发明创造名称：RHG1介导的对大豆胞囊线虫的抗性
外观设计名称：
决定号：181502
决定日：2019-05-13
委内编号：1F243731
优先权日：
申请（专利）号：201380037226.2
申请日：2013-05-13
复审请求人：威斯康星校友研究基金会 伊利诺斯州大学管理委员会
无效请求人：
授权公告日：
审定公告日：
专利权人：
主审员：邢维玲
合议组组长：魏聪
参审员：王莉
国际分类号：C12N15/82
外观设计分类号：
法律依据：专利法第22条第3款
决定要点
：在创造性的判断中，判断发明是否具有突出的实质性特点，就是要判断对于本领域的技术人员来说，要求保护的发明相对于现有技术是否显而易见。如果要求保护的发明相对于现有技术是显而易见的，则不具有突出的实质性特点。
全文：
本复审请求涉及申请号为201380037226.2，名称为“RHG1介导的对大豆胞囊线虫的抗性”的发明专利申请（下称本申请）。申请人为威斯康星校友研究基金会、伊利诺斯州大学管理委员会。本申请的申请日为2013年05月13日，最早优先权日为2012年05月11日，公开日为2015年07月08日。
经实质审查，国家知识产权局原审查部门于2017年11月06日以权利要求1-47不具备专利法第22条第3款规定的创造性为由驳回了本申请。驳回决定所依据的文本为2015年01月12日提交的说明书附图第1-21页、说明书摘要、摘要附图以及说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-36页，2015年02月02日提交的说明书第1-38页（第1-154段），2017年06月29日提交的权利要求第1-47项。驳回决定所针对的权利要求书如下：
“1. 一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括增加至少两个多核苷酸的表达、改变至少两个多核苷酸的表达模式或增加至少两个多核苷酸的拷贝数，所述至少两个多核苷酸在植物的细胞中编码Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽或Glyma18g02610多肽；与SEQ ID NO:1(2580)、SEQ ID NO:2(2590)、SEQ ID NO:3(2610)、SEQ ID NO:5(2590-88788)、SEQ ID NO:6(2590-Peking)具有90％或更高同一性的多肽中的至少两个；或任何前述多肽的至少两个的同源物、功能变体或其组合，其中在所述植物的细胞中增加的多核苷酸表达增加了所述植物对线虫的抗性。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述表达通过植物的遗传转化来增加。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述植物选自大豆、糖甜菜、土豆、玉米、豌豆和菜豆。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述植物根的细胞中增加所述表达。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过增加固有多核苷酸的表达来增加所述多肽的表达。
6. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过将一个或多个构建体引入所述植物的细胞中来增加所述多肽的表达，所述一个或多个构建体包含与编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。
7. 根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中通过将一个或多个转基因并入所述植物中来增加所述多肽的表达，所述一个或多个转基因包含与编码所述多肽的一个或多个多核苷酸可操作地连接的启动子。
8. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中将所述拷贝引入植物的Rhg1基因座。
9. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少三个拷贝被引入到所述植物中。
10. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸的至少十个拷 贝被引入到所述植物中。
11. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中Glyma18g02580多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02610多肽的表达增加。
12. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，进一步包括增加多核苷酸的表达，或改变多核苷酸的表达模式，所述多核苷酸编码Glyma18g02600多肽或与SEQ ID NO:4(02600)具有90％或更高同一性的多肽。
13. 根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述植物与对照植物相比具有对胞囊线虫、或大豆胞囊线虫(SCN)增加的抗性。
14. 根据权利要求13所述的方法，其中通过植物来测量增加的抗性，所述植物与在类似生长环境中生长的对照植物相比具有更低百分比的发育超过J2阶段的侵入线虫、在根上更低速率的胞囊形成、暴露于线虫的植物减少的线虫雌性指数、胞囊内减少的SCN卵产生、每个植物减少的整体SCN卵产生、以每个植物为基础或每生长面积为基础的大豆种子的更高产量。
15. 根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中暴露于线虫后所述植物的线虫雌性指数低于对照植物的线虫雌性指数。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中在表5中提供的源自PI88788-、PI437654-、或Peking-衍生来源的序列用于取代Williams 82序列。
17. 一种构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。
18. 根据权利要求17所述的构建体，其中所述启动子是植物启动子。
19. 根据权利要求17或18所述的构建体，其中所述多核苷酸编码所述多肽中的全部三个。
20. 根据权利要求17或18所述的构建体，其中所述多核苷酸编码所述多肽中的至少两个。
21. 根据权利要求17至20中任一项所述的构建体，其中所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。
