发明创造名称：用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质
外观设计名称：
决定号：180110
决定日：2019-06-03
委内编号：1F250410
优先权日：2012-08-31
申请（专利）号：201380042881.7
申请日：2013-08-29
复审请求人：诺华股份有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：史晶
合议组组长：王荣霞
参审员：杨莹跃
国际分类号：A61K39/085
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在发明所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情况下，如果现有技术中已经给出了将此区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，同时这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380042881.7，名称为“用于针对金黄色葡萄球菌的免疫的稳定化的蛋白质”的发明专利申请。申请人为诺华股份有限公司。本申请的申请日为2013年08月29日，优先权日为2012年08月31日，公开日为2015年05月13日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月11日以权利要求1-19不符合专利法第22条第3款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为2015年02月12日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文文本说明书第1-298段、说明书附图、说明书摘要、序列表以及2016年12月16日提交的权利要求第1-19项。
驳回决定所针对的权利要求如下：
“1. 一种多肽，其氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4在N端有0-4个插入，所述多肽不含任何半胱氨酸氨基酸残基且能够引发识别SEQ ID NO:2的抗体。
2. 如权利要求1所述的多肽，包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
3. 一种杂交蛋白，包含权利要求1或2所述多肽。
4. 一种核酸分子，包含编码权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的核苷酸序列。
5. 一种载体，包含权利要求4所述核酸分子。
6. 一种宿主细胞，包含权利要求4所述核酸分子或权利要求5所述载体。
7. 一种用于制备权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的方法，所述方法包括在表达所述蛋白的条件下培养权利要求6所述宿主细胞并回收由此产生的所述蛋白。
8. 一种免疫原性组合物，包含权利要求1或2所述多肽。
9. 如权利要求8所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含一种或多种以下物质的偶联物：(i)金黄色葡萄球菌外泌多糖和(ii)运载体蛋白。
10. 如权利要求8或9所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含一种或多种以下物质的偶联物：(i)金黄色葡萄球菌荚膜多糖和(ii)运载体蛋白。
11. 如权利要求8所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含佐剂和/或糖。
12. 如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述佐剂是氢氧化铝佐剂。
13. 如权利要求11所述的免疫原性组合物，所述糖是蔗糖。
14. 如权利要求8所述的免疫原性组合物，所述免疫原性组合物还包含稳定化添加剂。
15. 如权利要求8所述的免疫原性组合物，其为冻干形式。
16. 如权利要求8所述的免疫原性组合物，其为水性形式。
17. 一种用于制备权利要求16所述组合物的方法，所述方法通过使用水性材料重建权利要求15所述的组合物。
18. 一种药物组合物，包含权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白或权利要求8-16中任一项所述免疫原性组合物。
