发明创造名称：酚类雌激素的提取方法
外观设计名称：
决定号：180901
决定日：2019-06-11
委内编号：1F254151
优先权日：
申请（专利）号：201510320246.1
申请日：2015-06-11
复审请求人：温州医科大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：房元锋
合议组组长：王少伟
参审员：孙敏
国际分类号：G01N1/34
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果一项权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，该区别技术特征属于本领域的公知常识，那么该权利要求请求保护的技术方案相对于现有技术不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510320246.1、名称为“酚类雌激素的提取方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为温州医科大学。本申请的申请日为2015年06月11日，公开日为2015年09月09日。
经实质审查，国家知识产权局专利实质审查部门于2018年03月13日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定中引用的对比文件如下：
对比文件1：“Quantification of the xenoestrogens 4-tert.-octylphenol and bisphenol A in water and in fish tissue based on micarowave assisted extraction, solid-phase extraction and liquid chromatography-mass spectrometry”，S?ren N.Pedersen et al.，Journal of Chromatography A，第864期，第17-24页，公开日为1999年12月31日。
驳回决定所依据的文本为：申请日2015年06月11日提交的说明书摘要，2017年08月07日提交的说明书第1-7页，2018年02月07日提交的权利要求第1项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种酚类雌激素的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步骤：
S1，在-80℃的冰箱或者液氮中对离体动物组织进行预冷冻,然后将离体动物组织置于萃取溶剂为极性溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物中；所述萃取溶剂的体积为10～15ml，更优选地，所述离体动物组织与所述萃取溶剂的质量体积比为1/20-1/1；所述极性溶剂为乙醇、甲醇或者丙酮与水的混合物；所述非极性溶剂为环己烷、正己烷或二氯甲烷；在所述步骤S1之前，所述提取方法还包括对所述离体动物组织进行冷冻干燥的步骤，优选所述冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，更优选所述真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃～-50℃；真空度为1.3～13pa，所述冷冻干燥的时间为18～48h；所述离体动物组织为螺蛳肌肉组织、猪的肌肉组织和鲫鱼肌肉组织中的任一种；
S2，对所述离体动物组织在温度为80～120℃下微波萃取10～15min，得到微波萃取液；
S3，对所述微波萃取液采用固相萃取柱活化后分离，得到所述酚类雌激素；所述固相萃取柱为Florisil柱或HLB固相萃取柱；所述步骤S3包括以下步骤：
S31，对所述固相萃取柱进行活化，得到活化固相萃取柱；
S32，以2ml/min的流速将所述微波萃取液转移至所述活化固相萃取柱中；
S33，用淋洗液对所述固相萃取柱进行淋洗，得到去除杂质的固相萃取柱；
S34，用洗脱液对所述去除杂质的固相萃取柱进行洗脱，得到所述酚类雌激素；
所述淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述淋洗液的体积为3-8ml；所述淋洗液为正己烷、甲醇与水的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；优选所述淋洗液的体积为3-8ml。”
驳回决定中具体指出：权利要求1请求保护一种酚类雌激素的提取方法，对比文件1公开了一种4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）的提取方法。权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：在-80℃的冰箱进行预冷冻；萃取溶液为极性溶剂，体积为10-15ml；离体动物组织与所述萃取溶剂的质量体积比为1/20-1/1；极性溶剂为乙醇或者丙酮与水的混合物；非极性溶剂为环己烷或正己烷；在步骤S1之前，提取方法还包括对离体动物组织进行冷冻干燥的步骤，优选冷冻干燥的步骤采用真空冷冻干燥机进行冷冻干燥，更优选所述真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃～-50℃；真空度为1.3～13pa，冷冻干燥的时间为18～48h；微波萃取的参数为80～120℃下10～15min；固相萃取柱为Florisil柱或HLB固相萃取柱；微波萃取液转移至所述活化固相萃取柱的流速为2ml/min；淋洗液为甲醇与水的混合液或者乙酸乙酯与正己烷的混合液；淋洗液的体积为3-8ml；离体动物组织为螺蛳肌肉组织、猪的肌肉组织和鲫鱼肌肉组织中的任一种。