发明创造名称：一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统
外观设计名称：
决定号：180046
决定日：2019-05-31
委内编号：1F240623
优先权日：
申请（专利）号：201410558839.7
申请日：2014-10-20
复审请求人：上海亿康医学检验所有限公司 泰州亿康医学检验有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：王莉
合议组组长：邢维玲
参审员：王慧
国际分类号：C12N15/11，C12Q1/68
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410558839.7，名称为“一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统”的发明专利申请。本申请的申请人为上海亿康医学检验所有限公司、泰州亿康医学检验有限公司，申请日为2014年10月20日，公开日为2015年02月25日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年09月06日以权利要求第1-2不具备专利法第22条第3款有关创造性的规定为由发出驳回决定。驳回决定所依据的文本为申请日2014年10月20日提交的说明书摘要、说明书第1-3页、说明书附图第1页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1页；2017年03月31日提交的权利要求第1-3项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，该内参系统包含一对与细胞核重复核苷酸片段匹配的特异性引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2，探针序列如SEQ ID NO.:3。
2. 根据权利要求1所述的内参系统，其特征在于，引物或探针顺序为与上述序列具有较高同源度的序列，所述较高同源度是指上述序列的两端变换或加碱5-10个核苷酸碱基，或中间顺序碱基有5-10个被替代，或两者都有。
3. 一种特异性引物和探针的用途，其特征在于，用于制备单细胞扩增试剂盒，在所述试剂盒中，所述引物和探针作为人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，其中，所述引物序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2，所述探针序列如SEQ ID NO.:3。”
驳回决定指出:（1）权利要求1与对比文件1（“Reference loci for RT-qPCR analysis of differentiating human embryonic stem cells”，Liesbeth Vossaert 等， BMC Molecular Biology，第14卷，第21期，第1-7页，公开日为：2013年09月12日）的区别在于，还包括探针序列如SEQ ID No.3，以及限定用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参，用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。对此，首先，基于对比文件1公开的Alu特点，本领域技术人员容易想到Alu可以作为人生物系统例如单个细胞PCR扩增的内参，而具体地扩增基因组或线粒体DNA均不会影响其作为内参的效果；且用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控的技术效果是本领域技术人员基于现有技术对于内参基因的认识可以合理预期的。再者，对于探针序列，对比文件1公开了，当使用GAPDH作为内参时，同时使用了特异性扩增引物以及探针，且在RT-qPCR时设计探针序列便于后续检测以及增加反应信号的特异性，这也是本领域常规技术手段。因而，本领域技术人员在使用Alu作为内参基因时，容易想到设计探针序列，从而增加了反应信号的特异性。且根据现有技术中公开的Alu序列容易设计并筛选获得的。即在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，即该权利要求不具有创造性。权利要求2的附加技术特征是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合常规技术手段就能获得的。因而，权利要求2不具有创造性。（2）驳回决定的其他说明部分指出，权利要求3请求保护一种特异性引物和探针的用途，与对比文件1的区别在于，用于制备单细胞扩增试剂盒，在所述试剂盒中，所述引物和探针作为人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，其中，所述探针序列如SEQ ID NO. 3。对此，首先，基于对比文件1公开的Alu特点，本领域技术人员容易想到Alu可以作为人生物系统例如单个细胞PCR扩增的内参，而具体地扩增基因组或线粒体DNA均不会影响其作为内参的效果；且用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控的技术效果是本领域技术人员基于现有技术对于内参基因的认识可以合理预期的。再者，对于探针序列SEQ ID No.3，对比文件1公开了，当使用GAPDH作为内参时，同时使用了特异性扩增引物以及探针，且在RT-qPCR时设计探针序列便于后续检测以及增加反应信号的特异性，这也是本领域常规技术手段。因而，本领域技术人员在使用Alu作为内参基因时，容易想到设计探针序列，从而增加了反应信号的特异性。且根据现有技术中公开的Alu序列容易设计并筛选获得的。此外，将相应的功能组件用于相应试剂盒的制备也是本领域常规技术手段。即在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，即该权利要求不具有创造性。