22. 一种生产对线虫具有增加抗性的转基因植物的方法，所述方法包括将外源多核苷酸引入到大豆植物细胞或其后代，所述外源多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽、或者与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽、或其同源物、功能变体或组合中的至少两个，从而在所述大豆植物的根细胞中增加所述多肽的表达，以及从而所述植物与对照植物相比对线虫具有增加的抗性。
23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述多核苷酸至少编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02580多肽。
24. 根据权利要求22-23中任一项所述的方法，其中多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。
25. 根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少三个拷贝存在。
26. 根据权利要求22-24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸在所述植物中以至少十个拷贝存在。
27. 根据权利要求22-25中任一项所述的方法，其中所述植物选自大豆、糖甜菜、土豆、玉米、豌豆和菜豆。
28. 一种筛选对线虫抗性或易感性的第一植物细胞的方法，所述方法包括：
在第一植物细胞中检测遗传标志物或可选择的标志物，所述遗传标志物或可选择的标志物与胞囊线虫抗性或对胞囊线虫的易感性相关；
预测第一植物细胞对线虫的抗性或易感性。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580中至少一个的启动子、上游区或基因体的甲基化状态。
30. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、 Glyma18g02590、Glyma18g02580、或Glyma18g02600中至少一个的RNA转录本、转录或蛋白表达水平。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述水平在根细胞中测量。
32. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是鉴定为在抗性品种中以多拷贝存在的31.2kb Rhg1区的Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580、Glyma18g02600或任何部分中的至少一个的基因组拷贝数。
33. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是携带Glyma18g02610和Glyma18g02570之间的重复接合处的基因组DNA段。
34. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是与线虫接触后或接触时Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02600或Glyma18g02580中的至少一个的转录或表达水平。
35. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580或Glyma18g02600中的至少一个或在31.2kb Rhg1重复区内的单核苷酸多态性。
36. 根据权利要求28所述的方法，其中所述遗传标志物是含有Glyma18g02600、Glyma18g02610、Glyma18g02590或Glyma18g02580中的至少一个的基因组区的多于一个拷贝的存在或不存在。
37. 根据权利要求28-36中任一项所述的方法，其中预测步骤包括将第一植物细胞中的标志物与已知抗性或易感性表型的第二植物细胞中的标志物进行比较，其中第二细胞的表型是第一细胞表型的预示。
38. 根据权利要求28-37中任一项所述的方法，其中第二植物细胞是SCN抗性的，其是PI88788或Peking、或携带源自PI88788或Peking或Rhg1介导的SCN抗性的其它来源的Rhg1基因座。
39. 根据权利要求28-38中任一项所述的方法，其中第二植物细胞是SCN易感性的，其是‘Williams 82’、‘Lee 84’、Essex或携带源自‘Williams 82’、‘Lee 84’、Essex或其它品种的Rhg1基因座，其中Rhg1基因座在介导SCN抗性上比PI88788或Peking的Rhg1基因座更加低效。
40. 根据权利要求28-39中任一项所述的方法，其中SCN由rhg1-b控制，其是Race 3SCN、在其Hg型命名中缺少“2”命名的SCN Hg型、或者在其Hg型命名中缺少“1”命名的SCN Hg型。
41. 根据权利要求28-40中任一项所述的方法，其中检测包括扩增所述标志物或所述标志物的部分以产生扩增产物；以及确定所述扩增产物的DNA序列的全部或部分；或使用对限制性内切酶的不同敏感性、等位基因特异性杂交分析、等位基因特异性PCR、高密度核苷酸阵列分析、定量PCR、Northern印迹分析、微卫星分析、ELISA或Western印迹分析来评估所述标志物。
42. 根据权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述预测用于选择抗性植物细胞用于开发抗性大豆品系。
43. 根据权利要求28-41中任一项所述的方法，其中所述预测用于选择抗性植物细胞用于开发抗性糖甜菜、土豆、玉米、豌豆或菜豆。
44. 一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，SEQ ID NO:2、5或6的Glyma18g02590多肽，SEQ ID NO:6的Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有90％或更高同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物、功能变体或组合；以及将所述多肽或含有所述多肽的细胞应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤，其中所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽或Glyma18g02580多肽中的至少两个。
46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽、Glyma18g02590多肽和Glyma18g02580多肽。
47. 根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。”