上述区别技术特征是本领域技术人员在对比文件1的基础上容易想到的惯用技术手段或常规选择。因此，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年06月19日向国家知识产权局提出了复审请求，并提交了权利要求书的全文修改替换页。修改涉及：依据说明书中记载的实施例3重新撰写了权利要求1。复审请求人认为：修改后的权利要求1与对比文件1相比，其区别技术特征在于：本申请文件中是对鲤鱼肌肉组织提取；先经过预冷冻再进行冷冻干燥；微波萃取15min，温度120℃；上样流速为0.5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水（体积比为40：60）,然后依次用 10ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷（体积比为15:85）的混合液作为洗脱液进行洗脱；提取的为双酚A、壬基酚、辛基酚。基于上述区别技术特征，本申请文件实际解决的技术问题为：“如何高效、低损失地提取鲤鱼肌肉组织当中的双酚A、壬基酚、辛基酚”。本申请文件的说明书中，实施例三检测加标回收率为90.6%，说明前处理过程对待测物的损失较低，而其它实施例，采用相近的方法，而具体设置的参数有所不同，其加标回收率的数值分别为82%、84.1%、78.2%，均大大低于实施例三的结果，说明前处理过程对待测物的损失量也均高于实施例三。通过上述结果对比，说明修改后的权利要求1具有预想不到的效果，因此符合专利法所规定的创造性有关突出的实质性特点和显著进步的要求。对比文件1中一种4-叔辛基苯酚和双酚A的提取办法，虽然采用相近的方法，但是并没有公开修改后的权利要求1中所限定的具体参数，也没有公开相关的技术启示使本领域人员可以通过有限的试验可以得出修改后的权利要求1中的技术方案以及技术效果。
复审请求人提复审请求时提交的权利要求书如下：
“1. 鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)冷冻干燥，对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g，置于-80℃冰箱中；24 小时后，置于真空冷冻干燥机中48小时；其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃，真空度 为1.3pa；
(b)微波萃取：将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，加入20ml二氯甲烷/ 甲醇为萃取溶剂，微波萃取15min，温度120℃；对获得的萃取液进行离心，取 上清液；二氯甲烷/ 甲醇的体积比为2:1；
(c)净化除杂：将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解，通过固 相萃取柱HLB，上样流速为0.5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水,然后依次用 10ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行洗脱；并将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚；甲醇/水的体积比为40：60，甲醇和二氯甲烷的体积比为15:85。”
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年07月05日依法受理了该复审请求，并将其转送至原专利实质审查部门进行前置审查。
原专利实质审查部门在前置审查意见中坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月25日发出复审通知书，指出：权利要求1请求保护一种鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法，对比文件1公开了一种4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）的提取方法，权利要求1与对比文件1的区别在于：（1）肌肉组织来源于鲫鱼，该方法是对双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法。（2）冷冻干燥步骤中对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g，置于-80℃冰箱中；24 小时后，置于真空冷冻干燥机中48小时；其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃，真空度为1.3pa；微波萃取步骤中将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，微波萃取15min，温度120℃；净化除杂步骤中将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解，通过固相萃取柱HLB，上样流速为0.5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水,然后依次用 10ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行洗脱，并将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚；甲醇/水的体积比为40：60，甲醇和二氯甲烷的体积比为15:85。区别技术特征（1）是本领域技术人员根据对比文件1给出的技术启示容易想到的；区别技术特征（2）是本领域技术人员在对比文件1的基础上容易想到的常规技术手段或常规选择。因此，在对比文件1的基础上结合公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。此外，合议组针对复审请求人的陈述意见进行了答复。
