发明创造名称：疫苗组合物及其制备方法和应用
外观设计名称：
决定号：180373
决定日：2019-05-29
委内编号：1F248811
优先权日：
申请（专利）号：201410520231.5
申请日：2014-09-30
复审请求人：普莱柯生物工程股份有限公司
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：周洋
合议组组长：李康琦
参审员：李洋
国际分类号：A61K39/02,A61K39/295,A61K39/108,A61P31/04,A61P11/00,A61P31/20
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术中没有给出将上述区别特征应用到所述最接近的现有技术中以解决其存在的技术问题的启示，并且该技术方案能够产生有益的技术效果，则该权利要求要求保护的技术方案具备突出的实质性特点和显著的进步，具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201410520231.5，名称为“疫苗组合物及其制备方法和应用”的发明专利申请。申请人为普莱柯生物工程股份有限公司。本申请的申请日为2014年09月30日，公开日为2015年02月04日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2018年01月08日发出驳回决定，以权利要求1-12不具备创造性为由，驳回了本发明专利申请。驳回决定所依据的文本为：申请日提交的说明书摘要、说明书第1-99段；以及2017年06月05日提交的权利要求第1-12项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法由下列步骤组成： (1)培养猪肺炎支原体，灭活，所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体； (2)使用非离子表面活性剂处理所述步骤(1)灭活的猪肺炎支原体；以及 (3)分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)猪肺炎支原体为猪肺炎支原体HN0613株。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％，非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Brij 58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Genapol、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)、吐温20(聚山梨醇20)、吐温80(聚山梨醇80)、Nonidet P40(又称为NP-40中文名乙基苯基聚乙二醇)、脱氧胆酸钠。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中所述非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.2％-1％，所述非离子表面活性剂为Triton-X114、Nonidet P40。
5. 一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求1～4任一项所述方法制备的抗原和佐剂。
6. 一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求1～4任一项所述方法制备的抗原、佐剂以及其他抗原；所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎病原体抗原、猪伪狂犬病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种。
7. 根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物还包含灭活的猪圆环病毒全病毒抗原，或猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原；所述制备的猪肺炎支原体抗原与灭活的猪圆环病毒全病毒抗原量为体积比80：10。