驳回决定认为：权利要求1与对比文件1（US2011/0083234A1，公开日为2011年04月07日）相比，区别特征在于：权利要求1限定是增加至少两个多核苷酸的表达、改变至少两个多核苷酸的表达模式或增加至少两个多核苷酸的拷贝数，多核苷酸是编码Glyma18g02580、Glyma18g02590或Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:1-3、5-6具有90％或更高同一性的多肽或任何前述多肽的同源物、功能变体或其组合。从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的多核苷酸并确定其氨基酸序列以及其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合，选择其中至少两种、进行转导、功能验证对本领域技术人员来说是易于想到的；而改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，在对比文件1公开内容基础上，通过增加多核苷酸的表达、改变多核苷酸的表达模式或增加多核苷酸的拷贝数来提高表达进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。对比文件1公开了与SCN抗性相关基因，基因包括Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610等；增强抗SCN感染的蛋白的表达的方法和系统；序列（相当于多核苷酸），单独或组合，插入构建体、通过转导引入到大豆植物中；基因构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等；基因构建体可独立与宿主染色体存在，更优选的，基因构建体全部或部分并入宿主染色体；表达载体包括与核苷酸可操作连接的启动子和/或增强子。因此，权利要求17也不具备创造性。基于与权利要求1相似的审查意见，权利要求22也不具备创造性。在对比文件1公开了大豆胞囊线虫抗性渗入至无抗性大豆胚质中具有SCN抗性大豆的与SCN抗性连锁的基因座在标记辅助选择MAS中使用基础上，为便于筛选，以与SCN抗性连锁的基因座是否存在来预测判断植物是否具有SCN抗性对本领域技术人员来说也是易于想到的，而其他的遗传或可选择的标记物，例如，基于易感性和抗性植物之间基于单核苷酸多态性SNP、简单序列重复SSR或微卫星、限制性内切酶识别位点的改变、特定基因或靶序列或其它序列的基因组拷贝数的差异等，也是本领域常用筛选标记物。因此，权利要求28也不具备创造性。将具有线虫抗性的细胞或多肽应用于植物、植物种子、或种子可被种植的土壤以增加植物对线虫抗性也是本领域常规手段，权利要求44也不具备创造性。从属权利要求2-16、18-21、23-27、29-43、45-47或者被对比文件1公开，或为本领域的常规技术手段，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-16、18-21、23-27、29-43、45-47也不具备创造性。
申请人威斯康星校友研究基金会、伊利诺斯州大学管理委员会（下称复审请求人）对上述驳回决定不服,于2018年01月30日向国家知识产权局提出了复审请求，未提交修改的申请文件。复审请求人认为：对比文件1公开了大量位于六个不同染色体上的QTL和4502个序列，没有教导这4502个序列中的哪一个与线虫抗性相关，也没有教导选择两个或更多个特定基因的组合赋予植物细胞抗线虫抗性。生物技术领域的不确定性很高，没有具体的实验数据，结果是无法预期的。如果没有本申请公开的实验数据，本领域技术人员即使经过无数次探索实验也不一定能够得出本发明权利要求1的技术方案，即，通过改变四种特定基因中的至少两种的表达来增加植物对线虫的抗性。在现有技术的基础上通过有限的试验可以得到的发明，是显而易见的。然而，对于需要无数次探索实验才能得到的发明，不应该认为是显而易见的。
经形式审查合格，国家知识产权局于2018年03月02日依法受理了该复审请求，并将其转送至原审查部门进行前置审查。
原审查部门在前置审查意见书中坚持原驳回决定。
随后，国家知识产权局成立合议组对本案进行审理。
合议组于2018年12月27日向复审请求人发出复审通知书，指出：（1）权利要求17的部分并列技术方案请求保护含有编码SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，含有SEQ ID NO:2的Glyma18g02590多肽的多核苷酸构建体，权利要求44部分并列技术方案请求保护通过在细胞中表达编码SEQ ID NO:1的Glyma18g02580多肽，SEQ ID NO:2的Glyma18g02590多肽的多核苷酸来增加植物对线虫抗性的方法，上述权利要求17、44的部分并列技术方案已经被对比文件1公开，不具备专利法第22条第2款规定的新颖性。（2）权利要求1请求保护技术方案与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求1限定的是增加至少两个多核苷酸的表达、改变至少两个多核苷酸的表达模式或增加至少两个多核苷酸的拷贝数，多核苷酸是编码Glyma18g02580、Glyma18g02590或Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:1-3、5-6具有90％或更高同一性的多肽或任何前述多肽的同源物、功能变体或其组合。对比文件1已经公开了多个具有SCN抗性的相关基因，其中就包括如本申请权利要求1所述的Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610。为增强植物对SCN感染的抗性，从对比文件1已公开的SCN抗性相关基因中经常规实验选择出可用于抗SCN感染的基因，如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的多核苷酸并确定其氨基酸序列以及与其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合对于本领域技术人员来说是容易的；而改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，选择其中至少两种共表达也是提高抗性基因表达量的常规方法，在对比文件1公开内容基础上，通过增加至少两个多核苷酸的表达、改变至少两个多核苷酸的表达模式或增加至少两个多核苷酸的拷贝数来提高表达进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。权利要求1不具备专利法第22条第3款规定的创造性。基于与权利要求1相似的审查意见，权利要求17剩余并列技术方案以及权利要求22也不具备创造性。在对比文件1公开了大豆胞囊线虫抗性渗入至无抗性大豆胚质中具有SCN抗性大豆的与SCN抗性连锁的基因座在标记辅助选择MAS中使用基础上，为便于筛选，以与SCN抗性连锁的基因座是否存在来预测判断植物是否具有SCN抗性对本领域技术人员来说也是易于想到的，而其他的遗传或可选择的标记物，例如，基于易感性和抗性植物之间基于单核苷酸多态性SNP、简单序列重复SSR或微卫星、限制性内切酶识别位点的改变、特定基因或靶序列或其它序列的基因组拷贝数的差异等，也是本领域常用筛选标记物。因此，权利要求28也不具备创造性。将具有线虫抗性的细胞或多肽应用于植物、植物种子、或种子可被种植的土壤以增加植物对线虫抗性也是本领域常规手段，权利要求44剩余并列技术方案也不具备创造性。从属权利要求2-16、18-21、23-27、29-43、45-47或者被对比文件1公开，或为本领域的常规技术手段，在其引用的权利要求不具备创造性的基础上，权利要求2-16、18-21、23-27、29-43、45-47也不具备创造性。