19. 权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白、权利要求8-16中任一项所述免疫原性组合物或权利要求18所述药物组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法的药物中的用途。”
驳回决定认为：对比文件1（WO2011051917A1，公开日为2011年05月05日，参见说明书第26页第20行-第27页第2行以及序列26）公开了一种多肽Sta006，其氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，以及可省去SEQ ID NO:26的前17个N末端氨基酸。其中SEQ ID NO:26与本申请权利要求1的SEQ ID NO:1完全一致，因此省去SEQ ID NO:26的前17个N末端氨基酸后获得的氨基酸序列（即相当于本申请SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列）与本申请SEQ ID NO:4（其省去了本申请SEQ ID NO:1的前18个N末端氨基酸）相比多一个N末端的半胱氨酸。
权利要求1与对比文件1的区别在于：本申请多肽的氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4在N端具有0-4个插入，所述多肽不含任何半胱氨酸残基且能够引发识别SEQ ID NO:2的抗体；而对比文件1公开了本申请SEQ ID NO:2所示的Sta006变体。然而，根据对比文件1公开内容可知SEQ ID NO:2的半胱氨酸残基并非必需的，且对比文件2（WO0160851A1，公开日为2001年08月23日）公开了移除葡萄糖球菌毒素蛋白SEC-SER中保留的奇数的半胱氨酸残基，能够抑制多聚体的形成且有利于大规模纯化蛋白质，且移除半胱氨酸后能够增加修饰蛋白的稳定性（参见说明书第2页第24行-第4页第4行）。由于对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2与对比文件2公开的葡萄球菌毒素蛋白均具有奇数个半胱氨酸残基，其会形成二硫键导致如二聚体的形成从而降低蛋白质的稳定性和不利于蛋白质纯化，因此，本领域技术人员有动机去除对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中的半胱氨酸，在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列仅具有1个半胱氨酸残基的基础上具体选择去除的半胱氨酸残基位置是显而易见的，且对比文件1也给出了半胱氨酸残基并非不可或缺的技术启示。在本申请请求保护的SEQ ID NO：4显而易见的情况下，由于其与SEQ ID NO：2相比仅在N端缺失1个半胱氨酸残基，因此本领域技术人员可以合理预期或通过常用技术手段确定SEQ ID NO：4产生的抗体能够特异性识别SEQ ID NO：2所示的抗原。对于1-4个插入，对比文件3（CN102647999A，公开日为2012年08月22日）同样了公开了抗原sta006，其中SEQ ID NO：246与本申请SEQ ID NO：2完全一致，SEQ ID NO：248在SEQ ID NO：246的N端增加了Met-Ala-Ser-序列（参见说明书第271-272页以及序列42、246、248），结合上述对本申请SEQ ID NO：4所示的多肽显而易见的评述，本领域技术人员容易想到在SEQ ID NO：4的N端增加氨基酸残基如对比文件3公开的Met-Ala-Ser序列，且其余如增加1个或2或4个氨基酸残基也是常规选择，并未带来预料不到的技术效果。因此在对比文件1的基础上结合对比文件2、3和公知常识得到权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具有创造性。同理，权利要求2也不具有创造性。此外，对比文件1（参见说明书第31页第1行至第32页第25行）还公开了杂交多肽，以及使用一种以上抗原时，不必以单独多肽形式存在，两种抗原可表达成一条多肽链，在权利要求1-2所述多肽显而易见的基础上，权利要求3请求保护的包含权利要求1或2所述多肽的杂交蛋白也是显而易见的，权利要求3也不具有创造性。
权利要求4-6请求保护编码权利要求1-3所述多肽或杂交蛋白的核酸分子、包含所述核酸的载体或包含所述核酸或载体的宿主细胞，权利要求7请求保护用于制备权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的方法。在氨基酸序列已知的情况下获得其编码核苷酸序列以及将核苷酸序列构建入载体并将载体转染宿主细胞以及将转化有外源核酸和/或重组表达载体的宿主细胞进行培养以表达外源蛋白均为本领域常用技术手段，因此权利要求4-7也不具备创造性。
