发明创造名称：几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用
外观设计名称：
决定号：183379
决定日：2019-06-06
委内编号：1F249199
优先权日：
申请（专利）号：201510219342.7
申请日：2015-04-30
复审请求人：大连大学
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：廖雅静
合议组组长：徐益君
参审员：董桂灵
国际分类号：C12N15/56，C12N9/42，C12N15/10，C12P19/26
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明与现有技术相比产生了预料不到的技术效果，这说明该发明具有显著的进步，同时也反映出该发明的技术方案是非显而易见的，具有突出的实质性特点，则该发明具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201510219342.7，名称为“几丁质酶基因chiC及其编码蛋白和应用”的发明专利申请。申请人为大连大学。本申请的申请日为2015年04月30日，公开日为2015年07月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月05日，以权利要求1-2不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请，其具体理由是：权利要求1请求保护一种几丁质酶chiC的表达与纯化方法。对比文件1（Genbank登录号KF234017.1，Pseudoalteromonas sp. DL-6 chitinase (chiC) gene，complete cds，公开日为2013年08月31日）公开了与本申请SEQ ID No.1的序列一致性为100%的假交替单胞杆菌属菌株DL-6几丁质酶基因。权利要求1与对比文件1的区别在于：权利要求1通过扩增序列、构建表达菌株、体外诱导表达和分离纯化等方式得到了该几丁质酶。基于上述区别技术特征，权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种已知几丁质酶chiC的表达与纯化方法。而对比文件2（“大肠杆菌表达几丁质酶对不同底物的酶学性质及其降解产物分析”，吕梦圆等，食品与发酵工业，第41卷，第3期，第26-32页，公开日为2015年01月22日）公开了克隆几丁质酶基因的表达与纯化方法（参见第27页1.3 克隆几丁质酶基因的表达纯化）。在此基础上，为表达纯化如SEQ ID NO：1所示的几丁质酶，本领域技术人员有动机采用对比文件2的表达纯化方法，并对包括IPTG浓度、温度和时间等在内的参数进行常规调整，同时以菌株DL-6基因组DNA为模板、根据模板设计引物、加入酶切位点、调整PCR反应体系、连接反应体系以及克隆载体的转化等均为本领域技术人员的常规技术手段，并且其反应效果是可以预期的。因此，相对于对比文件1-2以及常规技术手段的结合，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求2请求保护一种如权利要求1所述方法获得的几丁质酶在降解含几丁质底物中的应用。对比文件3（“海洋低温几丁质酶菌株筛选、鉴定及酶谱分析”，王晓辉等，西北农业学报，第23卷，第9期，第92-97页，公开日为2014年09月18日）公开了高产低温几丁质酶的海洋细菌菌株DL-06，经鉴定为假交替单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）（参见第93页右栏1.5 几丁质酶活力检测和蛋白质测定，第96页左栏2.3 Pseudoalteromonas sp. DL-06菌株最适产酶温度的确定）。本申请所述几丁质酶就是来自于对比文件3所述的菌。因此，在对比文件3的启示下，本领域技术人员容易想到应用本申请权利要求1所述的几丁质酶降解几丁质。且本领域技术人员公知，几丁质酶可以降解几丁质产生几丁单糖或几丁寡糖。因此，在对比文件1公开了所述几丁质酶的情况下，本领域技术人员通过常规技术手段即可确定其降解产物、酶解温度和pH值等酶解条件。且对比文件3还公开了测量DL-06粗酶液降解胶体几丁质的酶活曲线，以及相应的最高酶活力为9.184 U/mL，可见权利要求2也没有产生预料不到的技术效果。因此，在权利要求1不具备创造性的基础上，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定所依据的文本为申请日2015年04月30日提交的说明书第1-144段、说明书摘要、说明书附图、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表，以及2017年11月21日提交的权利要求第1-2项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种几丁质酶chiC的表达与纯化方法，其特征在于，步骤如下：