申请人上海亿康医学检验所有限公司，泰州亿康医学检验有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2017年12月19日向国家知识产权局提出了复审请求，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）探针的选择非常关键，并补充表S1，结合表S1认为，本申请的探针灵敏度高，模板量低至5pg即可检测，而对比文件1在这个用量无法有效检测，有的探针在同样浓度无法检测，以及几条与本申请探针序列相似度高，前、后错动两三个碱基，其检测灵敏度急剧降低，本申请的探针具有如此高的灵敏度是难以预见的，本申请的检测灵敏度比对比文件1提高了5个数量级以上。（2）本申请不需要归一化处理，而是通过Alu重复序列的Ct绝对值即可判断是否是单细胞，并用于单细胞扩增的质控，从而具有预料不到的技术效果。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年01月10日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年11月29日向复审请求人发出复审通知书，指出：对于权利要求1中的用途限定，其实际的限定作用取决于对所要求保护的产品本身带来何种影响。然而该权利要求中的用途特征并未改变要求保护的产品的结构和组成，只是对该产品的用途或使用方式的描述，对要求保护的内参系统而言不具有实质的限定作用。权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别特征在于：权利要求1的内参系统还包括探针序列如SEQ ID No.3。然而，对比文件1公开了当使用PPIA和GAPDH作为内参时，同时使用了特异性扩增引物以及探针，可见，内参系统中，将引物和探针结合使用是本领域技术人员容易想到和做到的，且根据现有技术中公开的序列，如Alu序列，设计并筛选获得特异性探针序列也是本领域常规技术手段，其效果也是可预期的。且作为内参基因，其在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境的影响很小，其定量结果代表了样本中所含细胞或者基因组的数量（参考公知常识证据1：《检验与临床应用进展》，贺信祥等主编，河北科学技术出版社，2007年7月第1版，第421页）。可见，内参的定量结果可以用于判断细胞数量，例如是否是单细胞。并且，如前所述，对比文件1公开了Alu重复是人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增时最稳定的内参基因，在基因组中广泛分布和在细胞中稳定表达，因而，本领域技术人员容易想到将对比文件1中的Alu引物结合探针作用内参系统用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。因此，权利要求1不具有创造性。权利要求2的附加技术特征是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合常规技术手段就能获得的，其效果也是可预期的。因而，权利要求2不具有创造性。权利要求3请求保护一种特异性引物和探针的用途，与对比文件1的区别在于：权利要求3还限定了探针，并进一步限定，该引物和探针是用于制备单细胞扩增试剂盒，在所述试剂盒中，所述引物和探针作为人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，其中，所述探针序列如SEQ ID NO.3。参见对权利要求1的评述，为了便于后续检测以及增加反应信号的特异性，本领域技术人员在对比文件1的基础上，使用Alu作为内参基因时，容易想到将其特异性扩增引物和探针结合使用，且根据现有技术中公开的序列设计并筛选获得特异性探针序列也是本领域常规技术手段，其效果也是可预期的。根据本领域公知（参考公知常识证据1：第421页），内参的定量结果可以用于判断细胞数量，例如是否是单细胞。并且，对比文件1公开了Alu重复可用于人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增，且其是最稳定的内参基因，在基因组中广泛分布和在细胞中稳定表达，因而，本领域技术人员容易想到将对比文件1中的Alu引物结合探针作用内参系统用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。因此，权利要求3不具有创造性。
复审请求人于2019年01月14日提交了意见陈述书，未修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1中用作归一化的内参与本申请的不同，本申请只用Alu，而不需要与其他内参基因组合使用，就可以用于归一化，并得到非常准确的归一化结果，这是无法完全预见的。（2）对比文件1的归一化处理方式与本申请的归一化不同，本申请的技术实质是DNA检测，而并非对比文件1中的RNA检测。本申请中（总结结果如表S2），检测样本中的Mt拷贝数时，每个样本的检测都是独立的，可获得单一样本独立的绝对定量（准确度高），并且因使用了各细胞之间拷贝数恒定的Alu基因做了归一化处理，使样本绝对定量结果可在任意样本之间具有直接的可比性，工作量减少很多很多，解决了业界难题。并且检测结果的误差小：任意两个样本之间的比对只受到内参基因检测（Alu）、目标基因检测（Mt）、目标样本检测误差的影响，没有误差叠加。