8. 根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂包括铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐剂系统、Block co-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5～30％。
9. 根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂为Gel佐剂。
10. 根据权利要求5～7任一项所述的疫苗组合物，其中，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为10％。
11. 根据权利要求5所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染导致的疾病的药物中的应用。
12. 根据权利要求6～7任一项所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染和猪圆环病毒感染导致的疾病的药物中的应用，其中，所述疫苗组合物含有猪肺炎支原体抗原和猪圆环病毒抗原。”
驳回决定认为：权利要求1请求保护一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，对比文件4（CN103182076 A, 公开日2013年07月03日）公开了一种猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，包括（1）培养猪肺炎支原体（CGMCC No.4545），将前述得到的菌液进行浓缩、纯化（弃上清），并进行灭活。其中所述灭活方式为：将浓缩、纯化后的抗原加入终浓度0.01％硫柳汞溶液，混匀后2～8℃放置12～24小时，期间振摇1～3次，然后在冰水浴上超声波裂解。（2）将灭活的支原体与佐剂按照一定比例混合，即配成疫苗。权利要求1与对比文件4的区别特征在于：权利要求1中所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体，使用非离子表面活性剂处理所述灭活的猪肺炎支原体，并限定分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分。因此权利要求1相对于对比文件4要解决的技术问题为提供一种优化的Mhp疫苗组合物。然而，对比文件2（CN 88101554A，公开日1988年11月02日）已经教导了使用非离子表面活性剂提取所述支原体膜中的可溶性抗原和非可溶性抗原部分，其中所述可溶性抗原成分为具有免疫抑制活性的抗原成分，而不可溶性抗原成分为不具有免疫抑制活性的抗原成分。另外，对比文件2还具体公开了通过反复冻融的方法破碎培养的Mhp细胞，然后通过离心的方式获得膜，再通过非离子表面活性剂（三硝基甲苯X-100磷酸盐缓冲液）溶解所述膜，去掉溶于所述非离子表面活性剂的成分，最后使用不溶于所述非离子表面活性剂的成分用于疫苗制备。可见，对比文件2教导了Mhp的膜中具有免疫抑制活性的抗原成分，并教导了去除所述抗原成分的方法。因此，在对比文件2的教导下，为了去除具有免疫抑制活性的抗原成分，本领域技术人员容易想到采用非离子表面活性剂处理菌液，然后去除所述非离子表面活性剂以去除Mhp中的具有免疫抑制活性的抗原成分，进而获得不含有免疫抑制成分的Mhp灭活疫苗。至于权利要求1中所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体，虽然对比文件4中的疫苗组合物是通过去除培养液，且经破碎的菌体获得的，但本领域使用甲醛灭活的猪肺炎支原体全菌制备疫苗是最常规的技术手段，且由于本领域熟知非离子表面活性剂去除免疫抑制成分是通过物理方式（溶解所述成分）去除的，因此本领域技术人员能够合理预期，即使不采用破碎步骤，本领域技术人员使用非离子表面活性剂直接处理Mhp也可以去除膜上一定量的免疫抑制成分，并可以合理预期取得改善的免疫效果。