发明创造名称：用于蛋白质表达的重组细菌宿主细胞
外观设计名称：
决定号：180475
决定日：2019-05-31
委内编号：1F246870
优先权日：2012-05-14
申请（专利）号：201380025191.0
申请日：2013-05-13
复审请求人：UCB医药有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：马振莲
合议组组长：吴立
参审员：王翔宇
国际分类号：C07K16/24，C12N15/70
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，而现有技术中给出了将所述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的启示，则该技术方案是显而易见的，不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380025191.0，名称为“用于蛋白质表达的重组细菌宿主细胞”的发明专利申请。申请人为UCB医药有限公司。本申请的申请日为2013年05月13日，优先权日为2012年05月14日，公开日为2015年04月01日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年12月26日以权利要求1-28不符合专利法第22条第3款的规定、权利要求13不符合专利法第26条第4款的规定为由驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：2014年11月14日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要、说明书第1-364段（即第1-53页）、摘要附图、说明书附图图1-图8（即第1-24页）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-52页；以及2017年02月21日提交的权利要求第1-28项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种重组革兰阴性细菌细胞，其包含：
a.编码在选自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的突变spr基因，和
b.表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD的表达载体，
其中所述细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。
2. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A、H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
3. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
4. 权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码具有突变C94和H145A例如C94的spr蛋白。
5. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A和H157A的突变的spr蛋白。
6. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自 C94A的突变的spr蛋白。
7. 任何前述权利要求的细胞，其中将所述突变spr基因整合入细胞的基因组。
8. 任何前述权利要求的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因例如在质粒上瞬时转染入细胞。
9. 权利要求1至7的任一项的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因整合进入细胞基因组。
10. 任何前述权利要求的细胞，其中所述能够促进蛋白质折叠的蛋白为FkpA、Skp或FkpA与Skp的组合，特别是FkpA。
11. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞还包含下列突变的基因的一个或多个：
a.编码具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因；
b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或为敲除突变的ptr基因；和
c.突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白或为敲除突变的OmpT基因。
12. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因，或为敲除突变的Tsp基因。
13. 权利要求12的细胞，其中所述细胞的基因组，除突变的spr 基因和突变的Tsp基因外，与野生型细菌细胞是同基因的。
14. 一种重组革兰阴性细菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，并且具有编码能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白的突变spr基因，并且具有表达载体，所述表达载体表达编码适合用于表达能够促进蛋白质折叠的蛋白的编码FkpA、Skp或FkpA与Skp的组合，特别是FkpA的基因，其中除相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰和突变的spr基因外，所述细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。