权利要求8-16请求保护包含权利要求1-2所述多肽的免疫原性组合物，权利要求18请求保护包含权利要求1-2所述多肽、权利要求所述杂交蛋白或权利要求8-16所述免疫原性组合物的药物组合物，然而，对比文件1公开了包括抗原如Sta006抗原和金黄色葡萄球菌外泌多糖如金黄色葡萄球菌5型或8型细胞的荚膜多糖以及载体分子的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖和载体分子可偶联，以及包含多肽或免疫原性组合物的药物组合物，其中所述药物组合物中可以包括蔗糖，组合物可以是水性形式或干燥形式如冻干，在冻干过程中稳定偶联物通常可以在组合物中包含糖醇或二糖（参见权利要求书、说明书第17页第5-31行），而且在免疫原性组合物中包括佐剂和辅料如糖是本领域常用技术手段，具体佐剂如氢氧化铝也是常规选择，并未带来预料不到的技术效果，因此权利要求8-16、18也不具备创造性。
权利要求17请求保护制备权利要求16所述组合物的方法，对比文件1公开了如果使用干燥的疫苗，则在注射前将其重建成液体介质（参见说明书第17页第17-23行）。因此权利要求17也不具备创造性。权利要求19请求保护权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白、权利要求8-16所述免疫原性组合物或权利要求18所述药物组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法的药物中的用途，对比文件1公开了sta006多肽或其变体具有免疫原性，本领域技术人员容易想到其或由其构成的杂交蛋白、含有其的免疫原性组合物或药物组合物用于在哺乳动物中产生免疫应答。因此权利要求19也不具备创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月25日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件，同时提交了如下参考文献1-2：
参考文献1：Staphylococcus aureus Deficient in Lipidation of Prelipoproteins Is Attenuated in Growth and Immune Activation,2005年,INFECTION AND IMMUNITY,第2411-2423页，英文复印件；
参考文献2：公布号为CN104736165A的发明专利申请，优先权日为2012年08月31日，公开日为2015年06月21日。
结合上述参考文献，复审请求人认为：1）对比文件1给出了N-末端半胱氨酸被脂化并且需要保留该半胱氨酸残基，尤其是针对疫苗用途的技术启示，而其中公开的sta006片段仅是纯粹理论上的样板，对比文件1-3没有给出sta006的二聚化或多聚化是需要解决的问题的任何启示，本领域技术人员没有动机寻求修饰sta006以降低或避免的二聚化或多聚化；参考文献1表明细菌脂蛋白是通过充分表征的途径在半胱氨酸上脂化的，因此本领域将知晓N末端半胱氨酸是脂化所必需的并有动机保留sta006的半胱氨酸残基；2）从sta006删除半胱氨酸残基对二聚体形成和吸附至铝盐时的稳定性有意想不到的技术效果，本申请说明书第218-221段公开了稳定性评价实验，证明了cys(-)突变体的改善的性质，也评价了含氢氧化铝佐剂的sta006 Cys(-)的稳定性，在此补充提交用于证明Cys(-)的稳定性优于Cys( )蛋白的补充实验数据，数据显示sta006 Cys(-)-铝盐复合物的稳定性较高，且在其他抗原HlaH35L、sta011和EsxAB中没有显著观察到这种作用，表明删除半胱氨酸所带来的显著减少二聚体同时提高稳定性的效果是无法预期的；类似数据也在请求人提交的相同优先权日的参考文献2也有公开。因此，权利要求1-19具有创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年05月04日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为，（1）本领域公知蛋白质中的半胱氨酸可能会不利于蛋白质的稳定性，因此，本领域技术人员有动机去除sta006相应片段的N末端半胱氨酸；（2）对比文件1并未记载sta006抗原必须进行脂化才能用作抗原，参考文献1也未记载细菌中对于脂蛋白仅能够通过半胱氨酸进行脂化；（3）补充实验数据及参考文献2的实验数据均未记载在申请文件中且均非现有技术，无法证明本申请取得了预料不到的技术效果，本申请说明书并未记载sta006 Cys（-）相对于其余蛋白质的稳定性数据，且本领域技术人员可以合理预期其效果在不同的蛋白质会有差异。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2019年03月21日向复审请求人发出复审通知书，指出：