具体地，本领域知道，支原体的主要抗原特性存在于细胞膜，包括位于表面的膜抗原蛋白以及位于内膜活胞液中的膜抗原蛋白，而膜蛋白的提取最常使用非离子型表面活性剂，例如Triton X-100、Triton X-114等（参见《医学细胞生物学》，易静等主编，上海科学技术出版社，2013.09出版，第55页第五节），本领域还熟知，使用Triton-X100等非离子表面活性剂通过溶解膜磷脂层来增加细胞的通透性，细胞内多肽和蛋白质分子等抗原物质能透过膜，而核酸等其他大分子物质大部分仍留在细胞内，从而达到选择性释放的效果，且细胞仍相当完整，杂质少，碎片少，有利于抗原的后续分离（参见《食品安全检测于现代生物技术》，陈福生等主编，化学工业出版社，2004.08出版，第17页），以及大多数膜蛋白是和膜整合在一起的，可用表面活性剂把膜增溶/脱落下来，并在后续通过离心等方式去除表面活性剂的方法，非离子表面活性剂可以为Triton-100或NP-40或吐温（参见例如“猪肺炎支原体MY-99株膜蛋白SDS-PAGE分析及免疫原性研究”，畜牧兽医学报，2004.35（1），第74-78页； “对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28与对虾腮细胞膜蛋白的分离和结合活性分析”，解飞霞，中国优秀硕士学位论文全文数据库，2003.03.15，第13-15页；以及《高级寄生虫学》，李国清，谢明权主编，高等教育出版社，2007.05，第401页）。因此，由于表面活性剂对膜蛋白增溶作用的机理是基于膜蛋白结构上的共性而产生的，本领域技术人员能够从现有技术中获得启示，使用非离子表面活性剂直接处理支原体细胞。本领域技术人员也能够结合对比文件2给出的非离子表面活性剂处理支原体膜能够达到去除抑制成分的教导，合理预期对于直接对支原体细胞的处理也可以达到一定的去除抑制成分的效果。至于使用含有培养液的菌液制备疫苗，尤其是制备兽用疫苗也是惯用的技术手段。因此，权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。权利要求2引用权利要求1，而对比文件3（CN 103031258A，公开日2013年04月10日）公开了其附加技术特征即使用HN0613株制备猪肺炎支原体抗原并教导了其可用于疫苗制备，因此权利要求2不具备创造性。权利要求3-4进一步限定了非离子表面活性剂的类型和用量，所述附加技术特征被对比文件2所实质公开或者通过简单实验便可以调整实现，因此权利要求3-4也均不具备创造性。权利要求5请求保护一种疫苗组合物，根据前述方法制备相应的疫苗组合物是本领域常规技术手段，因此权利要求5不具备创造性。权利要求6请求保护一种疫苗组合物，根据前述方法制备相应的疫苗组合物是本领域常规技术手段，并且对比文件3还教导了一种疫苗组合物，其包含猪肺炎支原体HN0613猪抗原和猪圆环病毒2型抗原，因此权利要求6不具备创造性。权利要求7引用权利要求6，然而为了优化疫苗组合物的免疫效果，本领域技术人员有动机利用简单实验调整猪肺炎支原体抗原与灭活的猪圆环病毒全病毒抗原的量到合适的值，因此权利要求7不具备创造性。权利要求8-10分别限定了佐剂的类型和用量，所述附加技术特征被对比文件4所实质公开或者通过简单实验便可以调整实现，因此权利要求8-10也均不具备创造性。权利要求11请求保护制药用途，由于所述组合物制备预防和治疗猪肺炎支原体感染导致的疾病的药物是本领域常规技术手段，因此权利要求11不具备创造性。权利要求12请求保护制药用途，由于所述联用组合物制备预防和治疗猪肺炎支原体感染和猪圆环病毒感染导致的疾病的药物是本领域常规技术手段，因此权利要求12不具备创造性。
申请人普莱柯生物工程股份有限公司（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年04月12日向国家知识产权局提出了复审请求，同时修改了权利要求书（共2页，12项），将权利要求3中的技术特征“非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％”加入权利要求1中。复审请求时所作修改的权利要求1和3如下：