15. 权利要求14的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A和W174R的一个或多个突变的spr蛋白。
16. 权利要求14的细胞，其中所述突变spr基因编码具有一个或多个权利要求1至6的任一项中定义的突变的spr蛋白。
17. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞具有敲除突变的Tsp基因，所述基因包含针对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。
18. 权利要求17的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含通过针对基因起始密码子的错义突变产生的限制性标记位点和任选地一个或多个其它点突变。
19. 权利要求18的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含SEQ ID NO:3。
20. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞是大肠杆菌，例如其中所述大肠杆菌是菌株K12或W3110。
21. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码目标蛋白的多核苷酸序列。
22. 权利要求21的细胞，其中所述目标蛋白为抗体或其抗原结合片段。
23. 权利要求22的细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段特异于FcRn。
24. 一种重组革兰阴性细菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性并且包含编码突变spr蛋白的突变spr基因，并且包含表达载体，所述表达载体包含编码适合用于表达能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因和编码特异于FcRn的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。
25. 权利要求24的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
26. 一种用于产生目标蛋白的方法，包括在对于表达目标重组蛋白是有效的条件下于培养基中培养权利要求1至25的任一项中定义的重组革兰阴性细菌细胞，和从重组革兰阴性细菌细胞的周质和/或培养基回收目标重组蛋白。
27. 权利要求26的方法，其中所述方法还包括从细胞回收目标蛋白。
28. 权利要求27的方法，其中从周质和/或上清液回收目标蛋白。”
驳回决定认为：（一）权利要求1请求保护一种重组革兰阴性细菌细胞。对比文件2（WO2011086136 A1，公开日：2011年07月21日）公开了适合于表达目的蛋白质的重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因，且所述细胞具有相比于野生型细胞降低的Tsp蛋白质活性。相比于携带突变的Tsp基因的细胞，携带所述新的spr突变并具有降低的Tsp活性的细胞显示出降低的细胞裂解表型。因此，相比于携带突变的Tsp基因的细胞，新菌株减少了细胞中的蛋白质渗漏并延长了细胞周质中蛋白质的积累。细胞只携带引入一种或多种spr突变所需的基因组最小突变以及相比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的修饰。细菌细胞与野生型细菌细胞基因组的差异只有对spr基因的一种或多种突变以及相比于野生型细胞降低Tsp蛋白质活性所需的修饰(即所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸)。优选地，亲本细胞为大肠杆菌。大肠杆菌的任何合适菌株可用于本发明，但优选野生型W3110菌株，如W3110 K-12。一个优选的实施方式的细胞包含编码spr蛋白质的突变的spr基因，其在选自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处具有突变，优选在选自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一个或多个氨基酸处具有突变(参见说明书第6-34页)。权利要求1与对比文件2相比，区别特征在于:重组革兰阴性细菌细胞还含有表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD的表达载体。权利要求1实际解决的技术问题是：提供了一种新的促进抗体蛋白生产的重组革兰阴性细菌。本领域技术人员知晓，FkpA，Skp，SurA、PPiA和PPiD都是伴侣蛋白，能够促进蛋白质的折叠。对比文件3（EP1356052 B1，公开日：2008年08月20日）公开了转染了paTF50(过表达重组抗体)的59A7细胞最高产生156mg/L的AME-RP(重组抗体)，转染了PJG9kpAB3（过表达FkpA和重组抗体）的59A7细胞最高产生247mg/L的AME-RP(重组抗体)。类似的，转染了paTF50(过表达重组抗体)的58H7细胞最高产生100mg/L的AME-RP(重组抗体),共转染paTF50（过表达重组抗体）和pJVG2（过表达FkpA）的58H7细胞最高产生180mg/L的AME-RP(重组抗体)（参见实施例10）。