复审请求人于2019 年02月11日提交了意见陈述书、权利要求书的全文替换页（共3页，47项）。相对于复审通知书依据的权利要求书而言，所作修改是将原权利要求1、22方法中所使用的多核苷酸由编码Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610多肽的多核苷酸至少2个的模式修改为编码Glyma18g02580、Glyma18g02590和Glyma18g02610多肽的多核苷酸的组合模式，删除原权利要求17、44中SEQ ID NO:1以及SEQ ID NO:2的并列技术方案，进一步限定原权利要求19、45的多核苷酸为编码Glyma18g02590和Glyma18g02610的多肽，限定原权利要求20、46的多核苷酸进一步编码Glyma18g02580多肽。
新提交的权利要求1、17、19、20、22、44-46如下：
“1. 一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括增加以下多核苷酸组合的表达、改变所述以下多核苷酸组合的表达模式或增加所述以下多核苷酸组合的拷贝数，所述多核苷酸组合编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽和与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽、或其同源物、功能变体或组合，其中在植物的细胞中增加的多核苷酸表达增加了所述植物对线虫的抗性。”
“17. 一种构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO:5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。”
“19. 根据权利要求17或18所述的构建体，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽和Glyma18g02590多肽。
20. 根据权利要求17-19中任一项所述的构建体，其中所述多核苷酸进一步编码Glyma18g02580多肽。”
“22. 一种生产对线虫具有增加抗性的转基因植物的方法，所述方法包括将外源多核苷酸引入到大豆植物细胞或其后代，所述外源多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽、和与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽的组合、或其同源物、功能变体或组合，从而在所述大豆植物的根细胞中增加所述多肽的表达，以及从而所述植物与对照植物相比对线虫具有增加的抗性。”
“44. 一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:5或6的Glyma18g02590多肽，SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有90％或更高同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物、功能变体或组合；以及将所述多肽或含有所述多肽的细胞应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤，其中所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述多核苷酸编码Glyma18g02610多肽和Glyma18g02590多肽。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中所述多核苷酸进一步编码Glyma18g02580多肽。”
复审请求人认为：对比文件1公开了大量位于六个不同染色体上的QTL和4502个序列，对比文件1没有提供合理的依据从这4502条序列中选择与线虫抗性相关的序列。尤其是特定序列的组合。本申请说明书的图15中所示，基因Glymalsgo2580、Glymalsg2590、Glymalsg2600和Glyma18g261O的同时过表达显着增加了对SCN敏感的Wiiliams82中SCN的抗性。 此外，图18所示，过量表达Glymalsg02580、Glymalsg02590和Glymalsg02610也显着增加转基因根对SCN的抗性。在对比文件1中并没有公开或暗示这几种基因组合的高表达显著增加对SCN的抗性，构成了本申请意想不到的技术效果。
在上述程序的基础上，合议组认为本案事实已经清楚，可以作出审查决定。
二、决定的理由
审查文本的认定
复审请求人于2019 年02 月11日提交了权利要求书的全文修改替换页（共3页47项）。经审查，所作修改符合专利法第33条和专利法实施细则第61条第1款的规定。本复审请求审查决定依据的审查文本是2015年01月12日提交的说明书附图第1-21页、说明书摘要、摘要附图以及说明书核苷酸和氨基酸序列表第1-36页，2015年02月02日提交的说明书第1-38页（第1-154段），2019年02月11日提交的权利要求第1-47项。
关于创造性
专利法第22条第3款规定，创造性，是指与现有技术相比，该发明具有突出的实质性特点和显著的进步。
在创造性的判断中，判断发明是否具有突出的实质性特点，就是要判断对于本领域的技术人员来说，要求保护的发明相对于现有技术是否显而易见。如果要求保护的发明相对于现有技术是显而易见的，则不具有突出的实质性特点。