“1. 一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法由下列步骤组成： (1)培养猪肺炎支原体，灭活，所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体； (2)使用非离子表面活性剂处理所述步骤(1)灭活的猪肺炎支原体，非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％；以及 (3)分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中非离子表面活性剂包括烷基葡糖苷、Brij 35(C12E23聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Brij 58(C16E20聚氧乙烯二醇十二烷基醚)、Genapol、TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、Triton X-114(聚氧乙烯辛烷基苯酚醚)、吐温20(聚山梨醇20)、吐温80(聚山梨醇80)、Nonidet P40(又称为NP-40中文名乙基苯基聚乙二醇)、脱氧胆酸钠。”
复审请求人认为：（1）本发明实施例1中1.2-1.5中制备的抗原在灭活后不经破碎就使用非离子表面活性剂处理，制备方法简便，其制备的疫苗组合物无猪肺炎支原体免疫抑制成分，且具有优良的免疫效果，所述技术效果可以从疫苗B-E与疫苗G之间的比较可以看出。（2）本领域技术人员能从对比文件2中得到的是肺炎支原体膜上存在免疫抑制活性的抗原成分，他不能得知菌体培养物的上清液中是否存在免疫抑制活性成分，他更不能得知使用非离子表面活性剂处理会否对其中的活性成分产生何种影响。（3）使用非离子表面活性剂处理完整细胞脱落蛋白，其目的在于蛋白纯化过程中将蛋白从细胞膜上脱落下来（即从磷脂层上脱落下来）。完整的细胞具有自身的结构，其对于外界的破坏性作用是有一定的抵抗能力。对比文件2中在使用非离子表面活性剂处理细胞膜前，是使用了剧烈的细胞破碎方法进行细胞膜破碎的。而本领域公知，化学渗透法（如非离子表面活性剂处理）与机械破碎法相比，存在速度低、效率差、且选择性高的问题。而且使用的非离子表面活性剂加入量仅为终浓度占体系的体积比0.1%-2%，这么少的非离子表面活性剂用量不能发挥细胞膜破碎的功效，因此本发明所述非离子表面活性剂不可能作为细胞破碎之用，仅能作为去除细胞膜上的具有免疫抑制活性的抗原成分之用。（4）对比文件2中的使用非离子表面活性剂增溶去除细胞中具有免疫抑制活性膜蛋白的前提是，使用超声破碎的支原体膜进行处理，而非任何的细胞碎片均能有效去除其上的具有免疫抑制活性膜蛋白。进而，该上清液（培养液）是否能进一步增强制备疫苗的免疫原性，则不能从现有技术中简单推导。(5)疫苗G组代表了不含有菌体培养液的，对全菌进行破碎处理再使用非离子表面活性剂处理后的疫苗，尽管使用破碎处理提高了抑制蛋白去除的效率，然而其相对于疫苗A-E组的肺病变得分还是显著增大了，说明所述菌体培养液中存在的抗原成分有着相当的免疫效力，且该成分不受非离子表面活性剂处理的实质影响，对此，对比文件2、4没有给出技术启示。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年04月24日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：菌体培养过程中，分泌、破碎的物质脱落于培养基中是本领域所熟知的，将培养基成分一并制备疫苗是常规技术手段，尤其在兽用疫苗中，是普遍的做法。结合例如对比文件2等现有技术，预期培养基成分中包括有抗原性的，能够耐受非离子表面活性剂处理的物质是合乎情理的。因而，获得使用经过非离子表面活性剂处理的含有培养基和菌体的相关技术方案是显而易见的，并可以预期，相对于经过非离子表面活性剂处理的不含有培养基的菌体相关技术方案将会有更好的效果。根据说明书的记载，本申请相对于对比文件2、对比文件4而言，实质的贡献不是菌体是否破碎，而是不去除培养基。但如前所述，不去除培养基是常规技术手段，效果是基于现有技术可以合理预期的。因而，坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出复审请求审查决定。
二、决定的理由
1、审查文本的认定
复审请求人在提出复审请求时提交了权利要求书的全文替换页（共2页12项），其修改在于：删除原权利要求3中的技术特征“非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％”，并将其加入原权利要求1中形成新的权利要求1。经审查，该修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。因此，本复审决定所针对的审查文本如下：申请日2014年09月30日提交的说明书摘要、说明书第1-99段；以及2018年04月12日提交的权利要求第1-12项。