根据对比文件3公开的内容，本领域技术人员易于想到将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因FkpA、Skp、SurA、PPiA、PPiD中的一种或多种通过表达载体转入对比文件2所述的细胞中。可见，在对比文件2的基础上结合对比文件3以及本领域常用技术手段获得权利要求1的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。基于相似的理由，权利要求14、24也不具备创造性。从属权利要求2-13、15-23、25的附加技术特征或者已被对比文件2、3或对比文件1（WO2012013930 A2，公开日：2012年02月02日）公开，或者属于本领域常规技术，因此权利要求2-13、15-23、25也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。权利要求26-28的技术特征是在对比文件2公开的内容的基础上容易想到的，因此权利要求26-28也不具备专利法第22条第3款所规定的创造性。（二）当权利要求13引用权利要求9、11时，或者引用引用了权利要求9的权利要求10时，其技术方案不清楚，不符合专利法第26条第4款的规定。
申请人UCB医药有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年03月16日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件2说明书第18页第6-13行教导了细胞额外地包含编码DsbC的重组多核苷酸，优选通过表达载体而处于细胞中。对比文件3说明书第74段教导了为了改善分泌的抗体多肽的组装和折叠，可以使用过表达伴侣蛋白例如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）的载体共转化宿主细胞。对比文件2和3的教导是在细胞中引入编码DsbC的多核苷酸，与本申请权利要求1所述的方向相反，因此权利要求1具备创造性。（2）比较对比文件3的实施例9和10可知，与抗体共表达DsbC时的抗体效价比共表达FkpA时更优，可见对比文件2和3都教导了包含DsbC时的表达及有益效果，这与权利要求1的技术方案相反。因此，本申请的技术方案具备创造性。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月09日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：对比文件2第7页第16-18行是指修饰的细胞与野生型细胞相比只有SPR基因以及TSP蛋白活性的改变，修饰后的细胞应该没有转入DsbC。对比文件2说明书第18页第6-13行公开的是一个优选技术方案，和上文的技术方案并不矛盾，其中也公开了将DsbC的编码核酸构建表达载体转入细胞和/或插入宿主细胞基因组。优选的，DsbC编码基因插入宿主细胞基因组。根据对比文件2公开的内容，无法得出“优选的编码DsbC的多核苷酸以表达载体的方式存在，从而对宿主细胞基因组造成最小的破坏”。此外，对比文件2实施例采用的细胞（见表1）都只修饰了TSP和spr，并没有同时过表达DsbC，并没有教导一定要同时转入DsbC。对比文件3公开了共表达FkpA和全长抗体可以提高抗体效价，本领域技术人员有动机将FkpA转入对比文件2公开的细胞中，来提高表达抗体的效价。虽然对比文件3公开了与抗体共表达DsbC时抗体效价比共表达FkpA时更优，但本申请也没有证明与抗体共表达FkpA比共表达DsbC时抗体效价更优，其只是在对比文件1公开了在有突变的spr基因和降低的Tsp蛋白活性的重组革兰氏阴性菌中表达重组抗体或其结合片段和DsbC的情况下，使用FkpA等其他分子伴侣替代DsbC。因此，坚持驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月07日向复审请求人发出复审通知书，指出：权利要求1与对比文件2的区别特征在于：权利要求1限定了重组革兰阴性细菌细胞还包含表达一种或多种能够促进蛋白质折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD的表达载体，且所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种能够提高重组蛋白表达活性的重组革兰阴性细菌。针对该区别特征，对比文件3公开了将FkpA蛋白（具有分子伴侣活性的肽酰脯氨酰顺反异构酶）与全长抗TF抗体在大肠杆菌中共表达，结果表明：用paTF50质粒（表达抗TF抗体）转染的59A7细胞发酵产生的重组抗体的滴度最高约为156mg/L，相比之下，用PJG9kpAB3质粒（表达FkpA和抗TF抗体）转染的59A7宿主细胞发酵产生的重组抗体滴度为247mg/L。类似的，用paTF50质粒转染的58H7细胞发酵产生的重组抗体的滴度最高约为100mg/L，相比之下，用paTF50质粒（表达抗TF抗体）和pJVG2质粒（表达FkpA）共转染的58H7细胞发酵产生的重组抗体滴度为180mg/L（参见实施例10）。可见，对比文件3已经证实了将分子伴侣FkpA与抗体共表达能够提高抗体在大肠杆菌中的表达滴度，即对比文件3教导了将分子伴侣与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够促进重组蛋白的正确折叠。