发明创造名称：玉米锌铁调控转运体ZmZIP4和ZmZIP6基因及其应用
外观设计名称：
决定号：180856
决定日：2019-06-13
委内编号：1F245823
优先权日：2013-05-31
申请（专利）号：201410239195.5
申请日：2014-05-30
复审请求人：河北农业大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：李美宣
合议组组长：李振鹏
参审员：潘俊宇
国际分类号：C12N15/29,C07K14/415,C12N15/82,A01H5/00
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款规定
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别特征，确定所述技术方案实际解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则发明是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410239195.5，名称为“玉米锌铁调控转运体ZmZIP4和ZmZIP6基因及其应用”的发明专利申请。申请人为河北农业大学。本申请的申请日为2014年05月30日，优先权日为2013年05月31日，公开日为2014年12月17日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月17日发出驳回决定，以权利要求1和2不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本发明专利申请，具体理由是：权利要求1请求保护从玉米中分离的锌铁调控转运体ZmZIP4基因在增加粮食作物种子锌含量中的应用，所述的锌铁调控转运体ZmZIP4基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本申请SEQ ID No.1序列由1161个碱基组成，所示的核苷酸序列具有终止子Tag，因而应当是全长序列，而且是根据目的基因ZmZIP4的OFR框设计引物扩增获得的。对比文件1（EMBL:HM048832.1，公开日：2011年06月05日）公开了一种玉米锌调控转运体ZmZIP4 mRNA，由1000个碱基组成，该1000个碱基与本申请SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的碱基1-1000的同一性为99.8%，区别仅在于，第200位的碱基不同，第199-201位的密码子对比文件1为GCG，编码丙氨酸，而本申请SEQ ID NO：1为GTG，编码缬氨酸。基于上述区别技术特征本申请实际解决的技术问题是提供另一种序列组成的玉米ZIP4 cDNA并将其应用于增加粮食作物种子锌含量。对于上述区别特征，根据对比文件1的技术教导，本领域技术人员有动机从其他锌含量高的玉米基因组克隆锌铁调控转运体ZmZIP4，而RACE技术是本领域比较成熟的基因克隆方法，本领域技术人员容易通过该技术获得可自然突变的锌铁调控转运体基因的全长序列及其编码的蛋白。本申请的SEQ ID No.1与对比文件1的锌铁调控转运体ZmZIP4 mRNA都分离自玉米，尽管二者存在一个碱基的差异，但缬氨酸和丙氨酸都是非极性氨基酸，性质相近，上述序列的差异可以合理预期是由于自然突变造成的，因而在对比文件1的锌铁调控转运体启示下，本领域技术人员有动机测定本申请SEQ ID No.1所示的ZmZIP4基因的锌铁调控转运功能和在提高种子锌含量中的应用，从而得到本申请权利要求1的技术方案。对比文件1的mRNA也是玉米锌调控转运体ZmZIP4 mRNA，本申请尽管证实在玉米中过表达SEQ ID No.1所示的ZmZIP4基因能提高种子中锌的含量，但并没有证实本申请的ZmZIP4基因相对于对比文件1取得了预料不到的效果。因而在对比文件1的基础上本领域技术人员结合常规方法获得权利要求1的技术方案是显而易见的，并且没有取得预料不到的效果，权利要求1相对于对比文件1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款有关创造性的规定。