2、关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
如果权利要求要求保护的技术方案相对于最接近的现有技术相比存在区别特征，而现有技术中没有给出将上述区别特征应用到所述最接近的现有技术中以解决其存在的技术问题的启示，并且该技术方案能够产生有益的技术效果，则该权利要求要求保护的技术方案具备突出的实质性特点和显著的进步，具备创造性。
本案中，权利要求1请求保护“一种制备含猪肺炎支原体抗原的疫苗组合物的方法，其中，所述方法由下列步骤组成： (1)培养猪肺炎支原体，灭活，所述培养的猪肺炎支原体包括上清液和其中的菌体； (2)使用非离子表面活性剂处理所述步骤(1)灭活的猪肺炎支原体，非离子表面活性剂加入量为终浓度占体系的体积比0.1％-2％；以及 (3)分离出所述经使用非离子表面活性剂处理后的不可溶于非离子表面活性剂的抗原成分，加入佐剂”。
对比文件4公开了一种猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，包括：培养猪肺炎支原体菌液；将前述得到的菌液进行浓缩、纯化，并进行灭活；以及将灭活的支原体与佐剂按照一定比例混合，即配成疫苗等等（参见其权利要求9）；其中所述浓缩、纯化方式为：将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40℃保存（参见其说明书第26段、实施例1-3）。由此可见，对比文件4所述制备方法只包含菌体部分，而其并不包含菌体培养液部分（即菌体培养的上清液成分）。权利要求1与对比文件4的区别在于：（1）权利要求1限定了所述制备方法包括菌体和菌体培养液该两部分，（2）权利要求1限定了使用非离子表面活性剂进行处理。本申请说明书显示所制备的疫苗无猪肺炎支原体免疫抑制抗原、且对猪圆环病毒疫苗不产生拮抗作用（参见其说明书第[0006]段）。基于此，权利要求1相对于对比文件4实际解决的技术问题在于：制备无猪肺炎支原体免疫抑制抗原且对猪圆环病毒疫苗不产生拮抗作用的猪肺炎支原体疫苗。
对于上述区别特征，对比文件2公开了使用非离子表面活性剂提取所述支原体膜中的可溶性抗原和非可溶性抗原部分，其中所述可溶性抗原成分包含免疫抑制活性的抗原成分，而不可溶性抗原成分为不具有免疫抑制活性的抗原成分（参见其说明书第5页末段）。另外，对比文件2还具体公开了通过反复冻融的方法破碎培养的Mhp细胞，然后通过离心的方式获得膜，再通过非离子表面活性剂（三硝基甲苯X-100磷酸盐缓冲液）溶解所述膜，去掉溶于所述非离子表面活性剂的成分，最后使用不溶于所述非离子表面活性剂的成分用于疫苗制备（参见其实施例1-2）。由此可见，对比文件2公开了使用非离子表面活性剂对菌体膜进行处理，可以去除具有免疫抑制活性的抗原成分，但其制备方法并不包含对菌体培养液部分进行处理。
本申请说明书实施例3显示（参见下文表2），与仅包含菌体部分的疫苗G-H（即实验组7-8）相比，包含菌体和菌体培养液该两部分的疫苗B-F（即实验组2-6）的免疫效果显著较好。由此可见，在制备方法中包含菌体和菌体培养液该两部分，其中的菌体培养液部分能够显著增强免疫应答。因此，本领域技术人员不会从效果较差的对比文件2所述仅包含菌体部分的技术方案中（其相当于本申请的疫苗G）获得技术启示。同时，本申请说明书实施例5显示，在均未进行非离子表面活性剂处理的情形下，与仅包含菌体部分的疫苗8（对应于表2的实验组8）相比，仅包含菌体培养液部分的疫苗9（对应于表2的实验组9）中，存在对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分（参见其说明书第[0092]段表3）。由此可见，所述对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分仅存在于培养液部分、而通常并不存在于菌体部分，因此从对比文件2所公开的“使用非离子表面活性剂对菌体膜进行处理可以去除具有免疫抑制活性的抗原成分”的教导出发，本领域技术人员并不能合理预期“使用非离子表面活性剂对培养液进行处理也可以去除具有免疫抑制活性的抗原成分”，例如可以去除对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分。