本领域公知，FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD都是能够促进重组表达蛋白的正确折叠和组装的分子伴侣（例如，参见《基因工程药物的制备原理与应用》，李校坤、袁辉主编，广州：暨南大学出版社，公开日：2003年08月31日，第48-49页）。在对比文件3的提示下，本领域技术人员容易想到将对比文件3公开的FkpA以及本领域公知的具有相似功能的其它分子伴侣如Skp、SurA、PPiA和PPiD引入对比文件2公开的宿主细胞以改善重组蛋白的表达。通过表达载体引入分子伴侣蛋白也已被对比文件3公开。此外，对比文件3的实施例10中的重组大肠杆菌显然不包含编码DsbC的重组多核苷酸。可见，上述区别技术特征已经被对比文件3公开，且其在对比文件3中所起的作用与在本申请中的作用都是为了改善重组蛋白在宿主细胞中的表达，因此，在对比文件2的基础上结合对比文件3以获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求1不具备创造性。基于相似的理由，权利要求14、24也不具备创造性。从属权利要求2-13、15-23、25的附加技术特征均或者已被对比文件2、3或对比文件1公开，或者属于本领域常规技术，因此权利要求2-13、15-23、25也不具备创造性。权利要求26-28的技术特征均已被对比文件2公开，因此权利要求26-28也不具备创造性。对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：对比文件2采用的细胞仅具有突变的spr基因和/或降低的Tsp蛋白活性，并没有过表达DsbC。虽然对比文件2记载了“重组革兰阴性细菌细胞进一步包含编码DsbC的重组多核苷酸”，这并不意味着所述细胞必然含有DsbC，因此对比文件2没有给出相反教导。DsbA、DsbB、DsbC、DsbD、FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD均为本领域公知的分子伴侣，从中选取一种或多种与重组蛋白共表达属于常规选择。对比文件3提供了促进重组蛋白的正确折叠和组装的两种途径：与Dsb蛋白共表达或与FkpA蛋白共表达。本申请选择了与促进蛋白折叠的蛋白例如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD共表达，也在对比文件3的教导范围之内。比较对比文件3的实施例9和10可知，对比文件3教导了与FkpA共表达时的效果比共表达Dsb蛋白时更优，在对比文件3的提示下，本领域技术人员有动机将分子伴侣蛋白如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD与重组蛋白共表达以提高其表达活性。
复审请求人于2019年03月22日提交了意见陈述书，同时提交了权利要求书的全文替换页（共4页，26项），修改之处在于：在原权利要求1、14、24中限定了所述革兰阴性细菌属于大肠杆菌K12或W3110菌株，同时限定了表达载体表达FkpA和Skp；将原权利要求26中的革兰阴性细菌限定为大肠杆菌，删除了原权利要求10、20，并对其它权利要求作适应性修改。修改后的权利要求书如下：
“1. 一种重组大肠杆菌细胞，其包含：
a.编码在选自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸上具有突变的spr蛋白的突变spr基因，和
b.表达FkpA和Skp的表达载体，
其中所述细胞属于大肠杆菌K12或W3110菌株，并且
其中所述细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。
2. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A、H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
3. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G和G147C的一个或多个突变的spr蛋白。
4. 权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码具有突变C94和H145A例如C94的spr蛋白。
5. 权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自D133A、H145A和H157A的突变的spr蛋白。
6. 权利要求1的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自 C94A的突变的spr蛋白。
7. 任何前述权利要求的细胞，其中将所述突变spr基因整合入细胞的基因组。
8. 任何前述权利要求的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因例如在质粒上瞬时转染入细胞。
9. 权利要求1至7的任一项的细胞，其中将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因整合进入细胞基因组。
10. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞还包含下列突变的基因的一个或多个：
a.编码具有伴侣蛋白活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白的突变的DegP基因；
b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III蛋白或为敲除突变的ptr基因；和
