顺序和次数以及相应处理参数时，如果其他现有技术给出了将上述步骤引入最接近现有技术的技术启示，同时本领域技术人员出于生成需要在现有技术的基础上仅仅通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验可以得到的上述步骤顺序及处理参数，从而易于获得本发明的技术方案，那么该发明相对于现有技术的组合以及常规技术手段不具有突出的实质性特点和显著的进步。
本案中，权利要求1要求保护一种从动物四肢骨制备骨肽溶液的方法，其主要步骤包括：对脱脂的骨头先后进行高压蒸煮、减压处理后，释放骨细胞组织；超声波破碎骨细胞后，分离浓缩液；将浓缩液先后进行酸性蛋白酶（即胃蛋白酶或糜蛋白酶）、碱性蛋白酶（即胰蛋白酶）消化后，灭酶活；通过超滤得到骨肽溶液。根据本申请说明书第0006、0020段的记载，本发明旨在通过减压提取辅助超声波破碎细胞，并联合酶解法，以提高生产率，以及减少酸碱试剂，能保存活性骨肽，提高产品质量。因此，权利要求1的主要技术构思在于通过“骨预处理（即高压蒸煮、减压提取、超声波破碎）→二步酶解→灭酶分离→超滤纯化”
对比文件1公开了从猪股骨（相当于动物四肢骨）中制备降血压肽（相当于骨肽）的方法，主要步骤包括：将猪股骨进行高压蒸煮后，分离油脂并烘干粉碎；将骨粉在最优水解条件下，先后进行碱性蛋白酶、酸性蛋白酶（如木瓜蛋白酶）、中性蛋白酶（如风味蛋白酶）消化后灭酶活；采用截留分子量为10KDa, 5KDa两种规格的超滤离心管对酶解液进行超滤分离，得到了分子量大于10kDa, 5kDa-10kDa和小于5kDa的3个组分，其中，分子量<5kda的组分ace抑制率最高，ic50值为1.4022mg>
权利要求1与对比文件1的技术构思都是从骨组织通过预处理（如高压蒸煮）-多步法酶解消化-超滤纯化-提取骨肽，其区别特征在于：①预处理不同：权利要求1的预处理包括高压蒸煮后进行减压提取和超声波破碎处理，对比文件1的预处理仅仅进行高压蒸煮；②酶解流程及其相应参数不同：权利要求1使用酸性-碱性两步酶解法进行消化，对比文件1使用碱性-酸性-中性三步酶解法进行消化，以及两种酶解法的相应技术参数随之不同；③权利要求1是先进行脱脂再进行高压蒸煮，对比文件1是先高压蒸煮再进行脱脂。
基于以上区别特征结合本申请的发明目的，本申请实际解决的技术问题是：通过引入减压提取和超声波破碎以及改进酶解步骤，从而提供一种改进提取骨肽的制备方法。
然而，对于区别特征①，一方面，由于动物的四肢骨比较坚硬，接触面积小，直接与蛋白酶反应较为困难，因此需要对其进行处理以利于后续的酶解反应。因此，“研究者尝试不同的物理方法处理底物蛋白或酶，比如煮沸、高压、微波、超微粉碎、超声波、超声波-微波协同法，这些方法以改变生物大分子的分子构型及空间结构，不同程度地提高产物的活性。其中，超声波的空化效应、机械作用和热效应，可以使骨质的底物结构变得松散，利于酶与底物接触，提高酶解效率，提高蛋白质转化率”（参见对比文件2第217页）。基于此，对比文件2具体公开了称取一定量的骨粉，以底物浓度5%的比例加入蒸馏水制成骨粉悬浊液，在指定的超声条件下超声处理指定的时间。超声结束后，进行酶解（参见第218页第1.2.1节），即对比文件2给出了“酶解之前先对底物进行超声预处理能够疏松底物结构，显著提高酶解效率”的启示。
另一方面，本领域技术人员既熟知减压提取处理属于提取活性成分的常规技术手段，也知晓长时间的高温高压处理能够让四肢骨变得较为松散，而随后的低压处理能够使溶液沸腾，产生的溶媒蒸汽气泡可加速细胞膜的破裂，使细胞内的有效成分得以较快的溶出，增加物质的溶解和扩散速度，有利于效应成分浸出。
由于对比文件2和对比文件1涉及从相同骨组织中提取相同的骨肽（即降血压肽），并且鉴于高压蒸煮后进行减压提取的步骤，其符合与对比文件2所体现的超声波破碎法等“能改变生物大分子的分子构型及空间结构，使得底物结构变得松散，有利于酶与底物接触”的原理，因此为了提高酶解效率，本领域技术人员根据对比文件2的启示，易于想到在对比文件1公开的高压蒸煮预处理骨组织的基础上，进一步联合减压提取处理和超声波辅助处理以破碎细胞，使四肢骨的结构更加松散，从而利于后续的酶解操作。这也是显而易见的，并且根据各个步骤调整相应的技术参数，如温度、压力、处理时间等，也是可以根据生产需要通过简单摸索即可调整得到权利要求1的技术参数。