（3）探针的选择非常关键，虽然补充的探针数据在原始申请文件中没有记载，但是本申请提供的探针数据是为了克服本申请的创造性缺陷，因此，应该被予以考虑。本申请的探针灵敏度高，模板量低至5pg即可检测，而对比文件1在这个用量无法有效检测，有的探针在同样浓度无法检测，以及几条与本申请探针序列相似度高，前、后错动两三个碱基，其检测灵敏度急剧降低，本申请的探针具有如此高的灵敏度是难以预见的，本申请的检测灵敏度比对比文件1提高了5个数量级以上。（4）与对比文件1相比，权利要求1的技术方案具有出乎意料的优异技术效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人在复审阶段未修改申请文件。本复审决定针对的审查文本与驳回决定针对的审查文本相同，即：申请日2014年10月20日提交的说明书摘要、说明书第1-3页、说明书附图第1页、说明书核苷酸和氨基酸序列表第1页；2017年03月31日提交的权利要求第1-3项。
专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在判断创造性时，首先要将权利要求所要求保护的技术方案和最接近的现有技术进行对比，找出二者的区别技术特征，确定所述技术方案实际要解决的技术问题，进而考察现有技术中是否存在将该区别技术特征引入到最接近的现有技术中以解决上述技术问题的启示，如果现有技术中存在这样的启示，则该权利要求不具备创造性。
权利要求1请求保护“一种用于人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，该内参系统包含一对与细胞核重复核苷酸片段匹配的特异性引物和探针，其引物序列如SEQ ID NO.:1和SEQ ID NO.:2，探针序列如SEQ ID NO.:3。”对于权利要求中的用途限定，其实际的限定作用取决于对所要求保护的产品本身带来何种影响。然而该权利要求中的用途特征并未改变要求保护的产品的结构和组成，只是对该产品的用途或使用方式的描述，对要求保护的内参系统而言不具有实质的限定作用。
对比文件1公开了用于人胚胎干细胞RT-qPCR扩增的内参系统，并具体公开了，对人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增时，在12个候选参考文献中，发现Alu重复对于该实验是最稳定的一个标准化内参；Alu重复序列，其在基因组中广泛分布，包括在蛋白编码基因的3’UTR，目标细胞中的个体基因表达多样性并不会本质上影响总的Alu组件表达；该特点使得Alu重复序列成为生物系统例如分化干细胞RT-qPCR时一个有价值的标准化策略（参见对比文件1的摘要、第2页左栏第3-4段以及左右栏连接段以及第5页左栏第3段），且具体公开了：扩增Alu重复序列的引物对是CATGGTGAAACCCCGTCTCTA（对应于本申请SEQ ID No.1序列），GCCTCAGCCTCCCGAGTAG（对应于本申请SEQ ID No.2序列）（参见对比文件1的第6页左右栏连接段）。可见，权利要求1请求保护的技术方案与对比文件1的区别特征在于：权利要求1的内参系统还包括探针序列如SEQ ID No.3。基于上述区别技术特征可以确定，本申请实际要解决的技术问题是：增加已知内参基因反应信号的特异性。
然而，对比文件1公开了当使用PPIA和GAPDH作为内参时，同时使用了特异性扩增引物以及探针(参见对比文件1第6页左栏第3-5段)，可见，内参系统中，将引物和探针结合使用是本领域技术人员容易想到和做到的，且根据现有技术中公开的序列，如Alu序列，设计并筛选获得特异性探针序列也是本领域常规技术手段，其效果也是可预期的。且作为内参基因，其在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数是恒定的，受环境的影响很小，其定量结果代表了样本中所含细胞或者基因组的数量（参考公知常识证据1第421页）。可见，内参的定量结果可以用于判断细胞数量，例如是否是单细胞。并且，如前所述，对比文件1公开了Alu重复是人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增时最稳定的内参基因，在基因组中广泛分布和在细胞中稳定表达（参见对比文件1的摘要、第2页左栏第3-4段以及左右栏连接段以及第5页左栏第3段），因而，本领域技术人员容易想到将对比文件1中的Alu引物结合探针作用内参系统用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。因此，在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，且效果是可预期的，权利要求1不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求2引用权利要求1，其特征在于引物或探针顺序为与上述序列具有较高同源度的序列，所述较高同源度是指上述序列的两端变换或加减5-10个核苷酸碱基，或中间顺序碱基有5-10个被替代，或两者都有。然而，该特征是本领域技术人员在对比文件1的基础上结合常规技术手段就能获得的，其效果也是可预期的。因而，在引用的权利要求1不具有创造性的情况下，该权利要求也不符合专利法第22条第3款的规定。