权利要求1请求保护“一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括增加以下多核苷酸组合的表达、改变所述以下多核苷酸组合的表达模式或增加所述以下多核苷酸组合的拷贝数，所述多核苷酸组合编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽和与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽、或其同源物、功能变体或组合，其中在植物的细胞中增加的多核苷酸表达增加了所述植物对线虫的抗性。”对比文件1公开了鉴定与大豆植物抗大豆胞囊线虫（SCN）抗性相关的QTLs和基因，使用上述QTLs和基因得到抗大豆胞囊线虫的大豆；QTLs包括rhg1基因座，基因包括Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02560、Glyma18g02610等；增强抗SCN感染的蛋白的表达的方法和系统；序列，单独或组合，插入构建体、通过转导引入到大豆植物中；构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等（参见对比文件1摘要，说明书第5、10-16、18、39-43、76、85段，表1，图1），并具体公开了Glyma18g02580、Glyma18g02590的序列分别为SEQ ID NO：134、88。经比对，对比文件1的SEQ ID NO：134、88与本申请SEQ ID NO：1、2具有100％同一性。可见对比文件1公开了一种增加大豆对线虫抗性的方法。权利要求1请求保护技术方案与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求1限定是增加以下多核苷酸组合的表达、改变所述以下多核苷酸组合的表达模式或增加所述以下多核苷酸组合的拷贝数，所述多核苷酸组合编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽和与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽、或其同源物、功能变体或组合。根据上述区别特征，可以确定权利要求1实际解决的技术问题是选择具体SCN抗性基因用于增强植物对SCN感染的抗性。
对比文件1已经公开了多个具有SCN抗性的相关基因，其中就包括如本申请权利要求1所述的Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610。为增强植物对SCN感染的抗性，从对比文件1已公开的SCN抗性相关基因中经常规实验选择出可用于抗SCN感染的基因，如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的多核苷酸并确定其氨基酸序列以及与其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合对于本领域技术人员来说是容易的；而改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，在对比文件1公开内容基础上，本领域技术人员容易确定Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的SCN抗性的情况下，选择上述2种或3种SCN抗性基因共表达增加SCN抗性基因的表达量进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。由此可见，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求1请求保护的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求1不具有突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求2限定表达通过遗传转化来增加。如上所述，对比文件1公开了增强抗SCN感染的蛋白的表达的方法和系统；序列插入构建体、通过转导引入到大豆植物中；构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等。可见对比文件1公开了表达通过植物的遗传转化来增加。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求2也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求3限定植物种类。如上所述，对比文件1公开了是大豆，将SCN抗性基因用于其他植物上也是本领域技术人员容易想到的。从常规作物中选择糖甜菜、土豆、 玉米、豌豆和菜豆等农作物对本领域技术人员容易的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求3也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求4限定植物根的细胞中增加所述表达。根部与SCN卵接触，收集根部，清洗收集雌性线虫，计算线虫雌性指数来评价植物个体的SCN反应，包括父母代、F2:3、重组自交系等。在此基础上，在植物根的细胞种增加表达是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求4也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求5-7限定增加多肽表达的方式。如上所述，对比文件1公开了序列，单独或组合，插入构建体、将构建体引入大豆植物中；基因构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等；基因构建体可独立与宿主染色体存在，更优选的，基因构建体全部或部分并入宿主染色体；表达载体包括与核苷酸可操作连接的启动子和/或增强子（参见对比文件1说明书第40-43段）。可见对比文件1公开了将构建体引入所述植物的细胞、将转基因并入所述植物中，构建体、转基因包含与编码所述多肽的多核苷酸可操作地连接的启动子。在此基础上，增加固有多核苷酸表达以及植物细胞中引入多个构建体、并入多个转基因对本领域技术人员来说也是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求5-7也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求8-10限定拷贝引入的基因座以及拷贝数。如上所述，对比文件1公开了SCN QTL1位于rhg1，而改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，在对比文件1公开内容基础上，增加拷贝数、拷贝引入植物的Rhg1基因座以达到有效线虫抗性对本领域技术人员来说是易于想到的，而具体的拷贝数是根据线虫抗性效果通过本领域常规实验手段易于选择和确定的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求8-10也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求11、13-15进一步限定方法。对比文件1还公开了检测暴露于线虫卵的植物的线虫雌性指数（参见对比文件1第85-86段）。