（1）权利要求1与对比文件1相比，区别在于：权利要求1所示多肽在对比文件1 所示缺少前17个N末端氨基酸序列的基础上进一步缺少N末端的半胱氨酸，而且可在N端具有0-4个插入，所述多肽不含任何半胱氨酸氨基酸残基且能够引发识别SEQ ID NO:2的抗体。本发明实际解决的技术问题是如何提高Sta006抗原的稳定性。对于在N端插入0个氨基酸的技术方案，对本领域技术人员而言，蛋白质中存在的半胱氨酸是影响其稳定性的可能因素，在不影响蛋白质功能活性的基础上，本领域技术人员可以考虑尝试通过基因工程手段删除、替换或修饰引起多肽不稳定的残基从而提高多肽的稳定性（参见公知常识性证据，元英进主编，《现代制药工艺学 上》，化学工业出版社，2004年07月）。对比文件2同样涉及半胱氨酸残基对蛋白质稳定性的影响以及针对性的提高蛋白质稳定性的策略，其指出蛋白质中存在的奇数个半胱氨酸会促使由于二硫键所造成的多聚体的形成，并具体公开了通过将葡萄糖球菌毒素蛋白SEC-SER中会导致二聚体形成的半胱氨酸残基替换为丝氨酸后能提高蛋白的稳定性，而对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2同样具有奇数（1）个半胱氨酸残基，在此基础上，本领域技术人员有动机关注对比文件2中提高蛋白质稳定性的方式并尝试将其应用到对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，而在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列仅具有1个半胱氨酸残基的基础上选择尝试去除半胱氨酸残基是显而易见的。对于权利要求1中进一步限定相对于SEQ ID NO:4在N端有1-4个插入的技术方案，对比文件3涉及用于免疫接种以抵御金黄色葡萄球菌的组合物，其中同样公开了sta006抗原，其中SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列与本申请SEQ ID NO：1完全一致，SEQ ID NO:42的前17个N末端氨基酸可有用地省去以提供SEQ ID NO:246，其与本申请SEQ ID NO：2完全一致，SEQ ID NO：248则是在SEQ ID NO：246的N末端增加Met-Ala-Ser-序列（参见说明书第271-272段以及序列42、246、248），在此基础上，本领域技术人员容易想到在SEQ ID NO：4的N末端增加如对比文件3所示的氨基酸残基，而且可以合理预期或通过常规技术手段确定将SEQ ID NO：4的N端有1-4个氨基酸残基插入作为多肽抗原能够引发识别SEQ ID NO：2的抗体。综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及本领域常规技术手段得到权利要求1的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，而且根据说明书的描述，也没有产生预料不到的技术效果，因此，权利要求1不具备创造性。同理，权利要求2也不具有创造性。
在权利要求1-2不具有创造性的基础上，权利要求3请求保护包含权利要求1或2所述多肽的杂交蛋白，权利要求4-6请求保护编码权利要求1-3所述多肽或杂交蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及宿主细胞，权利要求7请求保护用于制备权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的方法，权利要求8-16请求保护包含权利要求1或2所述多肽的免疫原性组合物，权利要求18请求保护包含权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白或权利要求8-16所述免疫原性组合物的药物组合物；权利要求17请求保护制备权利要求16所述组合物的方法，权利要求19请求保护前述多肽、杂交蛋白、免疫原性组合物或药物组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法的药物中的用途也均不具备创造性。