(1)以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；以Pseudoalteromonas sp.DL-6菌株的基因组DNA为模板，以引物对chiC-F和chiC-R进行PCR扩增；上游引物chiC-F：5’-CCCGGATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG-3’，下游引物chiC-R：5’-CCGCTCGAGAAGTGCTAACCATACATCGG-3’；
PCR反应体系：
(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-chiC：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-chiC；连接反应体系为：
连接反应的条件为：16℃过夜连接，构建克隆载体pMDl9-T-chiC；
(3)构建大肠杆菌重组表达载体pET28a-chiC：将克隆载体pMD19-T-chiC质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶BamHI和XhoI将chiC基因片段从pMDl9-T-chiC质粒上切下，连接到pET-28a表达载体上，连接pET-28a表达载体的反应体系：pMDl9-T-chiC酶切产物chiC基因1μL，pET-28a 2μL，5μL Ligation Mix，2μL dH2O，反应条件为：16℃过夜连接；
(3.1)取冰上冻融的100μL大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，于上述10μL的连接反应液中，轻柔混合均匀；
(3.2)冰中放置30分钟后，在42℃热激处理1min，然后立即转移冰中放置1min；
(3.3)加入900μL的SOC培养液，37℃振荡培养1h；
(3.4)取100μL涂平板LB/Kana，37℃过夜培养筛选阳性转化子；
(3.5)重组原核表达载体pET28a-chiC的提取，用TaKaRa公司试剂盒提取表达载体pET28a-chiC；
(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC：将重组表达载体pET28a-chiC质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC；
(5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC接入含卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养14h后，按1％的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中，当OD600nm＝0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于30℃，100rpm低温诱导6h；
(6)几丁质酶chiC的纯化：体外诱导表达结束后于4℃，5,000×g离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎三次，每次30s，每次间隔1min，然后于4℃，12,000×g离心20min收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋白用Ni2 -NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质酶chiC，该几丁质酶具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。
2.一种采用权利要求1所述方法获得的几丁质酶在降解含几丁质底物中的应用，其特征在于，所述的几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，适宜的酶解条件为：酶解温度30℃，pH值为9.0，所述的几丁质酶chiC对胶体几丁质具有高降解活性可达1.569±0.017U/ml。”
申请人大连大学（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月17日向国家知识产权局提出了复审请求，但没有修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1仅公开了DL-06几丁质酶基因chiC的cds序列，没有与表达和纯化该酶相关的内容。而对比文件2的方法针对的几丁质酶的结构、功能、性质与对比文件1不同，本领域技术人员没有启示将对比文件2的方法用于纯化对比文件1的酶。（2）权利要求1要求保护的方法可以获得高活性的chiC酶，如本申请图5显示，该方法获得的酶活性为6.947U/ml，具有显著的进步。（3）对比文件3没有研究chiC酶的适宜pH值，对比文件2中记载的多种几丁质酶的最适酶解pH值均为酸性。而本申请的权利要求2限定了所述几丁质酶的适宜酶解pH值为9.0，是适用于偏碱性条件下的几丁质酶，这是预料不到的技术效果。