发明创造名称：一种尿液中D-泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法
外观设计名称：
决定号：180367
决定日：2019-05-28
委内编号：1F261515
优先权日：
申请（专利）号：201610702547.5
申请日：2016-08-23
复审请求人：国家烟草质量监督检验中心 中国科学院合肥物质科学研究院
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：陈永晖
合议组组长：李明瑞
参审员：孙春梅
国际分类号：G01N30/88、G01N30/02
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
全文：
本复审请求涉及申请号为201610702547.5，名称为“一种尿液中D-泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为国家烟草质量监督检验中心和中国科学院合肥物质科学研究院。本申请的申请日为2016年08月23日，公开日为2017年02月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门审查员于2018年06月28日发出驳回决定，驳回了本申请，其理由是：权利要求1不符合专利法第22条第3款的规定。驳回决定中引用如下1篇对比文件：
对比文件1：“A urinary metabonomics analysis of long-term effect of acetochlor exposure on rats by ultra-performance liquid chromatography/mass spectrometry”，Longxue Li 等，《Pesticide Biochemistry and Physiology》，第128卷，第82-88页，公开日为2015年09月28日。
驳回决定所依据的文本为申请日2016年08月23日提交的说明书第1-21段、说明书附图1、说明书摘要、摘要附图；2018年03月07日提交的权利要求第1项。
驳回决定所针对的权利要求书如下：
1.一种尿液中D-泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法，其特征在于：包括以下步骤：a、尿液在室温下解冻，离心以后，然后移取100μL尿液于10mL的容量瓶中；b、用0.1%的甲酸水溶液定容，混合均匀，然后移取约 1mL放入1.8mL的色谱瓶中，待液相色谱串联质谱进行分析；c、标准工作液配制：用0.1%的甲酸水溶液配制不同浓度的D-泛酸标准工作溶液,浓度分别为3.6、6、30、60、120、240和360ng/mL；d、液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）测定，吸取上述配制好的不同浓度的标准工作溶液，注入LC-MS/MS系统，D-泛酸的线性方程为y=3.84e3x 7.71e3，其中Y代表分析物的峰面积，X表示样品中目标分析物的浓度，相关系数r大于0.9993，对样品待测液进行测定，测得分析物的峰面积，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；液相色谱条件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，规格100mm×2.1mm，1.8μm，流动相：溶剂A：0.1%甲酸水溶液，溶剂B：0.1%甲酸乙腈溶液，流动相流速为200μL/min，梯度洗脱条件：0-1min，5%B-5%B；1-5min，5%B-100%B；5-6min，100%B；6-6.3min，100%B-5%B；6.3-8min，5%B；分析时间为8min，进样量为5μL；串联质谱检测器条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：5500V, 雾化气：30psi, 气帘气：40psi, 辅助加热气：30psi，射入电压：10V，驻留时间：100ms；D-泛酸所选择的定量离子对分别为220.3→90.1和220.3→184.3。
驳回决定认为：权利要求1请求保护的技术方案对比文件1公开的技术内容相比，区别技术特征在于：①测定D-泛酸的含量，采用外标标准曲线法进行定量；②样品溶液制备步骤略有不同；③色谱、质谱条件部分不同。本申请实际所要解决的技术问题为：如何定量测定尿液中的D-泛酸含量。，而上述区别技术特征或在对比文件1的基础上能够想到，或属于本领域的常用技术手段，由此可知，在对比文件1的基础上结合本领域的公知常识得到权利要求1所要求保护的技术方案，对本领域的技术人员来说是显而易见的，因此，该权利要求不具有突出的实质性特点和显著的进步，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