针对上述复审通知书，复审请求人于2019年03月04日仅提交了意见陈述书，未修改申请文件。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）、审查文本的认定
复审请求人于2018年06月19日提出复审请求时提交了权利要求书的全文修改替换页，经查，其中所作的修改符合专利法第33条的规定。因此，本复审请求审查决定所依据的文本为：申请日2015年06月11日提交的说明书摘要，2017年08月07日提交的说明书第1-7页，2018年06月19日提交的权利要求第1项。
（二）、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
如果一项权利要求请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，该区别技术特征属于本领域的公知常识，那么该权利要求请求保护的技术方案相对于现有技术不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求1要求保护一种鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法，对比文件1公开了一种4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）的提取方法，并具体公开了以下技术特征（参见第18-19页第2.1-2.3节，第21-22页第3.2节）：含有tOP和BPA组织的提取步骤包括将幼小虹鳟鱼的组织置于充满液氮的研钵中（相当于对样品组织进行冷冻），然后碾碎；组织样品放置在Soxwave 100的微波萃取装置的反应容器中，且反应容器中装有20ml的二氯甲烷和甲醇的混合溶液（2:1 v/v），微波萃取装置以20%功率萃取样品25min，混合物经过滤后，再经过10分钟的离心后去除二氯甲烷相，由于二氯甲烷的密度比甲醇大，因此保留的样品必然是上清液；在样品施加到Sep-Pak NH2 500-mg萃取柱之前，预先用5ml甲醇和5ml己烷活化萃取柱，将蒸发干又重新溶解的样品以1ml/min的速度施加到萃取柱上，在解吸之前，当萃取tOP时，用5ml的环己烷淋洗萃取柱，当萃取BPA时，用2ml的己烷淋洗萃取柱（相当于用淋洗液对固相萃取柱进行淋洗以净化除杂），在干燥之后，用4ml的甲醇（相当于洗脱液）解吸tOP和BPA样品（相当于用洗脱液对去除杂质的固相萃取柱进行洗脱）；最后，提取物用氮气蒸发干并重新溶于甲醇。
权利要求1与对比文件1的区别技术特征在于：（1）肌肉组织来源于鲫鱼，该方法是对双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法。（2）冷冻干燥步骤中对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g，置于-80℃冰箱中；24 小时后，置于真空冷冻干燥机中48小时；其中，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃，真空度为1.3pa；微波萃取步骤中将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，微波萃取15min，温度120℃；净化除杂步骤中将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解，通过固相萃取柱HLB，上样流速为0.5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水,然后依次用 10ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行洗脱，并将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚；甲醇/水的体积比为40：60，甲醇和二氯甲烷的体积比为15:85。
基于上述区别技术特征，可以确定权利要求1实际解决的技术问题是：（1）提供样品和目标；（2）调节具体方法步骤和参数以获得更好的提取效果。
对于区别技术特征（1），对比文件1已经公开了在幼小虹鳟鱼的组织中提取4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）的方法，在此基础上本领域技术人员根据需要容易想到采用类似的鲤鱼等鱼类来获得样品，并且由于对比文件1检测的目标是4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA），这与本申请的双酚A、壬基酚、辛基酚都属于酚类雌激素，具有相同或类似的性质，本领域技术人员容易想到对这些目标进行同时提取以节省时间成本、提高效率。