对于区别特征②，在对比文件1已经给出了“三步酶解猪股骨制备多肽”的启示情况下，对比文件1进一步公开了如何根据酶解适宜条件和酶解工艺来选择胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶这六种酶（参见第2.3.2.1节，表2-1），同时糜蛋白酶也是本领域常用的、可用于替换胃蛋白酶的酸性水解酶，因此本领域技术人员有动机选择各种酸性、碱性、中性蛋白酶等不同种类酶中的一种或数种，并且在适合酶水解的条件下来进行酶解，即通过有限的试验即可从对比文件1的三步酶解法摸索得到二步酶解法，以及相应的酶解参数（如适宜温度、H值、加酶量、反应时间等）。
对于区别特征③，由于去除油脂是进行酶解骨质材料的前提，因此蒸煮骨材料后去除油脂是常规技术手段，还是先去除油脂再进行蒸煮骨材料，二者是具有相同效果的常规替换手段，属于本领域技术人员易于想到和调整的。
综上所述，在对比文件1的基础上结合对比文件2以及本领域的常规技术手段得出权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员来说是显而易见的。因此，权利要求1请求保护的技术方案不具备突出的实质性特点和显著的进步，因而不符合专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2-3进一步限定了在前权利要求的骨块粒径和加水量。然而，这些附加技术特征属于本领域技术人员根据生产需要而易于调整得到的，因此在独立权利要求1不具备创造性的情况下，从属权利要求2-3相对于对比文件1结合对比文件2以及常规技术手段也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求4-7分别限定在前权利要求的蒸发浓缩比例、超声波破碎细胞条件、酸碱试剂的使用量、灭酶失活的条件。然而，对比文件2详细公开了超声波破碎细胞工艺中，如何根据影响后续酶解效果（如酶活抑制率）来确定和调整超声功率、超声时间、超声温度以及超声后酶解时间（参见第219页第2节），因此本领域技术人员根据对比文件2的教导，易于通过合理试验而确定超声波破碎细胞条件。至于蒸发浓缩比例、酸碱试剂使用量、灭酶失活条件，均是本领域技术人员在本申请和对比文件1的技术构思的指引下，并根据生产需要而通过常规技术手段进行简单调整即可得到的。因此在所引用的在前权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求4-7相对于对比文件1结合对比文件2以及常规技术手段也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求8进一步限定在前权利要求的超滤条件。然而超滤是本领域常用的纯化手段，本领域技术人员能够通过有限的试验对其工艺流程参数进行常规调整，如超滤膜的选择、超滤膜的截留量、操作压力、温度、时间，且本发明的上述参数也均在常规范围内。因此在所引用的在前权利要求不具备创造性的情况下，从属权利要求8相对于对比文件1结合对比文件2以及常规技术手段也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）关于复审请求人的意见
针对复审请求人的意见，合议组认为：
（1）对比文件2给出了“酶解之前先对底物进行超声预处理能够疏松底物结构，显著提高酶解效率”的启示，因此本领域技术人员通过简单试验即可在对比文件1针对的基础上得到本申请所述三种技术联合处理的技术方案。至于本申请的骨细胞溶液和对比文件1-2的骨粉悬浊液的区别，由于二者的发明目的都是需要将骨细胞进行破碎释放并分离所需的骨肽产物，并且骨粉中也富含骨细胞，因此二者底物没有实质区别。
（2）在对比文件1公开了“骨预处理（即高压蒸煮）→三步酶解→灭酶分离→超滤纯化”）的技术构思的情况下，本领域技术人员根据对比文件2给出的“超声预处理以提高酶解骨底物的效率”的技术启示，以及根据对比文件1公开了各种酶的适宜酶解条件，并出于生产需要（如节约成本和简化工艺）而通过简单摸索即可确定本申请涉及两步酶解法的技术方案，即骨预处理（即高压蒸煮、减压提取、超声波破碎）→二步酶解→灭酶分离→超滤纯化的技术方案。在这种情况下，请求人也未举证证明其相对于对比文件1或2具有显著提高的有效成分溶出率。
综合所述，复审请求人的意见不具备说服力。
根据以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月04日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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