（2）针对请求人的意见陈述，合议组认为：1）综合对比文件1公开的整体内容，其给出的信息是去除含N-末端半胱氨酸的片段或去除N-末端半胱氨酸前的片段并对该半胱氨酸进行修饰，均不会对sta006抗原片段功能产生实质性影响，而并未教导该N-末端半胱氨酸是必须保留的。对本领域技术人员而言，蛋白质中存在的半胱氨酸可能会导致蛋白质或多肽聚集而不利于蛋白质的稳定性，因而，本领域技术人员在不影响蛋白质功能活性的基础上，有动机尝试通过基因工程手段删除、替换或修饰引起多肽不稳定的半胱氨酸残基从而提高多肽的稳定性。而且对比文件2同样涉及半胱氨酸残基对蛋白质稳定性的影响以及如何针对性的提高蛋白质稳定性，因此，本领域技术人员有动机尝试删除对sta006抗原免疫原性没有明显负面影响而可能影响其稳定性的仅在其N末端存在的唯一半胱氨酸残基。参考文献1仅是通过对前脂蛋白缺乏脂化的金黄色葡萄球菌进行研究以证明菌株中存在的脂蛋白对金黄色葡萄球菌生长和免疫刺激的影响，并不涉及本申请所述的sta006抗原，而且根据对比文件1的描述可知，sta006抗原在金黄色葡萄球菌中通常并非脂蛋白形式存在，仅是在疫苗制备中人为选择对其脂化处理以产生佐剂效应。因此，参考文献1中对于由于未能充分脂化而导致的脂蛋白功能的研究结论，并不能直接适用于本申请中通常并非脂蛋白形式存在的sta006抗原。
2）减少由于半胱氨酸残基之间形成二硫键而形成的共价二聚体进而提高蛋白稳定性的效果是本领域技术人员可以合理预期的。参考文献2及复审请求书中列举的补充实验数据仅是比较说明sta006 Cys(-)相对于其余蛋白质如sta011、EsxAB中半胱氨酸去除后的稳定性变化程度存在一定差异，但本领域技术人员可以合理预期在不同蛋白质中的效果通常会存在一定的差异，上述参考文献2和补充实验数据不足以表明sta006 Cys(-)的稳定性相较于sta006 Cys( )的提高超过本领域技术人员可预期的程度。因此，请求人的意见不具备说服力。
复审请求人于2019年05月10日提交了意见陈述书，未修改申请文件，同时提交了如下参考文献3-6（编号续前）：
参考文献3：Staphylococcus aureus FhuD2 Is Involved in the Early Phase of Staphylococcal Dissemination and Generates Protective Immunity in Mice,2012年10月,The Journal of Infectious Diseases,第1041-1049页，英文复印件；
参考文献4：Identification and Characterization of fhuD1 and fhuD2,Two Genes Involved in Iron-Hydroxamate Uptake in Staphylococcus aureus,2001年,JOURNAL OF BACTERIOLOGY,第4994-5000页，英文复印件；
参考文献5：The Role of FhuD2 in Iron(Ⅲ)-Hydroxamate Transport in Staphylococcus aureus,2003年,JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY,第49890-49900页，英文复印件；
参考文献6：Lipoproteins in Staphylococcus aureus Mediate Inflammation by TLR2 and Iron-Dependent Growth In Vivo,2009年,The Journal of Immunology,第7110-7118页，英文复印件。
结合上述参考文献，复审请求人认为：1）sta006（FhuD2）已被广泛报道为脂蛋白，例如参考文献3-6所述其是参与铁转运的几种脂蛋白之一，而根据参考文献1的描述，细菌脂蛋白是通过充分表征的途径在半胱氨酸上脂化的，可知晓N末端半胱氨酸是脂化所必需的，因此，本领域技术人员有动机保留sta006的半胱氨酸；2）参考文献2和补充实验数据所证明的稳定性变化在不同蛋白质间差异巨大，并非本领域技术人员可以预期的。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时未修改申请文件。因此，本复审决定针对的文本与驳回决定针对的文本相同，即2015年02月12日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件的中文文本说明书第1-298段、说明书附图1-3、说明书摘要、序列表第1-7页以及2016年12月16日提交的权利要求第1-19项。
关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型具有实质性特点和进步。
在发明所要求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征的情况下，如果现有技术中已经给出了将此区别技术特征应用到该最接近的现有技术以解决其存在的技术问题的启示，同时这种启示会使本领域的技术人员在面对所述技术问题时，有动机改进该最接近的现有技术并获得要求保护的发明，则发明是显而易见的，不具有突出的实质性特点。