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月07日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）对比文件1公开了DL-6几丁质酶基因序列，对比文件2提供了分离纯化几丁质酶的方法，基于同工酶分离方法相似的性质，本领域技术人员通过有限的试验对其中的反应条件进行调整是可以获得本申请所述几丁质酶的分离纯化方法的。（2）对比文件2所述几丁质酶对不同底物的比酶活分别为胶体几丁质1.96U/mg，N-乙酰化壳聚糖9.26U/mg，水溶性壳聚糖糖24.13U/mg，4MU-（GlcNAc）3 1060.18U/mg，对比文件3中的几丁质酶活力最高为9.184U/ml。因此，本申请的几丁质酶活性是可以预期的。（3）对比文件2公开了“微生物几丁质酶一般在pH3~11范围内有不同程度的酶活，最适pH值大都在6~7”，本领域技术人员可以通过有限的试验测定几丁质酶的最适pH值，因此本申请得到的最适pH值为9的偏碱性几丁质酶并非预料不到的技术效果。（4）本领域技术人员根据对比文件2公开的影响因子分析方法容易通过有限的试验确定本申请所述几丁质酶的最适宜降解条件，且本申请中的几丁质酶降解胶体几丁质的活性也并非预料不到。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年01月15日向复审请求人发出复审通知书，指出权利要求1-2不符合专利法第22条第3款。具体理由是：（1）权利要求1与对比文件1的区别是：权利要求1中表达和纯化所述几丁质酶chiC的步骤。权利要求1实际解决的技术问题是：获得已知基因的表达纯化产物。在实践中，当一个编码基因的序列已知时,本领域技术人员普遍确信可以利用遗传工程手段，重组表达该已知基因，并纯化获得该基因编码的蛋白质产物。并且对比文件2已经公开了表达和纯化几丁质酶的方法，其步骤与权利要求1的步骤（4）-（6）仅在诸如IPTG浓度、离心转速和时间等参数上存在些微差异，调整上述参数属于本领域技术人员掌握的常规技术手段，且没有产生任何预料不到的技术效果。此外，公知常识证据1（F.奥斯伯等主编，（《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，第1版，公开日为1998年12月31日，参见正文第108-112页）公开了与权利要求1的步骤（1）-（3）相应克隆操作。公知常识证据2（TaKaRa LA Taq?使用说明书，公开日为2012年12月31日，参见“应用例”）公开了相同的PCR扩增反应体系。公知常识证据3（TaKaRa DNA连接酶使用说明书，公开日为201年05月31日，参见“应用例”）公开了T4 DNA连接酶反应体系。因此，权利要求1相对于对比文件1、2和常规技术手段的结合不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具有专利法第22条第3款规定的创造性。（2）对比文件1已经公开了SEQ ID NO：1序列的酶是几丁质酶，意味着其也公开了该酶是以几丁质为底物，但并未公开该酶适用的酶解温度和pH值，对胶体几丁质的酶解活性，以及酶解产物。对比文件3已经公开了菌株DL-06能够以胶体几丁质为唯一碳源，并且至少能够产生并向胞外分泌3种以上不同分子量的几丁质酶。根据该菌株的16s rDNA序列的GeneBank登录号（KF208362）下内嵌的链接，本领域技术人员能够得知其所分泌的一种几丁质酶即为对比文件1公开的酶。根据对比文件3记载，DL-06的粗酶液在30℃和约pH 7.0下测量的几丁质酶酶活可达9.184 U/ml，最适反应温度是15℃。本申请的1.569±0.017U/ml的酶活数值落在对比文件3公开的粗酶液总酶活范围以内，对本领域技术人员而言，不能认为本申请的酶活是预料不到的。因此，当权利要求1不具有创造性时，权利要求2也不具有专利法第22条第3款规定的创造性。对于复审请求人的意见，复审通知书指出：（1）对比文件1已经公开了该序列编码一种几丁质酶，酶本身体现的应用价值和现有技术对几丁质酶的潜在需求，已经使本领域技术人员有充分动机寻找表达该基因并纯化其表达产物的方法，从而能够结合同样用于纯化几丁质酶的对比文件2。并且，虽然对比文件2的方法在一些常规参数与权利要求1有细微区别，但从区别的具体参数和调整幅度来看，这种差异并没有使权利要求1的方法与现有技术方法产生实质性的区别，仍然不具有创造性。（2）对比文件2对获得的几丁质酶活性的测量条件和测量方法与本申请不同，因而无法比较两者的差异。（3）首先，对比文件3虽然没有给出chiC酶的适宜pH值，但其公开了测量酶活性可以在pH7.0条件下进行。同时，本领域技术人员在获得该酶后，必然会通过本领域普遍已知的方法测量该酶在不同pH值下的酶活曲线，该测量结果，即chiC酶的适宜pH值，是可以毫无疑问的确定的。其次，对比文件2也公开了现有技术一般预期几丁质酶的适宜pH值为3-11。因此，权利要求2对pH值的限定并非本领域技术人员预料不到的，仍然不具有创造性。
复审请求人于2019年02月25日提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书全文修改替换页（共3页1项）。复审请求人认为：修改后的权利要求1实际解决的技术问题是提供了一种能在碱性条件利用几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖的应用，最适pH为9.0。而在对比文件2中公开的所有几丁质酶，其最适宜pH值均为酸性条件。因此，即使本领域技术人员有能力采用常规技术手段测定chiC几丁质酶的最适宜pH，其也不能显而易见的将pH的筛选范围扩大至pH>7的碱性条件。因而权利要求1具有预料不到的技术效果，具有创造性。