c.突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白或为敲除突变的OmpT基因。
11. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因，或为敲除突变的Tsp基因。
12. 权利要求11的细胞，其中所述细胞的基因组，除突变的spr基因和突变的Tsp基因外，与野生型细菌细胞是同基因的。
13. 一种重组大肠杆菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的 Tsp蛋白活性，并且具有编码能够抑制包含突变的Tsp基因的细胞的表型的spr蛋白的突变spr基因，并且具有表达载体，所述表达载体表达编码FkpA与Skp的组合基因，其中除相较于野生型细胞降低Tsp蛋白活性所需的修饰和突变的spr基因外，所述细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸，其中所述细胞属于大肠杆菌K12或W3110菌株，。
14. 权利要求13的细胞，其中所述突变spr基因编码具有选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A和W174R的一个或多个突变的spr蛋白。
15. 权利要求13的细胞，其中所述突变spr基因编码具有一个或多个权利要求1至6的任一项中定义的突变的spr蛋白。
16. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞具有敲除突变的Tsp基因，所述基因包含针对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。
17. 权利要求16的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含通过针对基因起始密码子的错义突变产生的限制性标记位点和任选地一个或多个其它点突变。
18. 权利要求17的细胞，其中所述敲除突变的Tsp基因包含SEQ ID NO:3。
19. 任何前述权利要求的细胞，其中所述细胞包含编码目标蛋白的多核苷酸序列。
20. 权利要求19的细胞，其中所述目标蛋白为抗体或其抗原结合片段。
21. 权利要求20的细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段特异于FcRn。
22. 一种重组大肠杆菌细胞，其相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性并且包含编码突变spr蛋白的突变spr基因，并且包含表达载体，所述表达载体包含编码FkpA和Skp蛋白的基因和编码特异于FcRn的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列，并且其中所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸，其中所述细胞属于大肠杆菌K12或W3110菌株，。
23. 权利要求22的细胞，其中所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp基因。
24. 一种用于产生目标蛋白的方法，包括在对于表达目标重组蛋白是有效的条件下于培养基中培养权利要求1至23的任一项中定义的重组大肠杆菌细胞，和从重组大肠杆菌细胞的周质和/或培养基回收目标重组蛋白。
25. 权利要求24的方法，其中所述方法还包括从细胞回收目标蛋白。
26. 权利要求25的方法，其中从周质和/或上清液回收目标蛋白。”
复审请求人认为：（1）与对比文件2相比，本发明的细菌细胞具有更完整的细胞膜，导致更多的重组蛋白在周质空间中产生和维持，即较少的重组蛋白泄漏到上清液中。对比文件3教导了使用具有高度突变的基因组的宿主细胞作为起点，FkpA和DsbC可以导致增加的产物滴度，其没有暗示甚至没有考虑到重组蛋白会丧失到上清液中，也没有考虑到FkpA和DsbC对此会产生影响。（2）本发明发现，共表达FkpA和Skp伴侣蛋白可以显著提高目标蛋白的表达水平，明显高于仅表达FkpA或Skp伴侣蛋白的MXE016或MXE017菌株。可见，在重组大肠杆菌中组合表达FkpA和Skp伴侣蛋白能够起到协同增强目标蛋白表达的效果，这是基于对比文件2 和3的教导无法预见的，权利要求1的技术方案取得了出乎意料的技术效果。因此，权利要求1的技术方案具有突出的实质性特点，带来了显著的进步，因而具备创造性。同理，其余权利要求也具备创造性。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）审查文本的认定
复审请求人于2019年03月22日答复复审通知书时提交了权利要求书的全文替换页（共4页，26项），经审查，上述修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审请求审查决定所依据的审查文本为：2014年11月14日本申请进入中国国家阶段时提交的国际申请文件中文译文的说明书摘要、说明书第1-53页（即第1-364段）、摘要附图、说明书附图第1-24页（即图1-图8）、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-52页；以及2019年03月22日提交的权利要求第1-26项。
（二）专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