而且，本申请实施例5也证明了使用非离子表面活性剂对包含菌体培养液的疫苗2-6（对应于表2的实验组2-6）进行处理，可以消除所存在的对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分。因此综上，本领域技术人员将没有动机使用非离子表面活性剂对菌体培养液进行处理，也无法预期所述处理将能够达到去除对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分，同时取得显著增强的免疫应答相关技术效果。
表2 各试验组的肺病变得分和肺病变减少率
组号
免疫组分
肺炎病变平均得分
1
疫苗A （常规灭活菌液，其包含菌体部分和培养液部分）
3.2
2
疫苗B （常规灭活菌液，经Triton X114处理，取上清液）
2.4
3
疫苗C （常规灭活菌液，经NP-40处理（浓度0.5%），取上清液）
2.6
4
疫苗D （常规灭活菌液，经NP-40处理（浓度1.0%），取上清液）
1.6
5
疫苗E （常规灭活菌液，经NP-40处理（浓度0.2%），取上清液）
2.4
6
疫苗F （常规灭活菌液，经NP-40 高压均质机处理，取上清液）
0.6
7
疫苗G （仅取菌体部分，经超声破碎 Triton X114处理，再取上清液）
7.8
8
疫苗H （仅取菌体部分，经超声破碎 高压均质机处理）
11.8
9
疫苗I （仅取培养液部分，未经任何处理）
5.8
空白对照组
PBS MontanideTM Gel 01
15.6
驳回决定中还引用了多篇公知常识等证据，以表明：支原体的主要抗原特性存在于细胞膜，包括位于表面的膜抗原蛋白以及位于内膜活胞液中的膜抗原蛋白，而膜蛋白的提取最常使用非离子型表面活性剂，例如Triton X-100、Triton X-114等（参见证据1：《医学细胞生物学》，易静等主编，上海科学技术出版社，2013.09出版，第55页第五节）；使用Triton-X100等非离子表面活性剂通过溶解膜磷脂层来增加细胞的通透性，细胞内多肽和蛋白质分子等抗原物质能透过膜，而核酸等其他大分子物质大部分仍留在细胞内，从而达到选择性释放的效果，且细胞仍相当完整，杂质少，碎片少，有利于抗原的后续分离（参见证据2：《食品安全检测于现代生物技术》，陈福生等主编，化学工业出版社，2004.08出版，第17页）；以及大多数膜蛋白是和膜整合在一起的，可用表面活性剂把膜增溶/脱落下来，并在后续通过离心等方式去除表面活性剂的方法，非离子表面活性剂可以为Triton-X100或NP-40或吐温（参见证据3：“猪肺炎支原体MY-99株膜蛋白SDS-PAGE分析及免疫原性研究”，畜牧兽医学报，2004.35（1），第74-78页；证据4：“对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28与对虾腮细胞膜蛋白的分离和结合活性分析”，解飞霞，中国优秀硕士学位论文全文数据库，2003.03.15，第13-15页；以及证据5：《高级寄生虫学》，李国清，谢明权主编，高等教育出版社，2007.05，第401页）。对比文件3公开了使用HN0613株制备猪肺炎支原体抗原，并教导了其可用于疫苗制备（参见其权利要求2、6）。然而，上述证据和对比文件3均没有教导使用非离子表面活性剂对菌体培养液进行处理。而根据本申请说明书的记载，权利要求1的技术方案使用非离子表面活性剂对菌体培养液进行处理，能够去除所述对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分，同时保留该菌体培养液部分还能够达到获得显著增强的免疫应答的技术效果。