从属权利要求2进一步限定了权利要求1所述锌铁调控转运体基因可操作的与表达调控元件相连接，得到重组植物表达载体；将重组植物表达载体转化受体植物或植物细胞，培育得到转基因植物是本领域制备转基因植物的常规技术手段，因而，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。驳回决定所依据的文本为申请日2014年05月30日提交的说明书摘要、说明书第1-165段（即第1-14页）、摘要附图、说明书附图图1-图18（即第1-9页）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-6页；2017年07月11日提交的权利要求第1-2项（共1页）。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 从玉米(Zea mays)中分离的锌铁调控转运体ZmZIP4基因在增加粮食作物种子锌含量中的应用，所述的锌铁调控转运体ZmZIP4基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2. 按照权利要求1所述的应用，其特征在于，包括：将所述锌铁调控转运体ZmZIP4基因可操作的与表达调控元件相连接，得到重组植物表达载体；将重组植物表达载体转化受体植物或植物细胞，培育得到转基因植物。”
申请人河北农业大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年03月01日向专利复审委员会提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人认为：（1）生物科学是一门实验科学，具有高度的不可预测性。对比文件1尽管是EMBL所公开的序列，但仅仅是来源于玉米并且只是将该基因冠之以“玉米锌转运体mRNA”这一称谓，却没有证明其功能，对本领域技术人员来说，不能预测对比文件1所公开的基因属于ZIP家族基因，更不能确定该基因具有调控植物吸收、转运和储存锌和铁的功能。（2）让申请人在承担“证明对比文件1所公开的基因序列不具有玉米锌转运体的功能”这一举证责任显然是不合法理；在没有任何证据支持的情况下，审查员仅仅依据“对比文件1所公开的序列是EMBL所公开的序列”以及“该序列来源于玉米”这两点就认定对比文件1的基因序列属于ZIP家族基因并具有锌转运体的功能，这对申请人有失公允。（3）如本领域技术人员所知，即便获得一个“可能”具有某种功能的基因，要确定该基因在高等植物中具有何种具体的功能也是非常不容易；即使假定本领域技术人员根据对比文件1所公开的内容认为该基因具有锌铁转运体的功能的可能性较大，也不能由此推测权利要求1 的SEQ ID No.1所示的基因也具有提高种子中锌含量的功能。对于蛋白来说，仅仅一个关键位点的突变，其功能都有可能产生难以预测的变化。本领域技术人员不能推测用缬氨酸替换丙氨酸后，突变后的蛋白是否具有锌铁转运体的功能，更不能推测其是否具有增加种子中锌含量的功能。即便对于具有锌转运体功能的基因，也不能由此推测其必然具有增加种子中锌含量的功能。根据公开的文献可见，许多锌铁转运体并不能增加种子中锌或铁的含量。即便确证了某一转运体对于锌具有调控或转运的功能，也不能由此推测其具有增加种子中锌含量的功能。因此要获得权利要求1所述的能够提高作物种子中锌的含量的锌铁调控转运体是不容易实现的，需要付出大量的创造性劳动。
经形式审查合格，专利复审委员会于2018年04月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）对比文件1是EMBL公开的序列，EMBL是公认的全球性数据库，即使质疑也需要有合理的理由和证据。本申请SEQ ID No.1的扩增引物是根据ZmZIP4目的基因设计的，即特异性扩增ZmZIP4基因的引物，而模板来源的玉米自交系X178也是锌含量高的玉米品种，本申请也将SEQ ID No.1定义为ZmZIP4。因而，在本申请的SEQ ID No.1与对比文件1的锌铁调控转运体ZmZIP4 mRNA都分离自玉米，与对比文件1只具有一个性质相近的氨基酸的差异的情况下，可以合理预期上述突变是自然选择的结果，SEQ ID No.1属于ZIP家族基因。（2）ZIP基因家族在从胞外向胞内转运并在胞内进行锌运输过程中起着重要作用，其在植物的根、茎、根瘤、花、籽粒等部位表达，因而在SEQ ID No.1为ZmZIP4的基础上，利用特异性启动子，例如胚乳特异性启动子增加其在胚乳中的表达从而增加种子中锌的含量是本领域技术人员可以合理预期并可以利用常规手段实现的，本申请的SEQ ID No.1也并没有在提高种子锌含量方面相对于对比文件1的基因产生任何预料不到的效果。