根据该款规定，如果发明请求保护的技术方案与最接近的现有技术相比存在区别技术特征，而现有技术中给出了将所述区别技术特征应用到该最接近的现有技术，以解决其存在的技术问题的启示，则该技术方案是显而易见的，不具备创造性。
1、本案中，权利要求1请求保护一种重组大肠杆菌细胞。对比文件2是最接近的现有技术，其中公开了一种重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因，所述突变的spr基因编码在选自D133、H145、H157、N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、V135、L136、G140、R144和G147的一个或多个氨基酸处具有突变的spr蛋白，且所述细胞与野生型细胞相比具有降低的Tsp蛋白活性（参见权利要求1）。对比文件2进一步公开了所述革兰阴性细胞菌株为大肠杆菌W3110，如W3110 K-12菌株（参见实施例1-7，说明书第9页第17-20行）。权利要求1与对比文件2相比，区别特征在于：权利要求1进一步限定了所述大肠杆菌细胞包含表达FkpA和Skp的表达载体，且不包含编码DsbC的重组多核苷酸。权利要求1实际解决的技术问题是：提供一种能够提高重组蛋白表达活性的重组大肠杆菌。
针对上述区别特征，首先，对比文件3公开了将FkpA蛋白与全长抗TF抗体在大肠杆菌中共表达，结果表明：用paTF50质粒（表达抗TF抗体）转染的59A7细胞发酵产生的重组抗体的滴度最高约为156mg/L，相比之下，用PJG9kpAB3质粒（表达FkpA和抗TF抗体）转染的59A7宿主细胞发酵产生的重组抗体滴度为247mg/L。类似的，用paTF50质粒转染的58H7细胞发酵产生的重组抗体的滴度最高约为100mg/L，相比之下，用paTF50质粒（表达抗TF抗体）和pJVG2质粒（表达FkpA）共转染的58H7细胞发酵产生的重组抗体滴度为180mg/L（参见实施例10）。可见，对比文件3实施例10证实了将分子伴侣FkpA与抗体在大肠杆菌中共表达能够提高抗体的表达滴度，即教导了将分子伴侣FkpA与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够改善重组蛋白的表达，该实施例中的重组大肠杆菌显然不包含编码DsbC的重组多核苷酸。其次，本领域公知，分子伴侣Skp与FkpA均具有帮助在周质中集聚或降解的重组蛋白折叠的功能（例如，参见《基因工程药物的制备原理与应用》，李校坤、袁辉主编，广州：暨南大学出版社，公开日：2003年08月31日，第48-49页）。而且，对比文件3实施例9证实了将抗体与两种分子伴侣DsbA和DsbC在大肠杆菌中共表达时所获得的抗体滴度，明显高于仅表达DsbA或DsbC时的抗体滴度，即教导了将两种功能相似的分子伴侣与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够协同增强目标蛋白的表达效果。在对比文件3的教导下，本领域技术人员容易想到将Skp与FkpA这两种具有相似功能的分子伴侣共同引入对比文件2的宿主细胞以改善重组蛋白的表达。通过表达载体引入分子伴侣蛋白也已被对比文件3公开。综上所述，在对比文件2的基础上结合对比文件3以获得权利要求1请求保护的技术方案是显而易见的，其所能达到的技术效果也是基于现有技术能够预期的，因此权利要求1不具备突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
2、权利要求2-6对突变spr基因做了进一步限定。对比文件2进一步公开了以下内容：所述突变spr基因编码的spr 蛋白具有选自D133A、H145A、H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一个或多个突变（参见权利要求2）；突变spr基因编码的spr蛋白具有选自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G和G147C的一个或多个突变（参见权利要求3）；突变spr基因编码的spr蛋白具有选自D133A、H145A和H157A的突变（参见权利要求5）；突变的spr基因可包含：对C94的突变；或对C94和H145的突变；spr蛋白可具有C94A、H145A和H157A突变中的一个、两个或三个（参见说明书第12页第8-27行）。可见，权利要求2-6的附加技术特征均已被对比文件2公开。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-6也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
3、权利要求7进一步限定了将所述突变spr基因整合入细胞的基因组。对比文件2公开了除了突变spr基因和突变Tsp基因以外，所述细胞的基因组与野生型细菌细胞是同基因的（参见权利要求8），即对比文件2已经公开了突变spr基因整合入细胞的基因组。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求7也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
4、权利要求8进一步限定了将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因例如在质粒上瞬时转染入细胞；权利要求9限定了将编码能够促进蛋白质折叠的蛋白的基因整合进入细胞基因组。如评述权利要求1所述，对比文件3已经公开了将分子伴侣FkpA通过质粒瞬时转染宿主细胞（参见实施例10），可见权利要求8的附加技术特征已被对比文件3公开。此外，将外源蛋白基因整合进入细胞基因组是本领域技术人员为了实现外源蛋白的稳定表达常用的技术手段。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求8和9也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