因此综上，对比文件4本身，以及对比文件2、对比文件3和/或其他公知常识均没有给出将区别特征用于最接近的现有技术，并解决上述技术问题的相关技术启示。也就是说，权利要求1请求保护的技术方案，相对于对比文件4、对比文件2、对比文件3以及公知常识的结合是非显而易见的，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2限定了猪肺炎支原体HN0613株，从属权利要求3-4限定了所述非离子表面活性剂的类型和/或用量。在权利要求1具备创造性的基础上，权利要求2-4均具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求5请求保护“一种疫苗组合物，其中所述疫苗组合物包含免疫量的根据权利要求1-4任一项所述方法制备的抗原和佐剂”。对比文件4公开了一种猪支原体肺炎灭活疫苗，其特征在于菌种为猪肺炎支原体 DJ-166株，菌种的保藏号为CGMCC No.4545，上述菌种经灭活后作为水相，佐剂作为油相，水相与油相按配比乳化而成（参见其权利要求1）；其中具体公开了所述猪支原体肺炎灭活疫苗的制备方法，包括：培养猪肺炎支原体菌液；将前述得到的菌液进行浓缩、纯化，并进行灭活；以及将灭活的支原体与佐剂按照一定比例混合，即配成疫苗等等（参见其权利要求9）；其中所述浓缩、纯化方式具体为：将菌液以10000r/min离心30分钟，弃掉上清液，沉淀菌体用PBS(pH7.2～7.4)缓冲液悬浮，配制成为原培养物体积1/100菌悬液，-40℃保存（参见其说明书第26段、实施例1-3）。由此可见，对比文件4所公开的灭活疫苗通常只包含菌体部分，而并不包含菌体培养液部分（即菌体培养的上清液成分）。权利要求5与对比文件4的区别在于：权利要求5所述疫苗组合物明确包括菌体和菌体培养液该两部分，并且使用非离子表面活性剂去除了所述菌体和菌体培养液中的免疫抑制成分和猪圆环病毒疫苗干扰成分。本申请说明书显示所制备的疫苗组合物无猪肺炎支原体免疫抑制抗原、且对猪圆环病毒疫苗不产生拮抗作用（参见其说明书第[0006]段）。基于此，权利要求5相对于对比文件4实际解决的技术问题在于：其提供了一种无猪肺炎支原体免疫抑制抗原且对猪圆环病毒疫苗不产生拮抗作用的结构和组成有所不同的猪肺炎支原体疫苗。
对于上述区别特征，对比文件2公开了一种预防支原体肺炎的疫苗，包含：至少一种成份选自缺乏免疫抑制活性的猪肺炎支原体抗原、该抗原的片段和其混合物，所述的疫苗包括所述成分之用量能有效地预防支原体肺炎，所述的疫苗基本上不含具有免疫抑制活性的猪肺炎支原体抗原和其片段（参见其权利要求1）；其中具体公开了使用非离子表面活性剂提取所述支原体膜中的可溶性抗原和非可溶性抗原部分，其中所述可溶性抗原成分包含免疫抑制活性的抗原成分，而不可溶性抗原成分为不具有免疫抑制活性的抗原成分（参见其说明书第5页末段）；以及所述制备方法具体为：通过反复冻融的方法破碎培养的Mhp细胞，然后通过离心的方式获得膜，再通过非离子表面活性剂（三硝基甲苯X-100磷酸盐缓冲液）溶解所述膜，去掉溶于所述非离子表面活性剂的成分，最后使用不溶于所述非离子表面活性剂的成分用于疫苗制备（参见其实施例1-2）。由此可见，对比文件2公开了使用非离子表面活性剂对菌体膜进行处理可以去除具有免疫抑制活性的抗原成分，但是其公开的猪肺炎支原体疫苗中通常并不包含菌体培养液成分。如上所述，本申请说明书实施例3显示，与仅包含菌体部分的疫苗G-H（即实验组7-8）相比，包含菌体和菌体培养液该两部分的疫苗B-F（即实验组2-6）的免疫效果显著较好。由此可见，所述猪肺炎支原体疫苗包含菌体和菌体培养液该两部分，其中的菌体培养液部分能够显著增强免疫应答。因此，本领域技术人员不会从效果较差的对比文件2所述仅包含菌体部分的技术方案中（其相当于本申请的疫苗G）获得技术启示。同时，本申请说明书实施例5显示，所述猪肺炎支原体疫苗的培养液部分而非菌体部分，其存在对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分。因此，为了增强免疫应答，本领域技术人员通常不会预期从对比文件2的疫苗中进一步选择包含培养液部分，而且本领域技术人员从对比文件2也不会预期经过非离子表面活性剂处理，可以去除对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分。