在此基础上，检测多肽表达、对胞囊线虫或大豆胞囊线虫抗性以及通过植物来测量抗性都是易于想到的，而植物与在类似生长环境中生长的对照植物相比具有更低百分比的发育超过J2阶段的侵入线虫、在根上更低速率的胞囊形成、暴露于线虫的植物减少的线虫雌性指数、胞囊内减少的SCN卵产生、每个植物减少的整体SCN卵产生、以每个植物为基础或每生长面积为基础的大豆种子的更高产量对于本领域技术人员来说也是易于验证的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求11、13-15也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求12限定进一步包括编码Glyma18g02600多肽或与SEQ ID NO：4具有90％以上或更高同一性多肽的多核苷酸。对比文件1还公开了基因包括Glyma18g02600（参见对比文件1说明书第5段，表1）；经比对，对比文件1的SEQ ID NO：125与本申请SEQ ID NO：4具有100％同一性。在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610、Glyma18g02600的多核苷酸并确定其氨基酸序列对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求12也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求16进一步限定方法。选择具有大豆胞囊线虫抗性的其他品种如PI88788、PI437654、Peking的Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610、Glyma18g02600的同源序列对本领域技术人员来说也是易于想到和进行验证的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求16也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求17请求保护一种构建体，其包含与多核苷酸可操作地连接的启动子，所述多核苷酸编码含有SEQ ID NO: 5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。对比文件1公开了鉴定与大豆植物抗大豆胞囊线虫抗性相关的QTLs和基因，使用上述QTLs和基因得到抗大豆胞囊线虫的大豆；与SCN抗性相关基因，基因包括Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610等；增强抗SCN感染的蛋白的表达的方法和系统；序列（相当于多核苷酸），单独或组合，插入构建体、通过转导引入到大豆植物中；基因构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等；基因构建体可独立与宿主染色体存在，更优选的，基因构建体全部或部分并入宿主染色体；表达载体包括与核苷酸可操作连接的启动子和/或增强子（参见对比文件1摘要，说明书第5、10-16、18、39-43、76、85段，表1，图1），并具体公开了Glyma18g02580、Glyma18g02590的序列分别为SEQ ID NO：134、88，SEQ ID NO：134、88与本申请SEQ ID NO：1、2具有100％同一性。权利要求17请求保护技术方案与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求17限定多核苷酸编码含有SEQ ID NO:5或6的Glyma18g02590多肽、含有SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合。基于权利要求1的评述，同时在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的外源多核苷酸并确定其氨基酸序列以及与其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合对于本领域技术人员来说是容易的。在对比文件1公开内容基础上，本领域技术人员经过常规实验容易确定Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的SCN抗性的情况下，选择上述SCN抗性基因中的2种，如编码Glyma18g02590、Glyma18g02610多肽的多核苷酸或3种共表达增加SCN抗性基因的表达量进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，权利要求17、19、20也不具备突出的实质性特点，不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求18限定启动子。在对比文件1公开是序列插入构建体、构建体通过转导引入大豆植物种基础上，选择植物启动子对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求18也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求21进一步限定所述多核苷酸还编码 Glyma18g02600多肽。对比文件1还公开了基因包括Glyma18g02600（参见对比文件1说明书第5段，表1）。在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610、Glyma18g02600的多核苷酸组合，进行转导、功能验证对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求21也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求22请求保护一种生产对线虫具有增加抗性的转基因植物的方法。对比文件1公开生产转基因植物的方法，与宿主植物（相当于对照植物）相比，转基因植物具有对大豆胞囊线虫增加的抗性，方法包括转导至少一种基因至宿主植物，所述至少一种基因（即多核苷酸）位于SCN QTL1-11；SCN QTL1包括Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610等；增强抗SCN感染的蛋白的表达的方法和系统；序列，单独或组合，插入构建体、通过转导引入到大豆植物中；构建体包括编码序列和调控序列，调控序列包括启动子等（参见对比文件1摘要，说明书第5、10-16、18、39-43、76、85段，表1，图1）。对比文件1的SEQ ID NO：134、88与本申请SEQ ID NO：1、2具有100％同一性。权利要求22请求保护技术方案与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求22限定外源多核苷酸引入到大豆植物细胞或其后代，外源多核苷酸编码与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的Glyma18g02580多肽、与SEQ ID NO:2、5或6具有至少90％同一性的Glyma18g02590多肽、和与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的Glyma18g02610多肽的组合、或其同源物、功能变体或组合，是在大豆植物根细胞中增加多肽表达。