5、权利要求10-12对所述细胞作了进一步限定。对比文件2公开了所述细胞进一步包含以下突变的基因中一个或多个：a.编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变的DegP基因；b.突变的ptr基因，其中所述突变的ptr基因编码具有降低的蛋白 酶活性的蛋白酶III蛋白质或为敲除突变的ptr基因；以及c.突变的OmpT基因，其中所述突变的OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或为敲除突变的OmpT基因（参见权利要求6）；所述细胞包含突变的Tsp基因，其编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质或为敲除突变的 Tsp基因（参见权利要求7）；除了突变的spr基因以及突变的 Tsp基因以外，所述细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的（参见权利要求8）。可见，权利要求10-12的附加技术特征均已被对比文件2公开。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求10-12也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
6、权利要求13请求保护一种重组大肠杆菌细胞。对比文件2是最接近的现有技术，其中公开了一种重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含突变的spr基因，所述突变的spr基因编码突变的spr蛋白，且所述细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，所述细胞除了突变的spr基因以及突变的 Tsp基因以外，所述细胞基因组与野生型细菌细胞是同基因的（参见权利要求8）。对比文件2进一步公开了所述革兰阴性细胞菌株为大肠杆菌W3110，如W3110 K-12菌株（参见实施例1-7，说明书第9页第17-20行）。权利要求13与对比文件2相比，区别特征在于：权利要求13进一步限定了所述细胞还具有表达载体，所述表达载体表达编码FkpA与Skp的组合，且所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸。权利要求13实际解决的技术问题是：提供了一种能够提高重组蛋白表达活性的重组大肠杆菌。
针对该区别特征，如评述权利要求1所述，首先，对比文件3实施例10教导了将分子伴侣FkpA与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够促进重组蛋白的正确折叠，该实施例中的重组大肠杆菌不包含编码DsbC的重组多核苷酸。其次，本领域公知，分子伴侣Skp与FkpA均能够帮助在周质中集聚或降解的重组蛋白折叠。由于对比文件3实施例9教导了将两种功能相似的分子伴侣与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够协同增强目标蛋白的表达效果，在这一提示下，本领域技术人员容易想到将Skp与FkpA共同引入对比文件2的宿主细胞以改善重组蛋白的表达。通过表达载体引入分子伴侣蛋白也已被对比文件3公开。因此，在对比文件2的基础上结合对比文件3以获得权利要求13请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求13不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
7、权利要求14-21对于细胞中包含的基因、基因序列、目标蛋白作了进一步限定。对比文件2进一步公开了突变体spr基因编码的spr蛋白具有一个或多个选自N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A、G147C、H157A和W174R的突变（参见权利要求10）；突变体spr基因编码的spr蛋白具有一个或多个如权利要求1-5中任何一项限定的突变（参见权利要求11）；所述细胞具有敲除突变的Tsp基因，其包含对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子（参见权利要求12）；敲除突变的Tsp基因包含对基因起始密码子的错义突变产生的限制性标记物位点以及任选地一个或多个其他点突变（参见权利要求13）；敲除突变的Tsp基因包含SEQ ID NO:3（与本申请的SEQ ID NO:3完全相同）（参见权利要求14）；所述细胞包含编码目的蛋白的多核苷酸序列（参见权利要求16）；所述目的蛋白质为抗体或其抗原结合片段（参见权利要求17），所述抗体或其抗原结合片段对TNF具有特异性（参见权利要求18）。可见，权利要求14-20的附加技术特征均已被对比文件2公开。此外，在对比文件2公开了所述目的蛋白为抗体或其抗原结合片段例如对TNF具有特异性的抗体或其抗原结合片段的基础上，利用所述细胞重组生产对FcRn具有特异性的抗体或其抗原结合片段是本领域技术人员容易想到的，属于常规选择。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求14-21也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