对于区别技术特征（2），对新鲜的鲤鱼进行解剖，留取肌肉组织部分3g并置于-80℃冰箱中是本领域技术人员获得生物组织样品时的常规手段以及常规选择；24小时后，将样品置于真空冷冻干燥机中48小时，真空冷冻干燥机的冷却温度为-10℃，真空度 为1.3pa也是生物实验样品领域常规的冷冻干燥处理方法及参数；对比文件1已经公开了将样品置于液氮研钵中冷冻并碾碎溶解后进行微波提取20分钟，而具体的在微波萃取步骤中将冷冻干燥后的鲤鱼样品解冻到室温，研磨过筛，微波萃取15min，温度120℃等都是本领域技术人员根据需要可以采取的常规实验手段和参数；净化除杂步骤中将上述上清液转移到试管中，氮气吹干后加4ml甲醇重新溶解也是本领域的常规样品处理手段；对比文件1已经公开了可以采用Sep-Pak NH2 500-mg固相萃取柱以及1ml/min的上样流速并用4ml甲醇进行洗脱，在此基础上具体的采用固相萃取柱HLB，设置上样流速为0.5ml/min，淋洗液是8ml甲醇/水,然后依次用 10ml甲醇、10ml二氯甲烷、10ml甲醇和二氯甲烷的混合液作为洗脱液进行洗脱都是本领域技术人员根据样品的不同而容易想到的性质相同或类似的常规洗脱液和参数；将洗脱液一并收集，同时别得到鲤鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚也是本领域技术人员为了提高提取效率容易想到的常规方法；而具体的将甲醇/水的体积比设为40：60、甲醇和二氯甲烷的体积比设为15:85是本领域技术人员根据需要可以作出的常规选择。
由此可知，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得出该权利要求所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此该权利要求所要求保护的技术方案不具有突出的实质性特点和显著的进步，因而不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
（三）、对复审请求人相关意见的评述
复审请求人认为：（1）对比文件1中的标题和正文部分明确指出，该文涉及的提取目标物质是4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA），本申请涉及的目标物质是所有酚类雌激素，范围远大于上述两种。采用对比文件1中的方法可以成功实现4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）的提取，但这并不适用于所有其他酚类雌激素物质，因为其他酚类雌激素与4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA）在物理化学性质方面具有不同程度的差异。（2）本申请针对不同酚类雌激素的不同物化性质（主要是极性不同），采用极性溶剂与非极性溶剂混合的方式，这是之前微波萃取技术未采用的方法。其中，极性溶剂用于吸收微波能量，非极性溶剂可以确保溶解提取非极性酚类雌激素（基于相似相溶原理）。之前的文献报道的微波萃取都是采用极性溶剂或极性溶剂的混合液，例如对比文件1（见其“2.3. Tissue extraction”部分）所采用的溶剂为dichloromethane/methanol（二氯甲烷/甲醇），均为极性溶剂。因此，本申请在萃取溶剂的选择上具有明显的创新和进步。（3）复审通知书中“预冷冻是真空干燥常用的预处理方式”，该表述不符合本领域技术人员的常用想法和做法。通常情况下，在真空干燥前通常会采用自然晒干或风干的预处理方式。自然晒干或风干所需时间长，而且容易造成目标酚类雌激素物质的分解（如光降解）和流失（如挥发到空气中）。因此，本申请采用冷冻预处理方法具有明显的创新和进步。预冷冻一方面保持离体动物组织所处环境保持相对平衡，避免动物组织受到破坏，另一方面本发明中，萃取之前确认离体动物组织是否干燥，这个小步骤，既可以减少萃取过程中水分萃取效率的影响，又可以避免因为含有水分而带入杂质，影响萃取结果，此处也与对比文件1不同，对结果的影响不容小觑。
对此，合议组认为：
（1）本申请权利要求1的主题涉及一种“鲫鱼肌肉组织中双酚A、壬基酚、辛基酚的同时提取方法”，其并不是针对所有酚类雌激素的提取方法。对比文件1检测的4-叔辛基苯酚（tOP）和双酚A（BPA），与本申请的双酚A、壬基酚、辛基酚都属于酚类雌激素，具有相同或类似的性质，也可以采用相同或类似的方法进行提取；当考虑到节省时间成本、提高效率等常规需求时，本领域技术人员容易想到对双酚A、壬基酚、辛基酚这些类似的酚类雌激素进行同时提取。
（2）本申请权利要求1中记载的萃取溶剂为“二氯甲烷/ 甲醇”,对比文件1已经公开了：组织样品放置在Soxwave 100的微波萃取装置的反应容器中，且反应容器中装有20ml的二氯甲烷和甲醇的混合溶液（2:1 v/v），微波萃取装置以20%功率萃取样品25min（参见第19页第2.3节）。也就说，对比文件1已经公开了本申请权利要求1中记载的“二氯甲烷/ 甲醇”作为萃取溶剂。至于采用极性溶剂或非极性溶剂或者两者的混合液作为萃取剂都是本领域技术人员根据实际需要可以作出的常规选择，其技术效果也是本领域技术人员可以预期的。
（3）样品中的水分带来的杂质容易影响萃取结果的效率和准确性是本领域的公知常识，在进行萃取实验前往往需要对样品进行干燥处理，而真空冷冻干燥机是本领域技术人员熟知并惯用的冷冻干燥仪器，因此，对样品利用真空冷冻干燥机进行干燥去水以提高样品的纯度以及萃取实验的效率也是本领域的常用技术手段。对比文件1中将冷冻状态的肌肉或肝样品置于充满液氮的研钵中然后再进行破碎步骤（参见第19页第2.3节），因此，样品在液氮冷冻前必然也采用了冷冻的处理方式，其也相当于进行了预冷冻，基于此，当待测样品为新鲜的肌肉组织样品时，本领域技术人员容易想到将其进行预冷冻，然后再利用真空冷冻干燥机获得干燥且冷冻的样品以方便样品的保存和使用。
因此，复审请求人有关权利要求1具备创造性的陈述理由不具有说服力，合议组不予支持。
根据以上事实和理由，合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年03月13日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本复审决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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