在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的外源多核苷酸并确定其氨基酸序列，以及与其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合，并选择上述3种SCN抗性基因进行转导、功能验证对本领域技术人员来说是易于想到的。而大豆胞囊线虫从大豆幼苗根系侵入，在大豆根细胞中增加多肽表达、从而于对照植物相比具有增加抗性是易于想到和实现的。由此可见，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求22请求保护的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求22不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求23-27进一步限定方法。而改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，在对比文件1公开内容基础上，增加拷贝数以达到有效线虫抗性对本领域技术人员来说是易于想到的，而具体的拷贝数是根据线虫抗性效果通过本领域常规实验手段易于选择和确定的。在对比文件1公开了是大豆基础上，为增加其他作物线虫抗性，易于想到糖甜菜、土豆、 玉米、豌豆和菜豆等农作物。对比文件1还公开了基因包括Glyma18g02600（参见对比文件1说明书第5段，表1）。在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610、Glyma18g02600的多核苷酸，进行转导、功能验证对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求23-27也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求28请求保护一种筛选对线虫抗性或易感性的第一植物细胞的方法。对比文件1公开内容参见权利要求1评述（参见对比文件1摘要，说明书第5、10-16、18、39-43、76、85段，表1，图1），还公开了渗入大豆胞囊线虫抗性至无抗性大豆胚质的方法，大豆胞囊线虫抗性渗入至无抗性大豆胚质中，具有SCN抗性大豆的与SCN抗性连锁的基因座（属于与胞囊线虫抗性相关的遗传标志物）在标记辅助选择MAS中使用；生产大豆植物的方法，包括确定标志物基因是否存在（参见对比文件1第15-16段）。权利要求28请求保护技术方案与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求28是筛选对线虫抗性或易感的第一植物细胞，限定通过检测遗传标志物或可选择的标志物、预测对线虫的抗性或易感性。
在对比文件1公开了大豆胞囊线虫抗性渗入至无抗性大豆胚质中具有SCN抗性大豆的与SCN抗性连锁的基因座在标记辅助选择MAS中使用基础上，为便于筛选，以与SCN抗性连锁的基因座是否存在来预测判断植物是否具有SCN抗性对本领域技术人员来说也是易于想到的，而其他的遗传或可选择的标记物，例如，基于易感性和抗性植物之间基于单核苷酸多态性SNP、简单序列重复SSR或微卫星、限制性内切酶识别位点的改变、特定基因或靶序列或其它序列的基因组拷贝数的差异等，也是本领域常用筛选标记物。由此可见，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求28请求保护的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求28不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求29-36限定遗传标志物。遗传或可选择的标记物，例如，基于易感性和抗性植物之间基于单核苷酸多态性SNP、简单序列重复SSR或微卫星、限制性内切酶识别位点的改变、特定基因或靶序列或其它序列的基因组拷贝数的差异等是本领域常用筛选标记物，在此基础上选择Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580中至少一个的启动子、上游区或基因体的甲基化状态，或Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580、Glyma18g02600中至少一个的RNA转录本、转录或蛋白表达水平，或Rhg1区的Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580、Glyma18g02600或任何部分中的至少一个的基因组拷贝数，或携带Glyma18g02610和Glyma18g02570之间的重复接合处的基因组DNA段，或与线虫接触后或接触时Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02600、Glyma18g02580中的至少一个的转录或表达水平，或Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580或Glyma18g02600中的至少一个或在 Rhg1重复区内的单核苷酸多态性，或含有Glyma18g02600、Glyma18g02610、Glyma18g02590、Glyma18g02580中的至少一个的基因组区的多于一个拷贝的存在或不存在作为筛选标志物并检测标志物在根细胞中水平对本领域技术人员来说是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求29-36也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求37-39进一步限定预测步骤以及第二植物细胞。选择已知抗性或易感性表型的第二植物细胞，通过比较第一植物和第二植物的标记物来预测第一植物细胞表型是常规手段，第二植物细胞是SCN抗性或易感性及具体大豆品种或携带该品种/其他来源rhg1基因座对本领域技术人员来说是易于想到和选择的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求37-39也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求40进一步限定SCN。SCN生理小种分类以及由rhg1-b控制是通过本领域常规实验可以确定的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求40也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求41限定检测方法。