修改后的权利要求书如下：
“1. 一种几丁质酶chiC在降解含几丁质底物中的应用，其特征在于：
所述几丁质酶chiC的表达与纯化方法步骤如下：
(1)以PCR方法扩增如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；以Pseudoalteromonas sp.DL-6菌株的基因组DNA为模板，以引物对chiC-F和chiC-R进行PCR扩增；上游引物chiC-F：5’-CCCGGATCCGGCGCCTTCTACACCAAGCATTAATTGG-3’，下游引物chiC-R：5’-CCGCTCGAGAAGTGCTAACCATACATCGG-3’；
PCR反应体系：
(2)构建大肠杆菌克隆载体pMD19-T-chiC：将PCR扩增的DNA序列和pMD19-T simple载体用同样的限制性内切酶进行双酶切，酶切产物经回收纯化，用T4DNA连接酶连接纯化的酶切产物，得到克隆载体pMD19-T-chiC；连接反应体系为：
连接反应的条件为：16℃过夜连接，构建克隆载体pMDl9-T-chiC；
(3)构建大肠杆菌重组表达载体pET28a-chiC：将克隆载体pMD19-T-chiC质粒转化至E.coli DH5α，得到阳性转化子，用限制性内切酶BamHI和XhoI将chiC基因片段从pMDl9-T-chiC质粒上切下，连接到pET-28a表达载体上，连接pET-28a表达载体的反应体系：pMDl9-T-chiC酶切产物chiC基因1μL，pET-28a 2μL，5μL Ligation Mix，2μL dH2O，反应条件为：16℃过夜连接；
(3.1)取冰上冻融的100μL大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)，于上述10μL的连接反应液中，轻柔混合均匀；
(3.2)冰中放置30分钟后，在42℃热激处理1min，然后立即转移冰中放置1min；
(3.3)加入900μL的SOC培养液，37℃振荡培养1h；
(3.4)取100μL涂平板LB/Kana，37℃过夜培养筛选阳性转化子；
(3.5)重组原核表达载体pET28a-chiC的提取，用TaKaRa公司试剂盒提取表达载体pET28a-chiC；
(4)构建大肠杆菌重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC：将重组表达载体pET28a-chiC质粒转化至E.coli BL21(DE3)，挑选阳性转化子克隆，得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC；
(5)体外诱导表达：将重组表达菌株BL21(DE3)-pET28a-chiC接入含卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养14h后，按1％的接种量接种到含卡那霉素的LB培养基中，当OD600nm＝0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，于30℃，100rpm低温诱导6h；
(6)几丁质酶chiC的纯化：体外诱导表达结束后于4℃，5,000×g离心5min收集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体三次，再用PBS缓冲液重悬菌体，之后置于冰上超声破碎三次，每次30s，每次间隔1min，然后于4℃，12,000×g离心20min收集上清液，即为粗蛋白，粗蛋白用Ni2 -NTA柱进行亲和层析纯化，得到几丁质酶chiC，该几丁质酶具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；
所述几丁质酶chiC降解α几丁质和β几丁质生成几丁二糖，适宜的酶解条件为温度30℃，最适pH值为9.0；
测定所述几丁质酶chiC的几丁质酶活性：
1mL反应体系包含5μM的chiC酶，2mg/mL的α-几丁质、β-几丁质、胶体几丁质、β-几丁质纳米须、微晶纤维素和壳聚糖6种底物，在30℃反应24h，而后测还原糖含量；以灭活的酶液作为对照组，设置3个重复；chiC酶降解胶体几丁质的酶活性达1.569±0.017U/mL，依次为α几丁质、β几丁质、壳聚糖、β几丁质纳米须和微晶纤维素，对应的酶活性分别为1.422±0.044U/mL、1.34±0.019U/mL、1.249±0.027U/mL、1.179±0.013U/mL和0.971±0.018U/mL。”