本案中，权利要求1请求保护一种多肽，其氨基酸序列相对于SEQ ID NO:4在N端有0-4个插入，所述多肽不含任何半胱氨酸氨基酸残基且能够引发识别SEQ ID NO:2的抗体。根据说明书及序列表的具体记载和描述可知，现有技术中已知的天然状态下金黄色葡萄球菌Sta006抗原（即铁色素结合蛋白）的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，在其成熟形式中具有N端半胱氨酸（氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，其在SEQ ID NO:1的基础上缺失N末端17个氨基酸）。本申请则是在SEQ ID NO:2的基础上进一步缺失其N末端第1位的半胱氨酸残基以获得如氨基酸序列SEQ ID NO:4所示的Sta006抗原的突变形式，即通过删除氨基酸序列中存在的半胱氨酸残基，从而使半胱氨酸残基之间的二硫键无法形成的方式防止共价二聚体的形成，进而提高Sta006抗原的稳定性，而不对其免疫原性产生负面影响（参见说明书第0006-0007、0011-0014段）。
对比文件1涉及金黄色葡萄球菌蛋白质抗原，其中公开了Sta006抗原，在NCTC 8325菌株中，Sta006具有氨基酸序列SEQ ID NO:26（即本申请中SEQ ID NO:1所示的天然状态金黄色葡萄球菌Sta006抗原），所述Sta006抗原可引发识别SEQ ID NO:26的抗体和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列（a）与SEQ ID NO:26有50%或更高相同性；和/或（b）包含SEQ ID NO:26的至少n个连续氨基酸的片段，其中n是7或更高（例如8、10、12……200、250或更高），并具体公开了这些Sta006蛋白包括SEQ ID NO:26的变体，优选的片段缺少SEQ ID NO:26的C末端的一个或多个氨基酸（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个）和/或N末端的一个或多个氨基酸（如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个），而保留SEQ ID NO:26的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO:26的前17个N末端氨基酸，其它片段省去一个或多个蛋白质结构域（参见说明书第26页第20行-第27页第2行以及序列表）。由此可见，对比文件1公开了在天然状态金黄色葡萄球菌Sta006抗原的基础上省去其前17个N末端氨基酸的Sta006多肽（即相当于本申请所述的SEQ ID NO:2），其与本申请权利要求1中的SEQ ID NO:4相比差别仅在于多一个N末端的半胱氨酸。
权利要求1与对比文件1相比，区别在于：权利要求1所示多肽在对比文件1 所示缺少前17个N末端氨基酸序列的基础上进一步缺少N末端的半胱氨酸，而且可在N端具有0-4个插入，所述多肽不含任何半胱氨酸氨基酸残基且能够引发识别SEQ ID NO:2的抗体。基于上述区别技术特征可以确定，本发明实际解决的技术问题是如何提高Sta006抗原的稳定性。
首先，对于在N端插入0个氨基酸的技术方案，对本领域技术人员而言，蛋白质的三维结构是其发挥生物功能的决定因素，因而蛋白质的稳定性对蛋白质类药物制剂的研究、生产、使用极为重要，而蛋白质中含巯基的半胱氨酸容易氧化，氧化的巯基暴露在蛋白质表面，会形成分子间的二硫键，导致蛋白质聚集，从而影响蛋白质或多肽的稳定性；此外还提出蛋白质或多肽的稳定方法，随着生物技术的快速发展，如通过基因工程手段替换引起多肽不稳定的残基或引入能增加多肽稳定性的残基，可提高多肽的稳定性（参见公知常识性证据，元英进主编，《现代制药工艺学 上》，化学工业出版社，2004年07月，第310页倒数第1段-第311页第1段、第315页9.2.2.3），由此可见，蛋白质中存在的半胱氨酸是影响其稳定性的可能因素，在不影响蛋白质功能活性的基础上，本领域技术人员可以考虑尝试通过基因工程手段删除、替换或修饰引起多肽不稳定的残基从而提高多肽的稳定性。此外，对比文件2涉及葡萄球菌肠毒素蛋白疫苗，其中同样涉及半胱氨酸残基对蛋白质稳定性的影响以及针对性的提高蛋白质稳定性的策略，其指出蛋白质中存在的奇数个半胱氨酸会促使由于二硫键所造成的多聚体的形成，并具体公开了通过将葡萄糖球菌毒素蛋白SEC-SER中会导致二聚体形成的半胱氨酸残基替换为丝氨酸后能提高蛋白的稳定性，即移除半胱氨酸后能够抑制多聚体的形成且有利于大规模纯化蛋白质，且能够增加修饰蛋白的稳定性（参见说明书第2页第23行-第4页第4行）。