申请人（下称复审请求人）对上述驳回决定不服，于2018年09月25日向国家知识产权局提出了复审请求，没有修改申请文件。复审请求人认为：（1）对比文件1目的是寻找尿液中差异代谢物，并不涉及本申请的尿液中D-泛酸含量测定；（2）对比文件1只是选择质量数218.1044的离子在HDMB数据库检索，定性为泛酸，实际上该离子在HDMB数据库可能是Cis-zeatin（反式-玉米素）或泛酸两种物质，而本申请通过泛酸标准品的分子离子峰、二级碎片及二级碎片比例与样品中一致才能确定泛酸；（3）本申请针对泛酸的准确二级（串联）质谱定量分析，可降低噪音，提高信噪比，从而提高灵敏度，节省前处理步骤。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年10月19日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中认为：
（1）①对比文件1中图3，图S2示出了主要代谢物（包括泛酸）在不同碰撞能量下的质量碎片，实质上也采用UPLC-MS/MS分析方法；②对比文件1第87页左栏第3段中公开：基于准确质量、同位素模式、MS / MS信息以及与代谢物的结构信息比较在尿液中鉴定了9个生物标记物（3个来自正模式、6个来自负模式）以及乙草胺暴露标记物（参见表3，图5和S2），且图S2还示出了泛酸的质量碎片（即二级碎片），因此对比文件1并不是仅凭HMDB数据库的搜索结果确认泛酸，也考虑二级碎片、同位素模式、结构信息；③Cis-zeatin为一种植物激素，不是尿液样品中的代谢物。（2）虽然对比文件1中没有对泛酸进行定量检测，但根据表S2可以看出，其通过计算泛酸强度的变化判断了尿液样品中泛酸含量的变化，因而本领域技术人员为了更加准确了解尿液中泛酸含量及其变化，很容易想到采用本领域常规的外标标准曲线法定量检测。（3）本领域技术人员公知：采用二级质谱获得目标物的特征离子碎片进行定量，相较于以目标物的分子离子进行定量的方法，具有降低基质干扰，提高定量准确度和灵敏度的优点。因而坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局依法成立合议组对本案进行审理。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
（一）关于审查文本
在复审程序中，复审请求人未对申请文件进行修改。因此，本复审决定针对的审查文本为驳回决定所依据的文本，也就是复审请求人于申请日2016年08月23日提交的说明书第1-21段、说明书附图1、说明书摘要、摘要附图；2018年03月07日提交的权利要求第1项为审查基础。
（二）关于专利法第22条第3款
专利法第22条第3款规定：创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步，该实用新型有实质性特点和进步。
如果权利要求与最接近的现有技术之间存在区别技术特征，该区别技术特征未被其他现有技术公开，并且没有证据证明该区别技术特征是本技术领域的公知常识，则该权利要求相对于上述现有技术具备创造性。
具体到本案，
1、权利要求1请求保护一种尿液中D-泛酸含量的液相色谱串联质谱测定方法，对比文件1公开了一种尿液中泛酸（即D-泛酸）等多种代谢物的检测方法（参见对比文件1摘要，第2.3,2.4，2.5，3.4节，表3，辅助数据）：采用UPLC-MS/MS检测收集的两个时间点的大鼠尿液样品用于测量其代谢谱图，尿液中的马尿酸，柠檬酸，泛酸，尿嘧啶、β-丙氨酸，壬二酸，L-酪氨酸，D-葡糖醛酸以及2-乙基-6甲基-N-甲基-2-氯乙酰基苯胺的显著变化（降低）被观察到。样品收集与制备：尿液样品在10000rpm下离心10min，收集上清液，并储存于-80℃。分析前，尿液样品室温下解冻，用水按照1:1进行稀释，涡旋混匀1min，接着12000rpm离心10min，上清液转移至自动进样瓶中用于尿液代谢物分析。色谱条件：Waters ACQUITY UPLC系统用于色谱分离，配有一个UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm,i.d.1.8μm)，流动相为：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）。梯度洗脱程序见表S1，流动相流速为0.35ml/min，柱温35℃。质谱条件：采用Waters Micromass Q-TOF质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式（泛酸为负离子模式），全扫面模式，扫描范围50到1000，脱溶剂气氮气速率为650 l/h，脱溶剂气温度300℃，锥孔气速率为50 l/h，离子源温度为100℃，毛细管电压正离子模式下为3.0KV，负离子模式下为2.8KV，锥孔电压为35V。