8、权利要求22请求保护一种重组大肠肝菌细胞。对比文件2是最接近的现有技术，其中公开了一种重组革兰氏阴性细菌细胞，其包含编码突变spr蛋白的突变spr基因，且所述细胞相较于野生型细胞具有降低的Tsp蛋白活性，所述细胞除了突变的spr基因以及突变的 Tsp基因以外，所述细胞包含编码对TNF具有特异性的抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列（参见权利要求18）。对比文件2进一步公开了所述革兰阴性细胞菌株为大肠杆菌W3110，如W3110 K-12菌株（参见实施例1-7，说明书第9页第17-20行）。权利要求22与对比文件2相比，区别特征在于：（1）权利要求22进一步限定了所述细胞还包含表达载体，所述表达载体包含编码FkpA和Skp蛋白的基因，且所述细胞不包含编码DsbC的重组多核苷酸；（2）表达的抗体或其抗原结合片段针对的抗原不同。权利要求22实际解决的技术问题是：提供了一种重组大肠杆菌，其能够提高对另一抗原具有特异性的抗体或其抗原结合片段的重组表达活性。
对于区别特征（1），如评述权利要求1所述，首先，对比文件3实施例10教导了将分子伴侣FkpA与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够促进重组蛋白的正确折叠，该实施例中的重组大肠杆菌不包含编码DsbC的重组多核苷酸。其次，本领域公知，分子伴侣Skp与FkpA均能够帮助在周质中集聚或降解的重组蛋白折叠。由于对比文件3实施例9教导了将两种功能相似的分子伴侣与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够协同增强目标蛋白表达的效果，在这一提示下，本领域技术人员容易想到将Skp与FkpA共同引入对比文件2的宿主细胞以改善重组蛋白的表达。对于区别特征（2），如评述权利要求21所述，在对比文件2公开了目的蛋白为抗体或其抗原结合片段，例如对TNF具有特异性的抗体或其抗原结合片段的基础上（参见权利要求17、18），利用所述细胞重组生产对另一抗原如FcRn具有特异性的抗体或其抗原结合片段是本领域技术人员容易想到的，属于常规选择。因此，在对比文件2的基础上结合对比文件3以及本领域常规选择以获得权利要求22请求保护的技术方案是显而易见的，权利要求22不符合专利法第22条第3款有关创造性的规定。
9、权利要求23引用权利要求22，对TSP基因作了进一步限定。对比文件2公开了所述细胞包含编码具有降低的蛋白酶活性的Tsp蛋白的突变的Tsp基因或敲除突变的Tsp 基因（参见权利要求20）。因此，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求23也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
10、权利要求24请求保护一种用于产生目标蛋白的方法，权利要求25、26对所述方法作了进一步限定。对比文件2公开了一种用于生产目标重组蛋白的方法，包括：在有效表达目的重组蛋白的条件下，于培养基中培养前述权利要求任一项中定义的重组革兰阴性细菌细胞，和从重组革兰阴性细菌细胞的周质和/或培养基回收目标重组蛋白（参见权利要求21）；所述方法进一步包括从细胞中回收目标蛋白（参见权利要求22）；以及从周质和 /或上清液回收目标蛋白（参见权利要求23）。可见，权利要求24-26的技术特征均已被对比文件2公开。因此，当其引用的权利要求不具备创造性时，权利要求24-26也不具备创造性，不符合专利法第22条第3款的规定。
（三）对复审请求人意见陈述的评述
对于复审请求人的意见陈述，合议组认为：（1）对比文件2说明书第9页第17-20行明确记载了所述革兰阴性细胞菌株为大肠杆菌W3110，如W3110 K-12菌株；而且对比文件2实施例1-7使用的宿主菌为大肠杆菌W3110，可见，本发明的细菌宿主细胞已经被对比文件2公开，因此能够实现相同的功能，即具有完整的细胞膜，导致重组蛋白在周质空间中产生和维持，较少泄漏到上清液中。（2）一方面，比较对比文件3实施例9和10的试验数据可以发现，与FkpA共表达时的抗体效价要高于与DsbA或DsbC共表达时的抗体效价，即对比文件3正面教导了与FkpA共表达时的效果比共表达Dsb蛋白时更优。另一方面，本领域公知，分子伴侣Skp与FkpA均具有帮助在周质中集聚或降解的重组蛋白折叠的功能。由于对比文件3实施例9证实了将抗体与两种分子伴侣DsbA和DsbC在大肠杆菌中共表达时所获得的抗体滴度，明显高于仅表达DsbA或DsbC时的抗体滴度，即对比文件3教导了将两种功能相似的分子伴侣与外源重组蛋白在大肠杆菌中共表达能够协同增强目标蛋白的表达效果，基于这一教导，本领域技术人员在表达重组蛋白时，容易想到将Skp与FkpA共同引入对比文件2公开的宿主细胞以改善重组蛋白的表达。可见，在重组大肠杆菌中组合表达FkpA和Skp伴侣蛋白能够协同增强目标蛋白的表达这一技术效果是基于对比文件3能够合理预期的。综上所述，本申请的技术方案不具备创造性，复审请求人的意见陈述不具有说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下复审决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年12月26日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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