而对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2同样具有奇数（1）个半胱氨酸残基，而且如上所述，本领域公知含巯基的半胱氨酸容易氧化形成分子间的二硫键，导致蛋白质聚集，对此可通过基因工程手段加以处理，在此基础上，本领域技术人员有动机关注对比文件2中提高蛋白质稳定性的方式并尝试将其应用到对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中，而在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列仅具有1个半胱氨酸残基的基础上选择尝试去除半胱氨酸残基是显而易见的。而且根据对比文件1中对优选的Sta006抗原多肽片段的描述可知，所述有用的Sta006抗原可以缺失N末端17或20个氨基酸残基，而且还提到可通过例如用酰化N末端半胱氨酸对Sta006抗原进行脂化处理（参见说明书第27页第2行），可见，其N末端的半胱氨酸残基对于Sta006抗原引发免疫应答也不是必需的。
其次，对于本申请权利要求1中进一步限定相对于SEQ ID NO:4在N端有1-4个插入的技术方案，对比文件3涉及用于免疫接种以抵御金黄色葡萄球菌的组合物，其中同样公开了sta006抗原，其中SEQ ID NO：42所示的氨基酸序列与本申请SEQ ID NO：1完全一致，SEQ ID NO:42的前17个N末端氨基酸可有用地省去以提供SEQ ID NO:246，其与本申请SEQ ID NO：2完全一致，SEQ ID NO：248则是在SEQ ID NO：246的N末端增加Met-Ala-Ser-序列（参见说明书第271-272段以及序列42、246、248），在此基础上，本领域技术人员容易想到在SEQ ID NO：4的N末端增加如对比文件3所示的氨基酸残基，而且可以合理预期或通过常规技术手段确定将SEQ ID NO：4的N端有1-4个氨基酸残基插入作为多肽抗原能够引发识别SEQ ID NO：2的抗体。
综上，在对比文件1的基础上结合对比文件2、3以及本领域常规技术手段得到权利要求1的技术方案对本领域技术人员来说是显而易见的，而且根据说明书的描述，也没有产生预料不到的技术效果，因此，权利要求1不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。基于相同或类似的理由，权利要求2也不具有创造性。
权利要求3请求保护包含权利要求1或2所述多肽的杂交蛋白，然而，对比文件1在公开上述内容的基础上，还公开了包含所述多肽的杂交多肽，以及使用一种以上抗原时，不必以单独多肽形式存在，两种抗原可表达成一条多肽链（参见说明书第31页第1行至第32页第25行），因此，在其引用的权利要求不具有创造性的基础上，权利要求3也不具有创造性。
权利要求4-6请求保护编码权利要求1-3所述多肽或杂交蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述核酸分子或载体的宿主细胞，权利要求7请求保护用于制备权利要求1或2所述多肽或权利要求3所述杂交蛋白的方法。然而，在已知蛋白质或多肽的氨基酸序列的基础下获得编码其的核苷酸序列、构建目的基因的表达载体并将其转化或转染适合表达的宿主细胞均属于本领域的常规技术手段，因此，在其引用的权利要求不具有创造性的基础上，权利要求4-7也不具备创造性。
权利要求8-16请求保护包含权利要求1或2所述多肽的免疫原性组合物，权利要求18请求保护包含权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白或权利要求8-16所述免疫原性组合物的药物组合物，然而，对比文件1公开了包含抗原如Sta006抗原和金黄色葡萄球菌外泌多糖如金黄色葡萄球菌5型或8型细胞荚膜多糖以及载体分子的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖和载体分子可偶联，以及包含多肽或免疫原性组合物的药物组合物，其中所述药物组合物中可以包括蔗糖，组合物可以是水性形式或干燥形式如冻干，在冻干过程中稳定偶联物通常可以在组合物中包含糖醇或二糖（参见权利要求书、说明书第17页第5-31行），而且对本领域技术人员而言，在免疫原性组合物中包括佐剂和辅料如糖是本领域常规技术手段，具体佐剂如氢氧化铝等属于常规选择，并未产生预料不到的技术效果；权利要求17请求保护制备权利要求16所述组合物的方法，对比文件1公开了如果使用干燥的疫苗，则在注射前将其重建成液体介质（参见说明书第17页第17-23行）。因此，在其引用的权利要求不具有创造性的基础上，权利要求8-18也不具备创造性。
权利要求19请求保护权利要求1或2所述多肽、权利要求3所述杂交蛋白、权利要求8-16所述免疫原性组合物或权利要求18所述药物组合物在制备用于在哺乳动物中产生免疫应答的方法的药物中的用途，然而，对比文件1公开了sta006多肽或其变体具有免疫原性以及将其与金黄色葡萄球菌荚膜多糖组合用于制备疫苗，本领域技术人员容易想到将其或由其构成的杂交蛋白、含有其的免疫原性组合物或药物组合物用于在哺乳动物中产生免疫应答。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求19也不具备创造性。