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019年02月25日提交了修改后的权利要求书（共3页1项）。相对于驳回决定所针对的权利要求书所做修改为：删除了权利要求1，并将原权利要求1的全部技术特征加入原权利要求2中，并且将原权利要求2中的技术特征“适宜的酶解条件为：温度30℃，pH值为9.0”修改为“适宜的酶解温度为30℃，最适pH值为9.0”，同时将说明书实施例9第（6）部分（即，说明书第[0136]段）记载的内容“1mL反应体系包括……0.971±0.018U/mL”加入原权利要求2中，形成新的权利要求1。经审查，上述修改没有超出原始说明书和权利要求书记载的范围，该修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审审查决定所依据的文本为：申请日2015年04月30日提交的说明书第1-17页（即第1-144段）、说明书附图图1-图10、说明书摘要、摘要附图、说明书核苷酸和氨基酸序列表，以及2019年02月25日提交的权利要求第1项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果发明与现有技术相比产生了预料不到的技术效果，这说明该发明具有显著的进步，同时也反映出该发明的技术方案是非显而易见的，具有突出的实质性特点，则该发明具备创造性。
在本案中，权利要求1要求保护一种几丁质酶chiC在降解含几丁质底物中的应用。
驳回决定、前置审查意见和复审通知书都指出，对比文件1公开了DL-6几丁质酶基因序列（即本申请的SEQ ID NO:1所示chiC酶的编码序列），对比文件2提供了分离纯化几丁质酶的方法，不论是基于本领域表达具有潜在使用价值的已知基因的内在动机，还是基于本领域已知的同工酶分离方法具有相似的性质，本领域技术人员都可以想到利用已知的分离纯化几丁质酶的方法来分离、纯化序列已知的几丁质酶，并可以根据实际情况，通过有限的试验对其中的参数和反应条件进行调整。因而，原权利要求1相对于对比文件1、2和本领域常规技术手段的结合不具有创造性。
对此，合议组认为，复审请求人于2019年02月25日提交的权利要求书中已经删除了原权利要求1，修改后的权利要求1的主题变更为保护一种几丁质酶chiC在降解含几丁质底物中的应用，因而已经克服了驳回决定、前置审查意见和复审通知书中指出的相应的创造性缺陷。
驳回决定和复审通知书还都指出，对比文件3已经公开了菌株DL-06能够以胶体几丁质为唯一碳源，并且其向胞外分泌至少3种几丁质酶，其中包括对比文件1公开的SEQ ID NO：1所示的几丁质酶chiC。因而在原权利要求1所述方法不具备创造性的基础上，本领域技术人员无疑可以想到将所述方法制备的几丁质酶chiC用于降解含几丁质底物。此外，根据对比文件3记载，DL-06的粗酶液在30℃和约pH 7.0下测量的几丁质酶的酶活可达9.184 U/ml，最适反应温度是15℃。因而不能认为本申请的1.569±0.017U/ml的酶活是预料不到的。因而，原权利要求2不具有专利法第22条第3款规定的创造性。
对此，合议组认为，对比文件1仅公开了SEQ ID NO:1所示几丁质酶chiC的编码序列，没有教导与该酶降低几丁质底物时的酶活和最适pH值相关的内容。而对比文件3虽然教导了DL-06的粗酶液在30℃和约pH 7.0下测量的几丁质酶酶活可达9.184 U/ml，但根据对比文件3的相关实验条件，该酶活反映的是包含本申请SEQ ID NO：1所示几丁质酶chiC在内的至少三种几丁质酶混合物的总酶活，本领域技术人员据此不能确定几丁质酶chiC是否产生了催化活性，及其具体的酶活数值。并且，对比文件3没有教导DL-06分泌的几丁质酶能够在碱性条件下催化几丁质降解。由此可见，根据对比文件1和3教导的内容，本领域技术人员不能显而易见地获得修改后的权利要求1（即对原权利要求2进行修改后得到）中所述的几丁质酶chiC在30℃和最适pH9.0下降解α、β几丁质底物的应用。因此，修改后的权利要求1具备创造性。
此外，前置审查意见和复审通知书还都指出，本领域技术人员在获得对比文件1公开的几丁质酶chiC后，必然会通过本领域普遍已知的方法测量该酶在不同pH值下的酶活曲线，从而确定chiC酶的适宜pH值。并且，对比文件2公开了现有技术一般预期几丁质酶的适宜pH值为3-11，因此，几丁质酶chiC降解几丁质底物的最适pH为9并非预料不到的技术效果。
对此，合议组认为，对比文件2虽然泛泛地教导了几丁质酶的常规适宜pH值，但pH 3-11涵盖了从强酸性至强碱性的条件，对特定几丁质酶的适宜pH值缺少针对性的教导。同时，对比文件2中公开了最适酶解pH值的所有几丁质酶都是酸性几丁质酶，如果基于前置审查意见中提出的同工酶具有相似性质的角度理解，则本领域技术人员也应倾向于认为本申请的几丁质酶chiC应同为适合在酸性条件下催化几丁质水解的酶，而难以预见该酶能否在pH9.0的碱性条件下发挥几丁质酶活性，更难以预见到该酶降解几丁质底物的最适pH为9。
综上所述，复审请求人已经通过修改权利要求书，克服了驳回决定、前置审查意见书和复审通知书中指出的所有缺陷。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年01月05日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审请求审查决定所针对的文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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