权利要求3请求保护一种特异性引物和探针的用途，对比文件1公开了一种Alu 重复序列特异性引物的用途，并具体公开了，对人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增时，在12个候选参考文献中，发现Alu重复对于该实验是最稳定的一个标准化内参；Alu重复序列，其在基因组中广泛分布，包括在蛋白编码基因的3’UTR，目标细胞中的个体基因表达多样性并不会本质上影响总的Alu组件表达；该特点使得Alu重复序列成为生物系统例如分化干细胞RT-qPCR时一个有价值的标准化策略（参见对比文件1的摘要、第2页左栏第3-4段以及左右栏连接段以及第5页左栏第3段），且具体公开了：扩增Alu 重复序列的引物对是CATGGTGAAACCCCGTCTCTA（对应于本申请SEQ ID No.1序列），GCCTCAGCCTCCCGAGTAG（对应于本申请SEQ ID No.2序列）（参见对比文件1的第6页左右栏连接段）。可见，权利要求3请求保护的技术方案与对比文件1的区别在于：权利要求3还限定了探针，并进一步限定，该引物和探针是用于制备单细胞扩增试剂盒，在所述试剂盒中，所述引物和探针作为人单个细胞基因组或线粒体DNA PCR扩增的内参系统，用于检测单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控，其中，所述探针序列如SEQ ID NO.3。基于上述区别技术特征可以确定本申请实际要解决的技术问题是：将已知内参基因用于制备单细胞扩增试剂盒。
对此，参见对权利要求1的评述，为了便于后续检测以及增加反应信号的特异性，本领域技术人员在对比文件1的基础上，使用Alu作为内参基因时，容易想到将其特异性扩增引物和探针结合使用，且根据现有技术中公开的序列设计并筛选获得特异性探针序列也是本领域常规技术手段，其效果也是可预期的。根据本领域公知（参考公知常识证据1：第421页），内参的定量结果可以用于判断细胞数量，例如是否是单细胞。并且，对比文件1公开了Alu重复可用于人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增，且其是最稳定的内参基因，在基因组中广泛分布和在细胞中稳定表达（参见对比文件1的摘要、第2页左栏第3-4段以及左右栏连接段以及第5页左栏第3段），因而，本领域技术人员容易想到将对比文件1中的Alu引物结合探针作用内参系统用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。因此，在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，且效果是可预期的，权利要求3不具有突出的实质性特点和显著的进步，不符合专利法第22条第3款的规定。
关于复审请求人的陈述意见
合议组认为：（1）首先，复审请求人在提复审请求时提出本申请不需要归一化处理（具体参见复审请求意见陈述第2页（二））；而本次意见陈述指出本申请做了归一化处理，且用作归一化的内参、处理方式与本申请的归一化不同（具体参见本次意见陈述第（一）和（二））。本领域公知，归一化校正是消除由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等不可避免的偶然误差，以便不同样本之间的实验数据可以严格地相互比较（参见公知常识证据1：第420-421页）。正如提复审请求时的意见陈述所述，本申请通过Alu重复序列的Ct绝对值判断是否是单细胞（参见复审请求意见陈述第2页（二）、本申请说明书实施例1和2），没有进行上述归一化处理，也没有消除上述不可避免的偶然误差，无从得出本申请得到非常准确的归一化结果，准确度高的结论，更不能由此得出其具有创造性的结论。并且本申请文件中并没有记载检测样本中的Mt拷贝数的任何数据，因而也无从获得单一样本独立的绝对定量，更无从比较本申请所述的准确度。如前所述，对比文件1公开了Alu重复可用于人胚胎干细胞进行RT-qPCR扩增，且在基因组中广泛分布，目标细胞中的个体基因表达多样性并不会本质上影响总的Alu组件表达（参见对比文件1第2页左栏第3-4段以及左右栏连接段），且本领域公知，内参的定量结果可以用于判断细胞或者基因组的数量，因而使用Alu内参引物和探针可以判断单细胞是本领域技术人员在对比文件1和本领域公知的基础上可预期的。而在实时PCR中通过Ct值定量也是本领域的公知（如参考公知常识证据1：第42页）。因而，本领域技术人员容易想到将对比文件1中的Alu引物结合探针作用内参系统用于检测人单个细胞线粒体等基因的相对拷贝数，或用于单细胞扩增的质控。即在对比文件1的基础上结合本领域常规技术手段得到该权利要求请求保护的技术方案是显而易见的，且效果是可预期的。（2）TaqMan探针法是常用的实时荧光定量PCR技术，探针在引物特异性的基础上进一步提高定量PCR的专一性，从而提高了灵敏、特异性（参见公知常识证据2：《生物化学与分子生物学实验教程》，陆红玲主编，第四军医大学出版社，2010年6月第1版，第74页），因而，本申请使用探针类的TaqMan荧光定量PCR方法，将引物和探针结合使用，其灵敏度比对比文件1中单一使用引物的RT-qPCR方法高，这是本申请技术人员可预期的。对于后补交的证明本申请的探针具有难以预见的技术效果的S1表格中的数据，没有记载在原始申请文件中，不能成为确定本申请的技术方案具备预料不到技术效果的基础。（3）复审请求人通过本申请实施例2中的表2的Ct值均值来判断是否存在遗传物质丢失，然而由于各种环境因素的复杂相互作用，不同PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制，所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（参见公知常识证据1：第419页），可见，复审请求人的上述判断不能用来证明本申请取得了预料不到的技术效果。综上，复审请求人的意见陈述不具备说服力。
基于上述事实和理由，合议组作出如下决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年09月06日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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