（3）复审请求人在答复第一次审查意见通知书时提交的参考文献在水稻籽粒中没有锌的富集或许与其实验方法有关，但是该文献同时也提示，在大麦中过表达锌铁转运体基因增加了锌在种子中的含量，因而该文献并不会阻碍本领域技术人员尝试将本申请的SEQ ID No.1用于增加种子中的锌含量。基于对比文件1，本领域技术人员不能保证SEQ ID No.1必然具有锌铁转运体的功能，以及增加种子中锌含量的功能，但是应该有一定的合理预期，在判断一项权利要求是否具备创造性的过程中，并非要求本领域技术人员对发明方案的改进有成功的把握并可以确切地预期取得的技术效果时，才能认为现有技术具有技术启示，相反，当本领域技术人员对选择的结果有合理的成功期待时，现有技术就会驱使其作出相应的选择，因而坚持原驳回决定。
随后，专利复审委员会成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月08日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件1的区别特征为：（1）第199-201位密码子不同，编码的氨基酸由丙氨酸变成了缬氨酸；（2）将其应用于增加粮食作物种子锌含量。基于上述区别特征，本申请实际解决的技术问题是提供另一种序列组成的玉米锌调控转运体ZIP4 cDNA的进一步用途。对于区别特征（1），本申请的SEQ ID No.1与对比文件1的锌铁调控转运体ZmZIP4 mRNA都分离自玉米，尽管二者存在一个碱基的差异，但缬氨酸和丙氨酸都是非极性氨基酸，性质相近，上述序列的差异可以合理预期是由于自然突变造成的。根据对比文件1的技术教导，本领域技术人员有动机从其他锌含量高的玉米基因组克隆另一种锌铁调控转运体ZmZIP4，而RACE技术是本领域比较成熟的基因克隆方法，本领域技术人员容易通过该技术获得可自然突变的锌铁调控转运体基因的全长序列及其编码的蛋白。 对于区别特征（2），本领域技术人员知道，ZIP基因家族在从胞外向胞内转运并在胞内进行锌运输过程中起着重要作用，其在植物的根、茎、根瘤、花、籽粒等部位表达，也就是说本领域技术人员知道ZmZIP4基因具有锌铁调控转运功能并有可能在植物的种子中提高锌含量。如申请人在答复第一次审查意见通知书时提交的参考文献（李素贞等，植物锌铁转运相关蛋白家族的研究进展，生物技术通报，2013年第2 期，第8-14 页）也公开了在大麦中过表达锌铁转运体基因增加了锌在种子中的含量，以及在水稻中过表达OsZIP4导致过量的锌聚集于根部。在面对增加玉米种子中的锌含量的实际需求时，本领域技术人员有动机验证获得的本申请SEQ ID No.1所示的锌调控转运体ZmZIP4基因的锌调控转运功能和增加种子中的锌含量的功能，必要时利用种子特异性启动子等本领域常规技术手段将其用于增加种子中的锌含量。可见，在对比文件1的启示下，本领域技术人员有动机结合本领域常规技术手段得到本申请权利要求1的技术方案，也没有取得预料不到的效果，权利要求1相对于对比文件1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款有关创造性的规定。从属权利要求2将权利要求1所述锌铁调控转运体基因可操作的与表达调控元件相连接，得到重组植物表达载体；将重组植物表达载体转化受体植物或植物细胞，培育得到转基因植物是本领域制备转基因植物的常规技术手段，因而，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
复审请求人于2019年02月25日提交了意见陈述书，但未修改申请文件。复审请求人认为：（1）尽管EMBL是公认的全球数据库，但它仅仅是一个DNA序列的数据库，主要用于核苷酸序列检索以及序列相似性的查询，不用于说明核苷酸序列的功能或活性；因此，根据EMBL-DNA数据库披露的内容，只能用于核苷酸序列检索以及序列是相似，不能从该数据库中披露的核苷酸序列获得其相关功能等信息。生物科学是一门实验科学，尤其涉及到确证某一基因在高等植物中的功能时，其具有高度的不可预测性，必须给出详实、全面、有信服力的功能验证数据才能确证其在高等植物中是否具有某一功能，在没有给出功能验证数据的情况下，仅仅根据基因序列是不能推测其在高等植物中的功能。鉴于对比文件1只是披露了核苷酸序列，在没有任何数据佐证的前提下，本领域技术人员来说不能合理预测对比文件1所公开的这段核苷酸序列属于ZIP家族基因，更不能确定该核苷酸序列具有调控植物吸收、转运和储存锌和铁的功能。