扩增标志物或标志物的部分以产生扩增产物，以及确定扩增产物的DNA序列的全部或部分，或使用对限制性内切酶的不同敏感性、等位基因特异性杂交分析、等位基因特异性PCR、高密度核苷酸阵列分析、定量PCR、Northern印迹分析、微卫星分析、ELISA或Western印迹分析来评估所述标志物都是本领域常规检测方法，对本领域技术人员来说是易于想到和选择使用的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求41也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求42-43限定方法的用途。对比文件1还公开了与QTLs相关标记可用于获得新的大豆品系（参见对比文件1说明书第10段）。在此基础上，将方法用于开发抗性大豆以及糖甜菜、土豆、 玉米、豌豆和菜豆等农作物对本领域技术人员来说也是易于想到的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求42-43也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
权利要求44请求保护一种增加植物对线虫抗性的方法，所述方法包括在细胞中表达多核苷酸，所述多核苷酸编码SEQ ID NO:5或6的Glyma18g02590多肽，SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6具有90％或更高同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物、功能变体或组合；以及将所述多肽或含有所述多肽的细胞应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤，其中所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。对比文件1公开内容参见权利要求1评述过程，权利要求44与对比文件1公开内容相比，区别特征在于：权利要求44限定在细胞中表达SEQ ID NO:5或6的Glyma18g02590多肽、SEQ ID NO:3的Glyma18g02610多肽、或与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少90％同一性的多肽、或任何前述多肽的同源物或功能部分、或其组合，以及在细胞中表达编码多肽的多核苷酸并将多肽或含有所述多肽的细胞应用到所述植物、植物种子、或种子可被种植的土壤，其中所述应用增加了所述植物对线虫的抗性。
基于权利要求1的评述，同时在对比文件1公开内容基础上，为提供具有大豆胞囊线虫抗性的大豆植物，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的外源多核苷酸并确定其氨基酸序列以及与其具有90％以上同一性的多肽、多肽同源物、功能变体或组合对于本领域技术人员来说是容易的；而将具有线虫抗性的细胞或多肽应用于植物、植物种子、或种子可被种植的土壤以增加植物对线虫抗性也是本领域常规手段。在对比文件1公开内容基础上，本领域技术人员经过常规实验容易确定Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610的SCN抗性的情况下，选择上述SCN抗性基因中的2种，如编码Glyma18g02590、Glyma18g02610多肽的多核苷酸或3种共表达增加SCN抗性基因的表达量进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。由此可见，在对比文件1的基础上结合本领域的常规技术手段得到权利要求44、45、46的技术方案，对本领域技术人员而言是显而易见的，权利要求44、45、46不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
从属权利要求47进一步限定所述多核苷酸还编码Glyma18g02600多肽。对比文件1还公开了基因包括Glyma18g02600（参见对比文件1说明书第5段，表1）。在对比文件1公开内容基础上，从SCN抗性相关基因中选择，例如编码Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610、Glyma18g02600的多核苷酸组合，进行转导、功能验证对本领域技术人员来说是容易的。因此，在其引用权利要求不具备创造性时，权利要求47也不具备专利法第22条第3款规定的创造性。
对复审请求人相关意见的评述
合议组认为：
对比文件1虽然罗列了近4502个序列，但其明确公开了这些基因与SCN抗性相关，还公开了这些基因增强抗SCN感染的表达方法和系统，其中相关抗性基因就包括了本申请具体选择的Glyma18g02580、Glyma18g02590、Glyma18g02610。基于对比文件1的公开，为增强植物对SCN感染的抗性，从对比文件1已公开的SCN抗性相关基因中经常规实验，如基于易感性和抗性植物之间特定基因或靶序列基因组拷贝数或RNA转录本丰度的差异，以及转基因植物与对照植物线虫发育情况等实验选择出某些基因并确定其对SCN的抗性，对于本领域技术人员来说是容易的，该试验方法本身以及试验的难度和强度均属于本领域的常规实验，属于《审查指南》规定的“有限的试验可以得到的”范畴，并不需要付出创造性的劳动。改变多核苷酸的表达、表达模式或拷贝数是影响基因表达量的常规手段，选择其中至少两种共表达也是提高抗性基因表达量的常规方法，通过增加至少两个多核苷酸的表达、改变至少两个多核苷酸的表达模式或增加至少两个多核苷酸的拷贝数来提高表达进而增加植物对线虫的抗性对本领域技术人员来说是易于想到的。对比文件1也公开了将候选基因单独或组合引入已知对SCN敏感的宿主大豆植物中（参见对比文件1说明书第0014段）。在本领域技术人员基于对比文件1公开，能够经过常规技术手段确定Glyma18g02580、Glyma18g02590或Glyma18g02610对SCN抗性的基础上，将其组合提高其表达量进而增加植物对线虫的抗性是本领域技术人员能够预期的。本申请附图15、18所验证达到的相比于对照植物或导入单个SCN抗性基因植物而言增加的对SCN抗性的实验效果是本领域技术人员能够预期的，并未产生预料不到的技术效果。综上，复审请求人意见陈述不具有说服力。
基于以上事实和理由，本案合议组作出如下审查决定。
三、决定
维持国家知识产权局于2017年11月06日对本申请作出的驳回决定。
如对本复审请求审查决定不服，根据专利法第41条第2款的规定，复审请求人可以自收到本决定之日起三个月内向北京知识产权法院起诉。
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