由上可见，对比文件1公开了一种尿液中泛酸等多种代谢物的检测方法：采用UPLC-MS/MS检测收集的两个时间点的大鼠尿液样品，用于测量其代谢谱图，尿液中泛酸等离子强度降低被观察到；（1）样品收集与制备：尿液样品在10000rpm下离心10min，收集上清液，并储存于-80℃；分析前，尿液样品室温下解冻，用水按照1:1进行稀释，涡旋混匀1min，接着12000rpm离心10min，上清液转移至自动进样瓶中用于尿液代谢物分析；（2）色谱条件：采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱，规格100mm×2.1mm×1.8μm，流动相为：0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）、梯度洗脱程序见上表S1，流动相流速为0.35ml/min，柱温35℃；质谱条件：采用Waters Micromass Q-TOF质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI），正、负离子模式，全扫面模式，扫描范围50到1000，脱溶剂气氮气速率为650 l/h，脱溶剂气温度300℃，锥孔气速率为50 l/h，离子源温度为100℃，毛细管电压正离子模式下为3.0KV，负离子模式下为2.8KV，锥孔电压为35V。
由上可见，权利要求1请求保护的技术方案对比文件1公开的技术内容相比，区别技术特征在于：（1）供试品溶液的稀释溶剂和稀释比例不同，权利要求1用0.1%甲酸稀释100倍而对比文件1用水稀释2倍；（2）定量检测的液相色谱条件：流动相：溶剂A：0.1%甲酸水溶液，溶剂B：0.1%甲酸乙腈溶液，流动相流速为200μL/min，梯度洗脱条件：0-1min，5%B-5%B；1-5min，5%B-100%B；5-6min，100%B；6-6.3min，100%B-5%B；6.3-8min，5%B；分析时间为8min，进样量为5μL；串联质谱检测器条件：电喷雾离子源，多反应监测正离子扫描方式；电喷雾电压：5500V, 雾化气：30psi, 气帘气：40psi, 辅助加热气：30psi，射入电压：10V，驻留时间：100ms；D-泛酸所选择的定量离子对分别为220.3→90.1和220.3→184.3；（3）标准工作液配制及含量计算方式。权利要求1技术方案实际解决的技术问题为：如何定量测定尿液中的D-泛酸含量。
合议组认为：
对于区别技术特征（1），由于泛酸易溶于水，因而本领域技术人员很容易想到采用各种水性溶剂对尿液进行稀释；至于稀释倍数，本领域技术人员很容易根据泛酸在尿液样品中浓度通过简单选择性试验确定，不需要付出创造性劳动。
对于区别技术特征（2），①对比文件1中UPLC-MS/MS法的目的是寻找尿液中的差异代谢物，定性检测尿液中的泛酸，其中仅是观察到泛酸离子强度的降低，但没有进行定量的检测，而本申请权利要求1的技术方案是通过UPLC-MS/MS法测定尿液中的D-泛酸含量，需要确定D-泛酸含量，检测方法中“定量离子对分别为220.3→90.1和220.3→184.3”，并通过上述液相色谱条件和质谱条件最大限度提高含量检测方法的灵敏度、回收率和重现性；②对比文件1没有给出包含区别技术特征（2）中UPLC-MS/MS条件的测定方法来定量检测尿液中泛酸的技术启示，并且方法取得了“尿液中泛酸的检出限为0.46ng/mL、定量限为1.54ng/ml，回收率为87.9-95.3%，RSD＜13.0%”的技术效果（参见本申请说明书第11段和第13段）；③本领域技术人员也无法预期选择上述UPLC-MS/MS条件等对测定结果的影响，因而上述区别技术特征（2）并不是本领域的常规选择，目前也没有证据表明上述区别技术特征属于本领域的公知常识。
对于区别技术特征（3），标准工作液配制及含量计算方式属于本领域的常规选择，不需要本领域技术人员付出创造性劳动。
综上，本领域技术人员在对比文件1的基础上结合本领域公知常识无法得出权利要求1的技术方案，权利要求1相对于对比文件1和公知常识具有突出的实质性特点和显著的进步，具备专利法第22条第3款规定的创造性。
2、对于前置意见，合议组认为：（1）虽然对比文件1中观察到其中泛酸离子强度的降低，据此判断尿液中泛酸含量降低，但并没有采用对照品检测其中泛酸含量，更无法预料定量检测的技术效果，而权利要求1中方法取得了“尿液中泛酸的检出限为0.46ng/mL、定量限为1.54ng/ml，回收率为87.9-95.3%，RSD＜13.0%”的技术效果。（2）虽然采用二级质谱获得目标物的特征离子碎片进行定量，相较于以目标物的分子离子进行定量，通常“具有降低基质干扰，提高定量准确度和灵敏度”的优点，但检测方法本身属于一个相互关联的整体方案，方法准确度和灵敏度与分析仪器和各项检测条件都息息相关；具体到本申请，现有技术中采用LC-MS法检测尿液中D-泛酸含量（Heudi等），尿液经过简单的离心、稀释后进行检测分析，方法的检出限为100ng/mL（参见本申请说明书第3段），权利要求1技术方案采用UPLC-MS/MS的特定色谱条件与质谱条件实施，才能提高定量方法的灵敏度（检出限为0.46ng/mL、定量限为1.54ng/ml）和准确度（回收率为87.9-95.3%，RSD＜13.0%），并非只要使用UPLC-MS/MS分析仪器，检测方法就一定能取得上述技术效果。
根据上述事实和理由，依法作出以下审查决定。
三、决定
撤销国家知识产权局于2018年06月28日对本申请作出的驳回决定。由国家知识产权局原审查部门在本决定所针对的文本的基础上对本申请继续进行审查。
如对本复审请求审查决定不服,根据专利法第41条第2款的规定,请求人自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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