（2）如本领域技术人员所知，即便获得一个“可能”具有某种功能的基因，要确定该基因在高等植物中具有何种具体的功能也是非常不容易，需要将该基因转入到植物体中进行功能验证，而功能验证实验是一项需要花费大量的时间，需要付出巨大的成本并进行繁杂的试错和筛选的实验，仅在量上就已超出“常规的、有限次的实验”这一范畴。作为佐证的是，本发明通过亚细胞定位、实时定量RT-PCR表达分析、酵母互补实验、在玉米和拟南芥中过表达实验等一系列的繁杂实验，经过大量的试错和筛选实验，最终才确证SEQ ID No.1所示的基因能够有效增加粮食作物种子锌含量。（3）权利要求1的SEQ ID No.1所示的基因与对比文件1的基因尽管只存在一个氨基酸的差异（对比文件1为丙氨酸，权利要求1为缬氨酸）。对于蛋白来说，仅仅一个关键位点的突变，其功能都有可能产生难以预测的变化。已有很多文献报道：基因序列突变几个碱基，发挥的功能完全不同。比如有文献（Zhou et al., 2015 The plant journal）报道转录因子MYB4的第261位的Asp突变成Asn后，突变的MYB4D261N便完全丧失了转录因子的功能。因此，尽管丙氨酸和缬氨酸都是非极性脂肪酸氨基酸，但是该氨基酸的位点属于关键的位点，本领域技术人员不能推测用缬氨酸替换丙氨酸后，突变后的蛋白是否具有锌铁转运体的功能，更不能推测其是否具有增加种子中锌含量的功能。（4）即便对于具有锌转运体功能的基因，也不能由此推测其必然具有增加种子中锌含量的功能。根据公开的文献可见，相当多的锌铁转运体基因并不能增加种子中锌或铁的含量，因此，即便确证了某一转运体对于锌具有调控或转运的功能，也不能由此推测其具有增加种子中锌含量的功能。对于锌铁转运体基因来说，其调控锌在种子中进行富集的机制非常复杂，涉及到多种代谢调控途径，即便采用种子特异性启动子将锌铁转运体基因在种子部位进行超表达，很多的锌铁转运体基因也不能增加种子中的锌含量，也即是说，本领域人员对于锌铁转运体基因必然具有增加种子中锌含量不具有合理的成功期待，由于进行功能验证需要进行大量的试验，需要耗费大量的人力和物力；在没有合理的成功期待的前提下，本领域人员也就缺乏动机去进行复杂、繁琐的功能验证，因此要获得权利要求1所述的能够提高作物种子中锌的含量的锌铁调控转运体是不容易实现的。综上，权利要求1的技术方案相比于对比文件1和本领域的常规技术手段是非显而易见的，具有突出的实质性特点和显著的进步，符合专利法第22条第3款创造性的规定。在权利要求1具有创造性的前提下，直接引用权利要求1的权利要求2也自然具有创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在复审阶段没有修改申请文件，因此，本复审请求审查决定针对的文本为：申请日2014年05月30日提交的说明书摘要、说明书第1-165段（即第1-14页）、摘要附图、说明书附图图1-图18（即第1-9页）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-6页；2017年07月11日提交的权利要求第1-2项（共1页）。
2、专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在判断创造性时，首先要将权利要求的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别特征，确定所述技术方案实际解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别特征引入到所述最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则发明是显而易见的，该权利要求不具备创造性。