驳回决定中还引用了多篇公知常识等证据，以表明：支原体的主要抗原特性存在于细胞膜，包括位于表面的膜抗原蛋白以及位于内膜活胞液中的膜抗原蛋白，而膜蛋白的提取最常使用非离子型表面活性剂，例如Triton X-100、Triton X-114等（参见证据1：《医学细胞生物学》，易静等主编，上海科学技术出版社，2013.09出版，第55页第五节）；使用Triton-X100等非离子表面活性剂通过溶解膜磷脂层来增加细胞的通透性，细胞内多肽和蛋白质分子等抗原物质能透过膜，而核酸等其他大分子物质大部分仍留在细胞内，从而达到选择性释放的效果，且细胞仍相当完整，杂质少，碎片少，有利于抗原的后续分离（参见证据2：《食品安全检测于现代生物技术》，陈福生等主编，化学工业出版社，2004.08出版，第17页）；以及大多数膜蛋白是和膜整合在一起的，可用表面活性剂把膜增溶/脱落下来，并在后续通过离心等方式去除表面活性剂的方法，非离子表面活性剂可以为Triton-X100或NP-40或吐温（参见证据3：“猪肺炎支原体MY-99株膜蛋白SDS-PAGE分析及免疫原性研究”，畜牧兽医学报，2004.35（1），第74-78页；证据4：“对虾白斑综合症病毒（WSSV）囊膜蛋白VP28与对虾腮细胞膜蛋白的分离和结合活性分析”，解飞霞，中国优秀硕士学位论文全文数据库，2003.03.15，第13-15页；以及证据5：《高级寄生虫学》，李国清，谢明权主编，高等教育出版社，2007.05，第401页）。对比文件3公开了使用HN0613株制备猪肺炎支原体抗原，并教导了其可用于疫苗制备（参见其权利要求2、6）。然而，上述证据和对比文件3均没有教导使用非离子表面活性剂对菌体培养液进行处理所获得的疫苗，能够去除所述对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分，同时保留该菌体培养液部分还能够达到显著增强的免疫应答的技术效果。
因此综上，对比文件4本身，以及对比文件2、对比文件3和/或其他公知常识均没有给出将区别特征用于最接近的现有技术，并解决上述技术问题的相关技术启示。也就是说，权利要求5请求保护的技术方案，相对于对比文件4、对比文件2、对比文件3以及公知常识的结合是非显而易见的，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求6-10请求保护涉及权利要求1-4所述方法制备抗原、佐剂以及其他抗原的疫苗组合物；权利要求11请求保护涉及权利要求5所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染导致的疾病的药物中的应用；权利要求12请求保护涉及权利要求6-7所述疫苗组合物在制备预防和治疗猪肺炎支原体感染和猪圆环病毒感染导致的疾病的药物中的应用。权利要求6-12均直接或间接涉及权利要求5所述的疫苗组合物，因此，在权利要求5所述疫苗组合物具备创造性的基础上，权利要求6-12所述疫苗组合物及其相关制备药物用途也均具备专利法第22条第3款规定的创造性。
驳回决定和前置审查意见中认为：菌体培养过程中，分泌、破碎的物质脱落于培养基中是本领域所熟知的，将培养基成分一并制备疫苗是常规技术手段，尤其在兽用疫苗中，是普遍的做法。结合例如对比文件2等现有技术，预期培养基成分中包括有抗原性的，能够耐受非离子表面活性剂处理的物质是合乎情理的。因而，获得使用经过非离子表面活性剂处理的含有培养基和菌体的相关技术方案是显而易见的，并可以预期，相对于经过非离子表面活性剂处理的不含有培养基的菌体相关技术方案将会有更好的效果。
对此，合议组认为：公知常识证据1（参见第55页第五节）显示，支原体的主要抗原特性存在于细胞膜，包括位于表面的膜抗原蛋白以及位于内膜活胞液中的膜抗原蛋白，因此没有充分的理由认为，保留菌体培养液（即培养基成分）将会显著地增强免疫应答。同时，本申请说明书明确显示所述菌体培养液（即培养基成分）含有对猪圆环病毒疫苗效力的干扰成分，而所述干扰成分与所述菌体膜蛋白免疫抑制成分并非是相同物质，并且使用非离子表面活性剂对菌体培养液进行处理能够去除所述干扰成分，然而上述对比文件和公知常识中均没有给出该技术启示。因此，驳回决定和前置审查意见中认为本申请不具备创造性的理由不能成立。
基于上述事实和理由，本案合议组作出如下复审请求审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年01月08日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本复审决定所针对审查文本的基础上对本发明专利申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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