针对复审请求人的意见陈述，合议组认为：1）对比文件1列举了在金黄色葡萄球菌疫苗制备中可选用的多个sta006抗原片段，本领域技术人员可以从中明确获知，去除sta006抗原N末端的17或20个氨基酸而保留其至少一个抗原表位的sta006优选抗原片段均可用于金黄色葡萄球菌疫苗的制备，可见，sta006抗原N末端第18位的半胱氨酸并非是对Sta006抗原引发免疫应答所必需的，仅是对含有N末端半胱氨酸的sta006抗原片段还可以选择通过酰化的方式使sta006抗原脂化。综合对比文件1所公开的整体内容，其给出的信息是去除含N-末端半胱氨酸的片段或去除N-末端半胱氨酸前的片段并对该半胱氨酸进行修饰，均不会对sta006抗原片段引发免疫应答产生实质性影响，而并未教导该N-末端半胱氨酸是必须保留的。而对本领域技术人员而言，蛋白质中存在的半胱氨酸可能会导致蛋白质或多肽聚集而不利于蛋白质的稳定性，因而，出于对蛋白质或多肽类抗原稳定性的普遍追求，本领域技术人员在不影响其引发免疫应答的基础上，有动机尝试通过基因工程手段删除、替换或修饰引起多肽不稳定的半胱氨酸残基从而提高多肽的稳定性。而且对比文件2同样涉及半胱氨酸残基对作为疫苗使用的蛋白质稳定性的影响以及如何针对性的提高蛋白质稳定性，因此，本领域技术人员在对比文件1公开的本申请SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的基础上，有动机尝试删除对sta006抗原免疫原性没有明显负面影响而可能影响其稳定性的仅在其N末端存在的唯一半胱氨酸残基。参考文献1仅是通过对前脂蛋白缺乏脂化的金黄色葡萄球菌进行研究以证明菌株中存在的脂蛋白对金黄色葡萄球菌生长和免疫刺激的影响，其中并不涉及本申请所述的sta006抗原，虽然如参考文献3-6所述sta006蛋白在金黄色葡萄球菌中以脂蛋白形式存在参与铁转运，但结合对比文件1公开的整体内容，所表明的是该蛋白是否脂化可能会影响其作为铁色素结合蛋白参与的铁转运功能，并未表明sta006脂化与否会对其作为抗原片段引发免疫应答产生实质性影响，对比文件1和3中均明确去除sta006抗原N末端的17或20个甚至更多个氨基酸而保留其至少一个抗原表位的sta006优选抗原片段均可用于金黄色葡萄球菌疫苗的制备。
2）对于复审请求人补充提交的涉及比较吸附于铝盐的Cys(-)蛋白质与Cys( )蛋白质解析效率的补充实验数据，首先，根据上文描述，本领域技术人员有动机尝试删除对sta006抗原免疫原性没有明显负面影响而可能影响其稳定性的仅在其N末端存在的唯一半胱氨酸残基，其减少由于半胱氨酸残基之间形成二硫键而形成的共价二聚体进而提高蛋白稳定性的效果是本领域技术人员可以合理预期的；其次，虽然请求人试图通过比较几种不同蛋白质的Cys(-)蛋白质与Cys( )蛋白质解析效率的差异来反映sta006 Cys(-)相对于其他蛋白对于吸附于铝盐时的稳定性具有更显著的影响，但对本领域技术人员而言，蛋白质的化学不稳定性受多种因素的影响，例如键断裂、键形成、键重排以及取代等，存在脱酰胺化、硫的氧化、二硫键的交换、水解等多种反应表现，各种蛋白的结构稳定性各不相同，影响其稳定性的主要因素也各不相同，而且抗原与铝盐佐剂的吸附还与铝盐佐剂和蛋白质抗原的表面电荷状态、疏水性和亲水性等特性有关，由于半胱氨酸在sta006和其他蛋白中存在的位置和数量不同，因此Cys缺失后对不同蛋白抗原的整体结构、表面电荷状态的影响程度也会各不相同，不同蛋白抗原与铝盐佐剂的吸附效果也各不相同，尽管请求人提供的补充实验数据中的sta011、Hla、EsxA-B的Cys(-)与Cys( )的解析效率差异低于sta006，但不同蛋白质之间并没有直接的可比性，而且也没有证据表明所选择的这几种蛋白即代表了现有技术中的整体趋势。最后，由于对比文件1、3和公知常识均已经明确给出了去除半胱氨酸有助于减少由于半胱氨酸残基之间形成二硫键而形成的共价二聚体进而提高蛋白稳定性的技术启示，权利要求1的技术效果是在上述技术方案显而易见的基础上通过常规手段即可检测获得的。综上，上述参考文献2和补充实验数据不足以表明sta006 Cys(-)的稳定性或吸附于铝盐的解析效率相较于sta006 Cys( )的提高超过本领域技术人员可预期的程度。
因此，请求人的意见不具备说服力。
三、决定
维持国家知识产权局于2018年01月11日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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