具体到本案，权利要求1请求保护从玉米(Zea mays)中分离的锌铁调控转运体ZmZIP4基因在在增加粮食作物种子锌含量中的应用，所述的锌铁调控转运体ZmZIP4基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。对比文件1公开了一种玉米锌调控转运体ZmZIP4 mRNA，由1000个碱基组成，该1000个碱基与本申请SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的碱基1-1000的同一性为99.8%（参见具体序列）。权利要求1与对比文件1的区别特征为：（1）第199-201位密码子不同，编码的氨基酸由丙氨酸变成了缬氨酸；（2）将其应用于增加粮食作物种子锌含量。基于上述区别特征，本申请实际解决的技术问题是提供另一种序列组成的玉米锌调控转运体ZIP4 cDNA的进一步用途。对于区别特征（1），本申请的SEQ ID No.1与对比文件1的锌铁调控转运体ZmZIP4 mRNA都分离自玉米，尽管二者存在一个碱基的差异，但缬氨酸和丙氨酸都是非极性氨基酸，性质相近，上述序列的差异可以合理预期是由于自然突变造成的。根据对比文件1的技术教导，本领域技术人员有动机从其他锌含量高的玉米基因组克隆另一种锌铁调控转运体ZmZIP4，而RACE技术是本领域比较成熟的基因克隆方法，本领域技术人员容易通过该技术获得可自然突变的锌铁调控转运体基因的全长序列及其编码的蛋白。
对于区别特征（2），本领域技术人员知道，ZIP基因家族在从胞外向胞内转运并在胞内进行锌运输过程中起着重要作用，其在植物的根、茎、根瘤、花、籽粒等部位表达，也就是说本领域技术人员知道ZmZIP4基因具有锌铁调控转运功能并有可能在植物的种子中提高锌含量。如申请人在答复第一次审查意见通知书时提交的参考文献（李素贞等，植物锌铁转运相关蛋白家族的研究进展，生物技术通报，2013年第2 期，第8-14 页）也公开了在大麦中过表达锌铁转运体基因增加了锌在种子中的含量，以及在水稻中过表达OsZIP4导致过量的锌聚集于根部。在面对增加玉米种子中的锌含量的实际需求时，本领域技术人员有动机验证获得的本申请SEQ ID No.1所示的锌调控转运体ZmZIP4基因的锌调控转运功能和增加种子中的锌含量的功能，必要时利用种子特异性启动子等本领域常规技术手段将其用于增加种子中的锌含量。
可见，在对比文件1的启示下，本领域技术人员有动机结合本领域常规技术手段得到本申请权利要求1的技术方案，也没有取得预料不到的效果，相对于对比文件1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款有关创造性的规定。
从属权利要求2将权利要求1所述锌铁调控转运体基因可操作的与表达调控元件相连接，得到重组植物表达载体；将重组植物表达载体转化受体植物或植物细胞，培育得到转基因植物是本领域制备转基因植物的常规技术手段，因而，当其引用的权利要求1不具备创造性时，权利要求2不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）对比文件1公开了所述序列来自玉米并且命名为 “ZmZIP”，根据本领域的常规命名规则，本领域技术人员可以预测其应属于ZIP家族，也能够根据本领域常规方法验证其ZIP家族蛋白的功能。（2）在本申请的SEQ ID No.1与对比文件1的锌铁调控转运体ZmZIP4 mRNA都分离自玉米，与对比文件1只具有一个性质相近的氨基酸的差异的情况下，可以合理预期上述突变是自然选择的结果，并可进一步确认对比文件1的序列和本申请SEQ ID No.1同属于ZIP家族基因，而ZIP基因家族在从胞外向胞内转运并在胞内进行锌运输过程中起着重要作用，其在植物的根、茎、根瘤、花、籽粒等部位表达，因而在SEQ ID No.1为ZmZIP4的基础上，其增加在植物中的锌含量，包括种子中的锌含量是本领域技术人员可以合理预期并可以利用常规手段确认的，此外，本领域技术人员还可以采用种子特异性启动子等本领域常规技术手段作为辅助手段，并合理预期在这些辅助手段的帮助下所述序列能够用于增加种子中的锌含量。（3）没有证据表明该突变是能够严重影响蛋白功能的关键突变。（4）根据以上评述可知，本领域技术人员在对比文件1的启示下，可以合理预期SEQ ID No.1能够用于增加种子中锌含量。在判断一项权利要求是否具备创造性的过程中，并非要求本领域技术人员对发明方案的改进有必然成功的把握并可以预先确定取得的技术效果时，才能认为现有技术具有技术启示，相反，当本领域技术人员对选择的结果有合理的成功期待时，现有技术就会驱使其有动机作出相应的选择，并验证其效果。
综上所述，复审请求人关于本发明具备创造性的意见陈述不具有说服力。
根据以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月17日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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